Benzene is chemically stable as it has no substituents which can be biochemically attacked and a well-known toxic contaminant whose anaerobic degradation pathway is still not fully resolved. As only a very few anaerobic benzene-mineralizing pure cultures have been described yet, research was usually done with enrichment cultures dominated by specific organisms capable of benzene degradation under different electron acceptor conditions. Remarkable progress has been made in recent years with regard to the initial mechanism of benzene transformation especially on the putative genes that are involved in anaerobic carboxylation of benzene and the benzoyl-CoA central pathway. Many phylotypes described to be primary benzene degraders in anaerobic enrichment cultures at various electron acceptor conditions belong to the Peptococcaceae. Here, the thesis focused on characterizing the structure and function of anaerobic benzene-mineralizing microbial communities enriched from two hydrocarbon-contaminated sites: hydrocarbon-contaminated sediment from Ogoni in Niger Delta of Nigeria and a benzene-contaminated aquifer in Zeitz (Germany). The Niger Delta is one of the world’s most damaged ecosystem mainly due to hydrocarbon exploration accidents. The natural attenuation potential of Niger Delta subsurface sediment for anaerobic hydrocarbon degradation was investigated using benzene as a model compound under iron-reducing, sulfate-reducing, and methanogenic conditions. Benzene was slowly mineralized under iron-reducing conditions using Fe(III) chelated with nitrilotriacetic acid, or poorly crystalline Fe(III) oxyhydroxides as electron acceptors, analyzed by measurement of 13CO2 produced from added 13C-labelled benzene. The highest mineralization rates were observed in microcosms amended with Fe(III) oxyhydroxides while microcosms amended with Fe(III) nitrilotriacetic acid produced methane. Abundant phylotypes were affiliated to Betaproteobacteriales, Ignavibacteriales, Desulfuromonadales, and Methanosarcinales of the genera Methanosarcina and Methanothrix, illustrating that the enriched benzene mineralizing communities were diverse and may contain more than a single benzene degrader. The study underpins the importance of microbial ecosystem services in contaminant degradation as a sustainable environmental means of mitigating harmful chemicals. Benzene degradation pathways in a benzene-mineralizing, nitrate-reducing enrichment culture from Zeitz was investigated. Benzene mineralization was dependent on the presence of nitrate and correlated to enrichment of a Peptococcaceae phylotype only distantly related to known anaerobic benzene degraders of this family. Its relative abundance decreased after benzene mineralization had terminated, while other abundant taxa - Ignavibacteriaceae, Rhodanobacteraceae and Brocadiaceae - slightly increased. Generally, the microbial community remained diverse despite amendment of benzene as single organic carbon source, suggesting complex trophic interactions between different functional groups. A subunit of the putative anaerobic benzene carboxylase (AbcA) previously detected in Peptococcaceae was identified by metaproteomic analysis suggesting that benzene was activated by carboxylation. Detection of proteins involved in anaerobic ammonium oxidation (Anammox) indicates that benzene mineralization was accompanied by Anammox, facilitated by nitrite accumulation and the presence of ammonium in the growth medium. The results suggest that benzene was activated by carboxylation and further assimilated by a novel Peptococcaceae phylotype and confirm the hypothesis that Peptococcaceae are important anaerobic benzene degraders. Only a few benzene mineralizing anaerobes have been isolated to date. In an attempt using classical isolation techniques to isolate benzene-mineralizing pure cultures from a benzene-mineralizing nitrate-reducing microbial community, two consortia were gained under nitrate-reducing conditions spiked separately with acetate and benzene as sole sources of carbon and energy with media containing ammonium or without ammonium. Both consortia – Bz4 (with ammonium) and Bz7 (without ammonium) - mineralized 13C-labelled acetate under anoxic conditions at 3.3 and 2.7 µM day-1, respectively, revealed by analysis of evolved 13CO2. However, only Bz4 mineralized 13C-labelled benzene (0.298 µM benzene mineralized day-1) generated up to 960.2 ± 0.3 ‰ ẟ13C-CO2 during 184 days while producing only slight amounts of nitrite (4.60 ± 0.004 µM). By 16S rRNA gene amplicon sequencing was determined that the isolated cultures were not pure cultures but still contained several different phylotypes. The gained Bz4 consortium that mineralized benzene under anoxic conditions can be further purified and explored for their metabolic potentials.:Acknowledgments ………………………………………………………................. ii Table of Contents …………………………………………………………………… iii Dissertation Summary ……………………………………………………………… vi Dissertation Zusammenfassung …………………………………………………… viii List of Tables ………………………………………………………………………… x List of Figures ……………………………………………………………………….. xi List of Appendices ………………………………………………………………….. xiii Abbreviations .………………………………………………………….................... xv Chapter 1: Introduction and Research Objectives ……………………………… 1 1.1 Introduction ……………………………………………………………… 2 1.2 Aims and Objectives ………………………………………………….... 4 Chapter 2: Anaerobic Benzene Degradation by Microbial Communities and Pure Cultures …… 6 2.1 Anaerobic benzene degradation – a brief introduction ...…………… 7 2.2 Anaerobic benzene degradation under different electron acceptor conditions … 9 2.2.1 Benzene degradation under methanogenic conditions ……… 9 2.2.2 Benzene degradation under sulfate-reducing conditions …… 14 2.2.3 Benzene degradation under nitrate-reducing conditions …… 20 2.2.4 Benzene degradation under iron-reducing conditions ……… 25 2.3 Anaerobic benzene degradation by pure cultures ………………… 26 2.4 Anaerobic benzene activation mechanisms and associated genes……………… 28 2.4.1 Hydroxylation of benzene …………………………………….… 30 2.4.2 Methylation of benzene ………………………………..………… 34 2.4.3 Carboxylation of benzene ……………………………....………. 34 2.5 Benzoyl-CoA central metabolic pathways ………………………… 37 2.6 Syntrophic interactions in benzene-degrading communities ……… 42 2.7 Prospects for the future ……..……………………………………………… 43 Chapter 3: Anaerobic Benzene Mineralization by Natural Microbial Communities from Niger Delta …………………………………………………………………........... 44 3.1 Introduction …………………………………………………………..... 45 3.2 Materials and Methods ……………………………………………….. 46 3.2.1 Chemicals ………………………………………………………... 46 3.2.2 Site description and sampling procedure ……………………… 47 3.2.3 Setup of enrichment cultures …………………………………… 47 3.2.4 Chemical and microscopic analysis …………………………… 48 3.2.5 Microbial community analysis …………………………………… 49 3.3 Results and Discussion …………………………………………………. 50 3.3.1 Mineralization of benzene at different electron-acceptor conditions …………... 50 3.3.2 Microbial community structure at different electron-acceptor conditions ……... 53 3.4 Conclusion ………………………………………….…………………… 61 Chapter 4: Structure and Functional Capacity of a Benzene-mineralizing, and Nitrate-reducing Microbial Community ……………………………………………......... 62 4.1 Introduction …………………………………………………………..... 63 4.2 Materials and methods ……………………………………………..... 64 4.2.1 Chemicals ………………………………………………………... 64 4.2.2 Microcosm setup and sampling ………………………………… 64 4.2.3 Chemical and physiochemical analyses ……………………… 66 4.2.4 Amplicon and metagenome sequencing ……………………… 67 4.2.5 Protein mass spectrometry ……………………………………. 67 4.2.6 Metaproteome analysis ………………………………………… 68 4.2.7 Cloning and sequencing of putative nitric oxide dismutase (nod) genes ………. 68 4.2.8 Data availability …………………………………………………… 69 4.3 Results …………………………………………………………………………. 70 4.3.1 Benzene mineralization under nitrate-reducing conditions …… 70 4.3.2 Changes in microbial diversity during benzene mineralization . 71 4.3.3 Metaproteome composition ……………………………………… 74 4.3.4 Presence of putative nitric oxide dismutase genes (nod) ……. 76 4.4 Discussion ……………………………………………………………... 76 4.4.1 Putative pathways for nitrate reduction coupled with benzene mineralization … 76 4.4.2 Elucidation of the benzene activation step ……………………… 78 4.4.3 Benzoyl-CoA central pathway ……………………………………. 79 4.4.4 Peptococcacea as putative primary benzene degraders ……… 80 4.4.5 Metabolic function of Anammox bacteria in the community …… 81 Chapter 5: Consortia Dominated by Gammaproteobacteria Isolated from a Denitrifying Benzene-degrading Enrichment Culture and their Capacity to Mineralize Benzene...................... 83 5.1 Introduction ……………………………………………………………… 84 5.2 Materials and methods ………………………………………………… 85 5.2.1 Chemicals ………………………………………………………… 85 5.2.2 Isolation procedure …………………………………………………… 85 5.2.3 Mineralization and nitrite analyses ……………………..……… 86 5.2.4 Genomic DNA extraction and 16S rRNA gene sequencing … 87 5.3 Results …………………………………………………………………. 87 5.4 Discussions …………………………………………………………… 91 Chapter 6: General Conclusions and Outlook …..……………………………… 95 6.1 Conclusions and novelty of the research …………………………… 96 6.2 Ignavibacteriales as benzene degrading consortia under iron-reducing conditions 96 6.3 Insights into benzene activation via carboxylation by Peptococcaceae … 97 6.4 Unraveling growth of Anammox bacteria during benzene mineralization … 98 6.5 Study significance ……………………………………………………… 99 6.6 General outlook ………………………………………………………… 100 References ………………………………………………………………………… 101 Appendices ………………………………………………………………………… 120 Contributions of other Authors …………………………………………………… 160

Es wurden die mikrobiellen Abbauprozesse an einem Standort mit gaswerkstypischer Schadstoffkontamination, v. a. BTEX und PAK, untersucht. Ziel war es, die relevanten mikrobiologischen Abbauprozesse mit gängigen Analysemethoden zu identifizieren und das Natural Attenuation-Potential zu bewerten. Neben einer Betrachtung der Schadstoffe im Feld wurde ein ausführliches hydrogeochemisches und mikrobiologisches Analyseprogramm durchgeführt. Der Schadstoffabbau wurde in Labor-Mikrokosmen unter für den Standort charakteristischen, überwiegend anaeroben Bedingungen untersucht. Methodik und Umfang der Untersuchungsmethoden wurden im Hinblick auf eine Anwendung an weiteren Standorten bewertet. Die Schadstoffausbreitung in der Fahne, die Keimzahluntersuchungen und eine deutliche Redoxzonierung mit einer Sukzession von Methanogenese, Sulfatreduktion und Fe(III)-Reduktion spiegelten mikrobielle Abbauprozesse wider. Dabei beeinflussten und überlagerten die Prozesse im Schadensherd die Prozesse in der Fahne stark. Die Felddaten gaben Hinweise auf abiotische Sekundärreaktionen zwischen den Redoxpaaren Fe(III)/Fe(II), Sulfat/Sulfid und O2/H2O. Die Berechnung der Assimilativen Kapazität (AC) zeigte ein gutes Angebot an CO2 und Sulfat, während die übrigen TEA Sauerstoff, Nitrat und auch Fe(III) am Standort stark limitiert waren. Dem stand eine von den Redoxbedingungen abhängige, unterschiedlich gute Abbaubarkeit der Modellschadstoffe Benzen, Toluen, Ethylbenzen, Naphthalin, Acenaphthen, Phenanthren und Pyren im Laborversuch gegenüber. Methanogenese wurde in keinem der Versuchsansätze beobachtet. Unter sulfatreduzierenden Bedingungen fand ein Abbau weniger Modellschadstoffe (Toluen, z.T. auch Ethylbenzen und Naphthalin) statt. Mit den TEA Nitrat und insb. Fe(III) erweiterte sich das Abbauspektrum gegenüber sulfatreduzierenden Bedingungen. Mit Sauerstoff fand ein Abbau aller im Grundwasser enthaltenen BTEX und PAK statt. Vor dem Hintergrund der AC und den Ergebnissen der Mikrokosmen bedarf es für einen vollständigen Schadstoffabbau im Feld einer Kombination verschiedener TEA-Prozesse, insb. eines Zusammenwirkens von Fe(III)- und Sulfatreduktion und eines Einflusses von Sauerstoff an den Fahnenrändern. Die unterschiedlichen Abbaumuster bzw. Abbaugeschwindigkeiten in Abhängigkeit der TEA machen das Einbeziehen der Redoxzonierung in eine Modellierung des Standortes erforderlich. Neben den TEA hatte die Verfügbarkeit der Makroelemente Phosphor und Stickstoff sowie von Mikroelementen einen Einfluss auf den Abbau. In den Respirometeruntersuchungen mit hohen Substratkonzentrationen war Phosphat in allen und Ammonium in einem Teil der Grundwässer, in Abhängigkeit von der Entnahmestelle im Feld, limitierend. Bei niedrigen Substratkonzentrationen in den Mikrokosmen trat kein Mangel an N und P auf. In allen Fällen hatte aber eine Zugabe von Mikroelementen einen förderlichen Effekt auf den Abbau. Die Methodik der Standortuntersuchungen folgte dem Prinzip der multiple lines of evidence. Die hydrochemischen Parameter O2, NO3-, Fe2+, Mn2+, SO42-, S2-, CH4, NH4+, PO43 waren geeignet, einen mikrobiellen Abbau und potentielle Limitationen durch Nährstoffe zu zeigen. Ein Vergleich der Ergebnisse der tiefenhorizontierten Beprobung mit einem stärker räumlich integrierenden Ansatz zeigte, dass ohne eine entsprechende räumliche Auflösung die AC überschätzt würde. Die Summenparameter, insb. die Toxizität, lieferten wertvolle Zusatzinformationen über die Gesamtkontamination. Der Abbau der (Modell-)Schadstoffe in den Mikrokosmen ermöglichte eine Einschätzung der generellen Abbaubarkeit der Schadstoffe am Standort, der Einflussparameter auf den Schadstoffabbau sowie möglicher Stimulationsmaßnahmen.

Es wurden die mikrobiellen Abbauprozesse an einem Standort mit gaswerkstypischer Schadstoffkontamination, v. a. BTEX und PAK, untersucht. Ziel war es, die relevanten mikrobiologischen Abbauprozesse mit gängigen Analysemethoden zu identifizieren und das Natural Attenuation-Potential zu bewerten. Neben einer Betrachtung der Schadstoffe im Feld wurde ein ausführliches hydrogeochemisches und mikrobiologisches Analyseprogramm durchgeführt. Der Schadstoffabbau wurde in Labor-Mikrokosmen unter für den Standort charakteristischen, überwiegend anaeroben Bedingungen untersucht. Methodik und Umfang der Untersuchungsmethoden wurden im Hinblick auf eine Anwendung an weiteren Standorten bewertet. Die Schadstoffausbreitung in der Fahne, die Keimzahluntersuchungen und eine deutliche Redoxzonierung mit einer Sukzession von Methanogenese, Sulfatreduktion und Fe(III)-Reduktion spiegelten mikrobielle Abbauprozesse wider. Dabei beeinflussten und überlagerten die Prozesse im Schadensherd die Prozesse in der Fahne stark. Die Felddaten gaben Hinweise auf abiotische Sekundärreaktionen zwischen den Redoxpaaren Fe(III)/Fe(II), Sulfat/Sulfid und O2/H2O. Die Berechnung der Assimilativen Kapazität (AC) zeigte ein gutes Angebot an CO2 und Sulfat, während die übrigen TEA Sauerstoff, Nitrat und auch Fe(III) am Standort stark limitiert waren. Dem stand eine von den Redoxbedingungen abhängige, unterschiedlich gute Abbaubarkeit der Modellschadstoffe Benzen, Toluen, Ethylbenzen, Naphthalin, Acenaphthen, Phenanthren und Pyren im Laborversuch gegenüber. Methanogenese wurde in keinem der Versuchsansätze beobachtet. Unter sulfatreduzierenden Bedingungen fand ein Abbau weniger Modellschadstoffe (Toluen, z.T. auch Ethylbenzen und Naphthalin) statt. Mit den TEA Nitrat und insb. Fe(III) erweiterte sich das Abbauspektrum gegenüber sulfatreduzierenden Bedingungen. Mit Sauerstoff fand ein Abbau aller im Grundwasser enthaltenen BTEX und PAK statt. Vor dem Hintergrund der AC und den Ergebnissen der Mikrokosmen bedarf es für einen vollständigen Schadstoffabbau im Feld einer Kombination verschiedener TEA-Prozesse, insb. eines Zusammenwirkens von Fe(III)- und Sulfatreduktion und eines Einflusses von Sauerstoff an den Fahnenrändern. Die unterschiedlichen Abbaumuster bzw. Abbaugeschwindigkeiten in Abhängigkeit der TEA machen das Einbeziehen der Redoxzonierung in eine Modellierung des Standortes erforderlich. Neben den TEA hatte die Verfügbarkeit der Makroelemente Phosphor und Stickstoff sowie von Mikroelementen einen Einfluss auf den Abbau. In den Respirometeruntersuchungen mit hohen Substratkonzentrationen war Phosphat in allen und Ammonium in einem Teil der Grundwässer, in Abhängigkeit von der Entnahmestelle im Feld, limitierend. Bei niedrigen Substratkonzentrationen in den Mikrokosmen trat kein Mangel an N und P auf. In allen Fällen hatte aber eine Zugabe von Mikroelementen einen förderlichen Effekt auf den Abbau. Die Methodik der Standortuntersuchungen folgte dem Prinzip der multiple lines of evidence. Die hydrochemischen Parameter O2, NO3-, Fe2+, Mn2+, SO42-, S2-, CH4, NH4+, PO43 waren geeignet, einen mikrobiellen Abbau und potentielle Limitationen durch Nährstoffe zu zeigen. Ein Vergleich der Ergebnisse der tiefenhorizontierten Beprobung mit einem stärker räumlich integrierenden Ansatz zeigte, dass ohne eine entsprechende räumliche Auflösung die AC überschätzt würde. Die Summenparameter, insb. die Toxizität, lieferten wertvolle Zusatzinformationen über die Gesamtkontamination. Der Abbau der (Modell-)Schadstoffe in den Mikrokosmen ermöglichte eine Einschätzung der generellen Abbaubarkeit der Schadstoffe am Standort, der Einflussparameter auf den Schadstoffabbau sowie möglicher Stimulationsmaßnahmen.

Styrol-Monooxygenasen (SMOs) spielen im bakteriellen Abbau von Styrol eine wichtige Rolle. Sie epoxidieren den Kohlenwasserstoff zu (S)-Styroloxid und waren bis vor kurzem vor allem aus Gram-negativen Vertretern wie Pseudomonaden bekannt. Das Grampositive nocardioforme Bodenbakterium Rhodococcus opacus 1CP kann Styrol als Energie- und Kohlenstoffquelle nutzen und verfügt über zwei Typen von SMOs. Neben StyA2B, einer fusionierten FAD:NADH-Oxidoreduktase (StyB) und Monooxygenase (StyA2) findet sich eine weitere Monooxygenase StyA1, deren Gen direkt stromaufwärts zu styA2B lokalisiert ist. Zusätzlich zum natürlichen Fusionsprotein StyA2B gelang kürzlich die Konstruktion künstlicher Fusionen StyAL1B und StyAL2B aus Pseudomonas fluorescens ST. Um sowohl StyA1/StyA2B als auch die künstlichen Fusionen StyAL1B und StyAL2B für eine biotechnologische Anwendung nutzen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit angestrebt, ihre spezifische Oxygenierungsaktivität (StyA1/StyA2B: 0,24 U/mg) mit Hilfe der error prone PCR zu erhöhen. Um Veränderungen der katalytischen Aktivität in einer großen Zahl von Mutanten schnell zu erkennen, ist ein einfacher Screeningtest erforderlich. Die Fähigkeit von SMOs zur Oxidation von Indol zu blauem Indigo bietet diese Möglichkeit. Allerdings ist hierfür die Expression löslicher Proteine eine wesentliche Voraussetzung. Versuche zur Veränderung der Gene styA2B und styA1A2B mit Hilfe eines kommerziellen error prone PCR Kits lieferten ca. 300 bis 1.200 mutmaßlich veränderte Klone, welche jedoch keinerlei Aktivität für den Indolumsatz zeigten. Als Ursache wurde eine Expression der Proteine in Form inaktiver Inclusion Bodies vermutet. Die Fusionsproteine StyAL1B und StyAL2B bilden lösliches Protein, welche Indol zum blauen Farbstoff Indigo umsetzen. Verschiedene Kultivierungsbedingungen wurden auf den Umsatz von Indol untersucht. Dabei wurde erkannt, dass die Klone sich nicht identisch bezüglich ihrer Proteinlöslichkeit verhalten. Mit Hilfe dieser Ergebnisse wurde ein Test für das Aktivitätsscreening von Styrol-Monooxygenasen auf Platte entwickelt. Die Erhöhung der NaCl-Konzentration im Medium steigerte die Indoloxidation, welche sich jedoch durch zusätzliche physiologisch Faktoren schwer beeinflussen lassen. Auch für die Fusionsproteine erfolgte die Durchführung einer error prone PCR. Der Schritt der error prone PCR stellte kein Problem dar, jedoch die Einbindung des veränderten Genfragmentes in den Vektor, beziehungsweise dessen Transformation in E. coli. Alternative Strategien, wie die Nutzung alternativer DNA Polymerasen und eines konventionellen Konzepts, bei dem veränderte Gene in geschnittene Expressionsvektoren ligiert werden, führte zu keinen detektierbaren Klonen. Die Kultivierung von identischen Klonen auf Festmedium wirkte sich aufgrund nicht näher identifizierter Einflüsse auf das Verhalten bezüglich der Indoloxidation sehr unterschiedlich aus. Um diese Einflüsse zu minimieren, erfolgte die Untersuchung des Systems in einer Flüssigkultur. Im Blickpunkt stand hierbei die Indigoproduktion von E. coli BL21 (pET_StyAL2B) die in Abhängigkeit der optischen Dichte der Kultur untersucht wurde. / Styrene monooxygenases (SMOs) play an important role in the bacterial degradation of styrene. They epoxidize the hydrocarbon highly enantioselective to (S)-styrene oxide. Most of the styrene monooxygenases known so far were identified in Gram-negative microorganisms like pseudomonads. Rhodococcus opacus 1CP, a Gram-positive nocardioform actinobacterium, which uses styrene as energy and carbon source was recently found to possess a novel type of SMO, StyA2B. This protein represents a natural fusion between an FAD:NADH oxidoreductase (StyB) and a single monooxygenase subunit (StyA2) and might act in combination with another single oxygenase StyA1 in strain 1CP. Two artificial analogs to StyA2B, designated StyAL1B and StyAL2B, were recently prepared by a fusion of styA and styB of Pseudomonas fluorescens ST and both showed oxygenating activity. For StyA1/StyA2B as well as the artificial fusion proteins StyAL1B and StyAL2B, it was tried to enhance the specific oxygenation activity in order to support their biotechnological applicability. The method of error prone PCR was used for that purpose. In order to identify favorable modifications with increased catalytic activity from a high number of mutants, an easy and simple screening test is necessary. Therefore, it is reasonable to use the ability of SMOs to oxidize indole to the blue dye indigo. However, the expression of SMOs as soluble proteins is an important requirement for any activity screening. Attempts to modify the genes styA2B and styA1/styA2B by means of a commercial error prone PCR kit yielded 300 to 1,200 potential mutants. Unfortunately, none of the obtained colonies showed any indole-oxidizing activity and the formation of insoluble inclusion bodies was assumed to be a likely explanation. In contrast to StyA2B and StyA1, recombinant expression of the artificial fused SMOs StyAL1B und StyAL2B should yield detectable amounts of active proteins. In fact, cultivation of clones expressing both types of proteins showed a blue coloration. Since the coloration of clones from one single solid medium evolved in a non-uniform manner, cultivation conditions were varied in order to identify factors which promote a more uniform tendency for indole oxidation. Although a high NaCl concentration in the medium was shown to favor indole oxidation, the latter one seems to be influenced by additional physiological factors, hardly to control. For the artificially fused proteins an error prone PCR was carried out, too. Although the initial step of mutagenic PCR was found to be successful, completing the vector system by a second ll-up PCR reaction failed. Alternative strategies like the usage of alternative DNA polymerases as well as a conventional cloning approach of various genes into a digested expression vector did not lead to detectable clones. The cultivation of identical clones on petri dishes provided no uniform tendency for indole oxidation and thus did not allow the reliable comparison of mutants in respect of their specific SMO activities. Cultivation of mutants in liquid medium should lead to more reproducible conditions and for that purpose a method was successfully established to quantify indigo formation and cell density.

Styrol-Monooxygenasen (SMOs) spielen im bakteriellen Abbau von Styrol eine wichtige Rolle. Sie epoxidieren den Kohlenwasserstoff zu (S)-Styroloxid und waren bis vor kurzem vor allem aus Gram-negativen Vertretern wie Pseudomonaden bekannt. Das Grampositive nocardioforme Bodenbakterium Rhodococcus opacus 1CP kann Styrol als Energie- und Kohlenstoffquelle nutzen und verfügt über zwei Typen von SMOs. Neben StyA2B, einer fusionierten FAD:NADH-Oxidoreduktase (StyB) und Monooxygenase (StyA2) findet sich eine weitere Monooxygenase StyA1, deren Gen direkt stromaufwärts zu styA2B lokalisiert ist. Zusätzlich zum natürlichen Fusionsprotein StyA2B gelang kürzlich die Konstruktion künstlicher Fusionen StyAL1B und StyAL2B aus Pseudomonas fluorescens ST. Um sowohl StyA1/StyA2B als auch die künstlichen Fusionen StyAL1B und StyAL2B für eine biotechnologische Anwendung nutzen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit angestrebt, ihre spezifische Oxygenierungsaktivität (StyA1/StyA2B: 0,24 U/mg) mit Hilfe der error prone PCR zu erhöhen. Um Veränderungen der katalytischen Aktivität in einer großen Zahl von Mutanten schnell zu erkennen, ist ein einfacher Screeningtest erforderlich. Die Fähigkeit von SMOs zur Oxidation von Indol zu blauem Indigo bietet diese Möglichkeit. Allerdings ist hierfür die Expression löslicher Proteine eine wesentliche Voraussetzung. Versuche zur Veränderung der Gene styA2B und styA1A2B mit Hilfe eines kommerziellen error prone PCR Kits lieferten ca. 300 bis 1.200 mutmaßlich veränderte Klone, welche jedoch keinerlei Aktivität für den Indolumsatz zeigten. Als Ursache wurde eine Expression der Proteine in Form inaktiver Inclusion Bodies vermutet. Die Fusionsproteine StyAL1B und StyAL2B bilden lösliches Protein, welche Indol zum blauen Farbstoff Indigo umsetzen. Verschiedene Kultivierungsbedingungen wurden auf den Umsatz von Indol untersucht. Dabei wurde erkannt, dass die Klone sich nicht identisch bezüglich ihrer Proteinlöslichkeit verhalten. Mit Hilfe dieser Ergebnisse wurde ein Test für das Aktivitätsscreening von Styrol-Monooxygenasen auf Platte entwickelt. Die Erhöhung der NaCl-Konzentration im Medium steigerte die Indoloxidation, welche sich jedoch durch zusätzliche physiologisch Faktoren schwer beeinflussen lassen. Auch für die Fusionsproteine erfolgte die Durchführung einer error prone PCR. Der Schritt der error prone PCR stellte kein Problem dar, jedoch die Einbindung des veränderten Genfragmentes in den Vektor, beziehungsweise dessen Transformation in E. coli. Alternative Strategien, wie die Nutzung alternativer DNA Polymerasen und eines konventionellen Konzepts, bei dem veränderte Gene in geschnittene Expressionsvektoren ligiert werden, führte zu keinen detektierbaren Klonen. Die Kultivierung von identischen Klonen auf Festmedium wirkte sich aufgrund nicht näher identifizierter Einflüsse auf das Verhalten bezüglich der Indoloxidation sehr unterschiedlich aus. Um diese Einflüsse zu minimieren, erfolgte die Untersuchung des Systems in einer Flüssigkultur. Im Blickpunkt stand hierbei die Indigoproduktion von E. coli BL21 (pET_StyAL2B) die in Abhängigkeit der optischen Dichte der Kultur untersucht wurde.:Eidesstattliche Erklärung II Danksagung III Zusammenfassung IV Abstract VI Abbildungsverzeichnis XI Tabellenverzeichnis XIII Abkürzungsverzeichnis XIV 1 Einleitung 1 1.1 Styrol - ein Produkt der Industrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2 Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2.1 Abbauwege von Styrol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2.2 Struktur, Vorkommen und Eigenschaften klassischer Zweikomponenten Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.2.3 Das neuartige Styrol-Monooxygenase-System StyA1/StyA2B aus Rhodococcus opacus 1CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.2.4 Künstlich verlinkte SMO aus Pseudomonas uorescens ST . . . . . 7 1.2.5 Biotechnologischer Einsatz von Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . 8 1.3 Strategien des Protein-Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3.1 Arbeitsmethoden zur Veränderung von DNA . . . . . . . . . . . . . 9 1.3.2 Error prone PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.4 Arbeitsziele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2 Material und Methoden 13 2.1 Bakterienstämme und Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.2 Kultivierungsmedien und -bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.2.1 Kultivierungsmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.2.2 Kultivierungstemperaturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.3.1 Primer und Primerdesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.3.2 Standard-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.4 Fehlerbehaftete Polymerase-Kettenreaktion (epPCR) . . . . . . . . . . . . 17 2.4.1 Synthese der mutagenen Megaprimer . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.4.2 EZClone Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.4.3 Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.4.4 Modi zierung des Protokolls des EZClone Reaktion Schrittes . . . . 20 2.5 Aufreinigung von PCR-Produkten aus der Lösung . . . . . . . . . . . . . . 20 2.6 TAE-Agarose-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.8 Bestimmung der DNA-Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.9 Restriktionsverdau von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.10 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.11 Herstellung von kompetenten Zellen (E.coli DH5ff, E. coli BL21) . . . . . 23 2.11.1 Chemisch kompetente Zellen nach der CaCl2-Methode (42) . . . . . 23 2.11.2 TOP10 chemischkompetente Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.12 Transformation nach der Hitzeschock-Methode (19) . . . . . . . . . . . . . 24 2.13 Plasmidpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.14 Bestimmung der Indigobildung durch Klone mit mutmaÿlicher SMO-Aktivität 24 2.14.1 Abschätzung der Indigobildung durch Augenschein . . . . . . . . . 25 2.14.2 Quanti zierung der Indigobildung mittels UV/Vis-Spektrophotometrie 25 2.14.3 Quanti zierung der Indigobildung aus Flüssigkulturen . . . . . . . . 26 3 Ergebnisse 27 3.1 Versuche der error prone PCR von StyA2B aus Rhodococcus opacus 1CP . 27 3.1.1 Isolation von Templat-DNA und Durchführung der error prone PCR 28 3.1.2 Screening von Transformanden auf Fähigkeit zur Indol-Oxidation . 29 3.1.3 Herstellung und Aktivitätsscreening von E. coli DH5ff pET_StyA2B 30 3.2 Versuche der error prone PCR von styA1/styA2B aus Rhodococcus opacus 1CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.2.1 Durchführung der error prone PCR und Aktivitätsscreening von StyA1/StyA2B in pBluescript KS(+) . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.2.2 Durchführung des Aktivitätsscreening von StyA1/StyA2B in pET16bP 32 3.3 Fusionsproteine StyAL1B und StyAL2B aus Pseudomonas uorescens ST . 33 3.3.1 Optimierung der Zusammensetzung des LB-Mediums für das Aktivitätsscreenings von pET_StyAL2B in E. coli BL21 nach einer Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.3.2 Ein uss der Belüftung auf die Neigung von E. coli BL21 (pET_StyAL2B) Kolonien zur Oxidation von Indol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.3.3 Bestimmung der Indigobildung mittels UV/Vis-Spektroskopie . . . 40 3.3.4 Zeitliche Entwicklung der Indigokonzentration einer Flüssigkultur von E. coli BL21 (pET_StyAL2B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 3.3.5 Error prone PCR von pET_StyAL2B mit Gene Morph II EZ Clone Kit. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.3.6 Error prone PCR nach der klassischen Methode mit pET_StyAL1B und pET_StyAL2B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4 Diskussion der Ergebnisse 49 4.1 Die error prone PCR als attraktive Methodik zur Optimierung von Styrol- Monooxygenasen hinsichtlich katalytischer Eigenschaften . . . . . . . . . . 49 4.2 Der Aktivitätsnachweis als mutmaÿlich limitierender Schritt in der Modi- zierung von StyA2B und StyA1/StyA2B mit Hilfe der error prone PCR . 51 4.3 Die künstlich fusionierten Styrol-Monooxygenasen StyAL2B und StyAL1B erlauben ein Aktivitätsscreening auf Platte . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.4 Die Entwicklung einer Methodik zur Quanti zierung der spezi schen Indigobildung eines Expressionsklons der Styrol-Monooxygenase StyAL2B . . . 58 4.5 Fehleranalyse zur error prone PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 4.5.1 Fehler in der klassischen error prone PCR für pET_StyAL1B und pET_StyAL2B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 Literaturverzeichnis 65 / Styrene monooxygenases (SMOs) play an important role in the bacterial degradation of styrene. They epoxidize the hydrocarbon highly enantioselective to (S)-styrene oxide. Most of the styrene monooxygenases known so far were identified in Gram-negative microorganisms like pseudomonads. Rhodococcus opacus 1CP, a Gram-positive nocardioform actinobacterium, which uses styrene as energy and carbon source was recently found to possess a novel type of SMO, StyA2B. This protein represents a natural fusion between an FAD:NADH oxidoreductase (StyB) and a single monooxygenase subunit (StyA2) and might act in combination with another single oxygenase StyA1 in strain 1CP. Two artificial analogs to StyA2B, designated StyAL1B and StyAL2B, were recently prepared by a fusion of styA and styB of Pseudomonas fluorescens ST and both showed oxygenating activity. For StyA1/StyA2B as well as the artificial fusion proteins StyAL1B and StyAL2B, it was tried to enhance the specific oxygenation activity in order to support their biotechnological applicability. The method of error prone PCR was used for that purpose. In order to identify favorable modifications with increased catalytic activity from a high number of mutants, an easy and simple screening test is necessary. Therefore, it is reasonable to use the ability of SMOs to oxidize indole to the blue dye indigo. However, the expression of SMOs as soluble proteins is an important requirement for any activity screening. Attempts to modify the genes styA2B and styA1/styA2B by means of a commercial error prone PCR kit yielded 300 to 1,200 potential mutants. Unfortunately, none of the obtained colonies showed any indole-oxidizing activity and the formation of insoluble inclusion bodies was assumed to be a likely explanation. In contrast to StyA2B and StyA1, recombinant expression of the artificial fused SMOs StyAL1B und StyAL2B should yield detectable amounts of active proteins. In fact, cultivation of clones expressing both types of proteins showed a blue coloration. Since the coloration of clones from one single solid medium evolved in a non-uniform manner, cultivation conditions were varied in order to identify factors which promote a more uniform tendency for indole oxidation. Although a high NaCl concentration in the medium was shown to favor indole oxidation, the latter one seems to be influenced by additional physiological factors, hardly to control. For the artificially fused proteins an error prone PCR was carried out, too. Although the initial step of mutagenic PCR was found to be successful, completing the vector system by a second ll-up PCR reaction failed. Alternative strategies like the usage of alternative DNA polymerases as well as a conventional cloning approach of various genes into a digested expression vector did not lead to detectable clones. The cultivation of identical clones on petri dishes provided no uniform tendency for indole oxidation and thus did not allow the reliable comparison of mutants in respect of their specific SMO activities. Cultivation of mutants in liquid medium should lead to more reproducible conditions and for that purpose a method was successfully established to quantify indigo formation and cell density.:Eidesstattliche Erklärung II Danksagung III Zusammenfassung IV Abstract VI Abbildungsverzeichnis XI Tabellenverzeichnis XIII Abkürzungsverzeichnis XIV 1 Einleitung 1 1.1 Styrol - ein Produkt der Industrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2 Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2.1 Abbauwege von Styrol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2.2 Struktur, Vorkommen und Eigenschaften klassischer Zweikomponenten Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.2.3 Das neuartige Styrol-Monooxygenase-System StyA1/StyA2B aus Rhodococcus opacus 1CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.2.4 Künstlich verlinkte SMO aus Pseudomonas uorescens ST . . . . . 7 1.2.5 Biotechnologischer Einsatz von Styrol-Monooxygenasen . . . . . . . 8 1.3 Strategien des Protein-Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3.1 Arbeitsmethoden zur Veränderung von DNA . . . . . . . . . . . . . 9 1.3.2 Error prone PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.4 Arbeitsziele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2 Material und Methoden 13 2.1 Bakterienstämme und Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.2 Kultivierungsmedien und -bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.2.1 Kultivierungsmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.2.2 Kultivierungstemperaturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.3.1 Primer und Primerdesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.3.2 Standard-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.4 Fehlerbehaftete Polymerase-Kettenreaktion (epPCR) . . . . . . . . . . . . 17 2.4.1 Synthese der mutagenen Megaprimer . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.4.2 EZClone Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.4.3 Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.4.4 Modi zierung des Protokolls des EZClone Reaktion Schrittes . . . . 20 2.5 Aufreinigung von PCR-Produkten aus der Lösung . . . . . . . . . . . . . . 20 2.6 TAE-Agarose-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.8 Bestimmung der DNA-Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.9 Restriktionsverdau von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.10 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.11 Herstellung von kompetenten Zellen (E.coli DH5ff, E. coli BL21) . . . . . 23 2.11.1 Chemisch kompetente Zellen nach der CaCl2-Methode (42) . . . . . 23 2.11.2 TOP10 chemischkompetente Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.12 Transformation nach der Hitzeschock-Methode (19) . . . . . . . . . . . . . 24 2.13 Plasmidpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.14 Bestimmung der Indigobildung durch Klone mit mutmaÿlicher SMO-Aktivität 24 2.14.1 Abschätzung der Indigobildung durch Augenschein . . . . . . . . . 25 2.14.2 Quanti zierung der Indigobildung mittels UV/Vis-Spektrophotometrie 25 2.14.3 Quanti zierung der Indigobildung aus Flüssigkulturen . . . . . . . . 26 3 Ergebnisse 27 3.1 Versuche der error prone PCR von StyA2B aus Rhodococcus opacus 1CP . 27 3.1.1 Isolation von Templat-DNA und Durchführung der error prone PCR 28 3.1.2 Screening von Transformanden auf Fähigkeit zur Indol-Oxidation . 29 3.1.3 Herstellung und Aktivitätsscreening von E. coli DH5ff pET_StyA2B 30 3.2 Versuche der error prone PCR von styA1/styA2B aus Rhodococcus opacus 1CP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.2.1 Durchführung der error prone PCR und Aktivitätsscreening von StyA1/StyA2B in pBluescript KS(+) . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.2.2 Durchführung des Aktivitätsscreening von StyA1/StyA2B in pET16bP 32 3.3 Fusionsproteine StyAL1B und StyAL2B aus Pseudomonas uorescens ST . 33 3.3.1 Optimierung der Zusammensetzung des LB-Mediums für das Aktivitätsscreenings von pET_StyAL2B in E. coli BL21 nach einer Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.3.2 Ein uss der Belüftung auf die Neigung von E. coli BL21 (pET_StyAL2B) Kolonien zur Oxidation von Indol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.3.3 Bestimmung der Indigobildung mittels UV/Vis-Spektroskopie . . . 40 3.3.4 Zeitliche Entwicklung der Indigokonzentration einer Flüssigkultur von E. coli BL21 (pET_StyAL2B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 3.3.5 Error prone PCR von pET_StyAL2B mit Gene Morph II EZ Clone Kit. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.3.6 Error prone PCR nach der klassischen Methode mit pET_StyAL1B und pET_StyAL2B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4 Diskussion der Ergebnisse 49 4.1 Die error prone PCR als attraktive Methodik zur Optimierung von Styrol- Monooxygenasen hinsichtlich katalytischer Eigenschaften . . . . . . . . . . 49 4.2 Der Aktivitätsnachweis als mutmaÿlich limitierender Schritt in der Modi- zierung von StyA2B und StyA1/StyA2B mit Hilfe der error prone PCR . 51 4.3 Die künstlich fusionierten Styrol-Monooxygenasen StyAL2B und StyAL1B erlauben ein Aktivitätsscreening auf Platte . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.4 Die Entwicklung einer Methodik zur Quanti zierung der spezi schen Indigobildung eines Expressionsklons der Styrol-Monooxygenase StyAL2B . . . 58 4.5 Fehleranalyse zur error prone PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 4.5.1 Fehler in der klassischen error prone PCR für pET_StyAL1B und pET_StyAL2B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 Literaturverzeichnis 65