Orientador : Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T02:51:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio_ReginaVasconcellos_M.pdf: 6295641 bytes, checksum: 57030e4d4a0b4e6d349e5d83fc9b3d8a (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: Em trabalho anterior,PEREIRA DA SILVA et alii (1984), apresentaram evidências de que lasalocid-A, em concentrações bastante abaixo da necessária para agir como ionóforo de Ca, inibe o efluxo do mesmo em mitocôndrias de fígado. No presente trabalho, estudamos o mecanismo desta inibição em mitocôndrias de fígado e de coração. Primeiramente, observamos que lasalocid-A, na faixa de concentração usada nestes experimentos (0-250 nM), promove a troca eletroneutra de K+ por H+ através da membrana interna mitocondrial e como conseqüência pode causar alterações importantes nos valores de 'delta¿ pH e à'delta¿U (os componentes químico e elétrico do potencial eletroquímico de prótons ('delta¿ 'mu¿ H+). O efeito indireto destas alterações na inibição da liberação de Ca2+ mitocondrial foi descartado pelos nossos experimentos nos quais são mostrados três padrões do efeito de lasalocid-A, dependendo do carregamento de Ca mitocondrial. Em baixo, carregamento de Ca (5-70 nmol de Ca /mg de proteína), sob condições experimentais nas quais a liberação de Ca é supostamente mediada por um antiporter Ca2+ /2H+, os dados cinéticos,indicam que lasalocid-Ainibe o efluxo do cátion por um mecanismo competitivo. A troca Ca /2Na , a via dominante para o efluxo de Ca2+ em mitocôndrias de coração, por lasalocid-A. Em carregamento intermediário de CA2+ . nmol de Ca /mg de proteína), lasalocid-A estimula levemente liberação de Ca2+. Este efeito parece estar relacionado a não foi afetada 2+ de Ca (70-110 a um aumento da permeabilidade da membrana causada pelo deslocamento de uma quantidade determinada de Mg estrutural ligado à membrana. Finalmente, em alto carregamento de Ca (110-140 2+ nmol de Ca rng de proteína ) , lasalocid-A aumentou a habilidade 60 de retenção de Ca2+ pela mitocôndria, mesmo na presença de agentes liberadores de Ca , tais como fosfato e agentes oxidantes de nucleotídeos de piridina mitocondriais. A manutenção de valores altos de potencial de membrana nestas condições, podem sugerir que lasalocid-A é um potente inibidor da abertura de "poros" induzidos na membrana pelo cátion.... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: A previous communication (PEREIRA DA SILVA et alii, 1984) presented evidence that lasalocid-A, at concentrations far below those required to act as Ca2+ ionophore, significantly inhibited Ca2+ efflux from liver mitochondria. In the present work we have studied the mechanism of this inhibition in liver and heart mitocondria. Firstly it was observed that lasalocid-A, in the range of concentration used in these experiments (0-250nM), promotes the electroneutral exchange of K+ for H+ across the inner mitochondrial membrane and as a consequence can cause important alterations in the values for 'delta¿PH and 'delta¿ U (chemical and electrical components, respectively, of the electrochemical membrane potential ('delta¿ UH+). The indirect effect of those alterations in the inhibition of mitochondrial Ca2+ release eas ruled out by our experiments which have shown three patters of lasalocid-A effect, depending on the size of the mitochondrial Ca2+ load. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T14:43:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macedo_DeniseVazde_M.pdf: 7486042 bytes, checksum: 6557fab1aa2a0dd941ebd6645a9172b8 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: Os resultados apresentados neste trabalho indicam que as alterações no fluxo de Ca2+,causadas por oxidantes de nucleotídeos de piridina na presença deste íon, secundárias ao aumento de permeabilidade da membrana mitocondrial interna, são influenciadas por vários fatores, tais como: tração de acetato, pH do meio de reação, mudanças no potencial de membrana e regentes tiólicos. Observamos que este efluxo transiente de Ca2+ que acompanha a oxidação transitória dos nucleotídeos de piridina por t-butil hidroperóxido ou diamida é potencializado pelo aumento da concentração de acetato na faixa de O a 20 mM ou pelo decréscimo do pH de do meio, de 7,4 para 6,8. Os diferentes potenciais de membrana foram obtidos pela energização das mitocôndrias com succinato na presença de ATP ou pela hidrólise de ATP apenas. Além disso, a suspensão mitocondrial foi pré-incubada na presença de Ca2+ antes da energização, isto é, na ausência de alto potencial de membrana ou o potencial de membrana foi colapsado pela adição de antimicina A após o acúmulo do cátion. Todos estes procedimentos mostraram que as mitocôndrias são mais sensíveis aos efeitos deletérios do Ca2+ na presença destes agentes oxidantes em potenciais de membrana mais baixos. Observou-se também que mitocôndrias de cérebro, cuja atividade da enzima fosfolipase A2 dependente de Ca2'+ é menor do que em mitocôndrias hepáticas, são mais sensíveis aos efeitos do Ca2+ na presença destes agentes, sugerindo que esta enzima não deve exercer um papel central neste mecanismo. Por outro lado, os efeitos inibitórios de NEM e DTT, ambos reagentes tiólicos, observados em nossos experimentos, corroboram resultados anteriores de nosso laborat6rio indicando que a liberação transiente de Ca2+(aumento transiente na permeabilidade da membrana) induzido pela oxidação transiente dos nucleotídeos de piridina ocorre em paralelo à transições sulfe to-dissulfeto na membrana mitocondrial / Abstract: Ca2+are influenced by several factors such as: acetate concentration, medium pH,changes in membrane potential and thiol reagents. It was observed that the extension of the reversible Ca2+ efflux-influx cycle that accompanies the transient oxidation of pyridine nucleotides by diamide or t-butyl hidroperoxide is augmented by increasing the acetate concentration from O to 20mM or by decreasing the medium pH from 7.4 to 6.8. The different membrane potentials were obtained by energizing mitochondria with succinate in the presence of ATP or by ATP alone. Moreover, the mitochondria were preincubated in the presence of prior to energization, that is, in the absence of an appreciable membrane potential or the membrane potential collapsed by the addition of Antimycin A after the cation had been accumulated. AlI these procedures have shown that mitochondria are more sensitive to the deleterious effects of Ca2+ plus an oxidant of pyridine nucleotides at lower membrane potentials. In addition it was shown that rat brain mitochondria, whose activity of the Ca2+ estimulated phospholipase A2 is much lower than in liver mitochondria, are more sensi tive to the effects of Ca2+ plus these oxidants indicating that this enzyme may not play a major role in this mechanism. On the other hand, the inhibitory effects of NEM.and D'l'T, both thiol reagents, observed in our experiments strongly supports previous data from this laboratory indicating that the transient Ca2+ release (transient increase in membrane permeability) induced by transent oxidation of pyrid1ne nucleotides is paralleled by membrane sulfhydril ¿ disulfide transitions / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T00:02:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavalheiro_RenataAlves_D.pdf: 7624201 bytes, checksum: 7912ae6e47fcf9bce136c01ea62606bb (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A ação da aminoquinozolina PD153035 sobre a função mitocondrial foi investigada. A adição de diversas concentrações de PD153035 em suspensões mitocondriais hepáticas diminuiu o controle respiratório de maneira dose-dependente, promoveu a inibição do fenômeno de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) sensível a ciclosporina A, aumentaram também a capacidade em reter o Ca2+ e diminuíram a produção de espécies reativas de oxigênio. Nas mesmas condições experimentais, avaliando suspensões mitocondriais cardíacas de animais controles e tratados com PD153035 (32 mg/Kg, v.o.), nenhum efeito significativo foi observado. Comparando mitocôndrias isoladas de animais controles e tratados com PD153035, submetidos à isquemia/reperfusão, observamos que o controle respiratório do animal tratado manteve-se semelhante ao de organelas controles. Observou-se também que mitocôndrias isoladas de corações de ratos tratados aumentaram mais rapidamente de volume em relação ao controle, quando incubadas em solução hiposmótica contendo íons potássio, o que não ocorreu quando o K+ do meio de reação foi substituído por Na+ ou Li+. Efeito semelhante foi observado quando mitocôndrias isoladas de coração de rato foram incubadas in vitro com PD153035 (10 nM). O aumento de volume mitocondrial induzido por PD153035 in vivo e in vitro foi inibido por ATP e 5-hidroxidecanoato (5HD) (antagonistas de canal mitoKATP). Em mitocôndrias isoladas de ratos tratados com PD153035 observou-se um menor potencial de membrana mitocondrial interna formado pela hidrólise de ATP pela FoF1 ATPase. Em adição, fibras musculares cardíacas obtidas de ratos tratados com PD153035 in vivo apresentaram um leve aumento na respiração basal, o que está de acordo com uma maior permeabilidade mitocondrial à K+. Em células cardíacas (miócitos HL-1) submetidas a um tratamento transitório com cianeto de potássio na ausência de glicose e na presença de PD153035 mantiveram a viabilidade celular; o efeito foi abolido pelo 5HD. Estes resultados indicam que a cardioproteção conferida por este composto pode estar relacionada à ativação de canais de potássio mitocondriais (mitoKATP), pois o 5HD reverteu o efeito causado pelo PD153035 no aumento na permeabilidade mitocondrial cardíaca a K+ e na viabilidade observada nas células HL-1 / Abstract: The action of the aminoquinazoline PD153035 on the mitochondrial functions was investigated. The addition of various PD153035 concentrations (5, 10, 20 and 40 µM) to liver mitochondria decreased the mitochondrial respiratory control, induced mitochondrial permeability transition cyclosporin A-sensitive, increased the mitochondrial calcium uptake capacity and reduced mitochondrial reactive oxygen species production. Under this same experimental conditions, no effect was observed in rat heart mitochondria when the rat was treated or not with PD153035 (32 mg/kg v.o.) No effect was also observed in the mitochondrial respiratory control of controls and PD153035-treated animals submitted to ischemia/reperfusion. A rapid rat heart mitochondrial swelling was observed when the mitochondrial suspensions were previously incubated in a hyposmotic solution containing potassium ions while no effect was observed when all K+ of the medium were replaced by sodium or lithium ions. Similar results were observed in isolated rat heart mitochondria incubated in vitro with PD153035 (10 nM). This mitochondrial swelling induced by PD153035 in vivo and in vitro was inhibited by ATP or 5-hydroxydecanoate, both mitoKATP channel antagonists. A smaller rat liver mitochondrial inner membrane potential was observed after PD153035 treatment and this effect was due to ATP hydrolysis by FoF1 ATPase. In addition, cardiac muscle fibers from PD153035-treated rats presented a slight increase in basal respiration supporting the higher mitochondrial K+ permeability. Cardiac cells (HL-1) treated with PD153035 and submitted to a transitory treatment with potassium cyanide in the absence of glucose maintained the cellular viability that was abolished by 5HD. These results suggest that the cardioprotection conferred by the PD153035 probably was related with the mitoKATP activation, since the mitoKATP channel antagonist 5HD inhibited the PD153035 effect on both cardiac mitochondrial K+ permeability and HL-1 cell viability / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Anibal E. Vercesi / Tese (doutorado) - Univesidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T06:18:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kowaltowski_AliciaJuliana_D.pdf: 2775991 bytes, checksum: 21db708c3b5a1313bf8288af419931b2 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A exposição de mitocôndrias a quantidades excessivas de Ca2+ pode levar a uma permeabilização não seletiva da membrana mitocondrial interna, conhecida como transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Estudos indicam que a TPM pode desencadear tanto a morte celular programada (apoptose) quanto acidental (necrose), e é inibida pela proteína antiapoptótica Bcl-2. Além disso, a apoptose e necrose envolvem processos de estresse oxidativo celular. Neste trabalho, integramos essas duas linhas de pesquisa, demonstrando que a permeabilização mitocondrial associada à TPM ocorre secundariamente à oxidação de proteínas de membrana, causada por espécies reativas de oxigênio geradas pela organela na presença de Ca2+. Nossos experimentos comprovam que a TPM pode ser inibida por catalase e peroxidases tiólicas como a tiorredoxina peroxidase e ebselen. Verificarnos também que células hiperexpressam Bcl-2 são resistentes à TPM induzida por estresse oxidativo mitocondrial, mas não pelo óxido de fenil arsina, que se liga diretamente a grupamentos tiólicos de proteínas. Além disso, mitocôndrias que hiperexpressam Bcl-2 tem maior resitência à oxidação de NAD(P)H. Deste modo, demonstramos que a permeabilização mitocondrial associada à TPM é causada por espécies reativas de oxigênio. O Bcl-2, que aumenta o poder redutor celular, previne a TPM por aumentar a capacidade redutora da mitocôndria. / Abstract: Excessive mitochondrial Ca2+ uptake may lead to a non-selective permeabilization of the inner mitocondrial membrane, known as mitocondrial permeability transition (MPT). Recent studies have shown that MPT may act as a trigger for both programmed cell death (apoptosis) or accidental cell death (necrosis), and that this process is inhibited by the anti apoptotic protein Bc1-2. Other studies have shown that both apoptosis and necrosis involve conditions of cellular oxidative' stress. Here, we propose a model for the occurance of MPT which integrates these findings. We demonstrate that mitochondrial permeabilization under conditions ofMPT is secondary to mitochondrial membrane protein thiol oxidation promoted by Ca2+ -stimulated, mitochondrially-generated reactive oxygen species. Thus, MPT is inhibited by catalase and the thiol peroxidases thiorredoxin peroxidase and ebselen. We also verified that mitochondria fIom cells overexpressing the Bc1-2 protein are resistant to MPT induced by mitochondrial oxidative stress, but not phenylarsine oxide, which binds direct1y to mitochondrial membrane protein thiol groups. In addition, Bc1-2 overexpressing cells are resistant to mitochondrial NAD(P)H oxidation. Taken together, our results show that non-selective mitochondrial permeabilization associated to MPT is caused by mitochondrially-generated reactive oxygen species. Bc1-2, which increases the cellular reductive capacity, prevents MPT by incrementing mitochondrial reducing power. / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Meste em Ciencias Médicas

Orientador : Anibal E. Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T17:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Narezzi_GrazielaMilani_D.pdf: 5190422 bytes, checksum: 172ee49c93a92ab85e2c93d490e34e8a (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Nesta Tese, estudamos o transporte de Ca2+ em esferoblastos permeabilizados de Candida parapsilosis preparados por uma nova técnica utilizando-se a enzima liticase. Caracterizou-se um mecanismo de captação de Ca2+ intracelular não mitocondrial, insensível ao ortovanadato porém sensível ao inibidor de V-H+-ATPase bafilomicina A1, nigericina e FCCP. A acidificação deste compartimento, no qual o Ca2+ é acumulado, foi acompanhada utilizando-se o corante fluorescente alaranjado de acridina. A acidificação interna foi estimulada pelo quelante de Ca2+ EGTA e inibida por Ca2+. Esses resultados adicionados ao fato de que o Ca2+ induz a alcalinização deste compartimento sugerem fortemente a presença de um antiporter Ca2+/nH+ na membrana deste compartimento ácido. Uma outra observação interessante foi o fato de que, assim como nos tripanossomatídeos, o composto antioxidante BHT inibe a V-H+-ATPase. Além disso, o agente antifúngico cetoconazol promoveu uma rápida alcalinização desse compartimento ácido de maneira dose-dependente e na mesma faixa de concentração encontrada no plasma sangüíneo de pacientes tratados com essa droga. Uma proteína desacopladora (UCP) foi identificada em mitocôndrias de C. parapsilosis (CpUCP), uma levedura não-fermentativa. A atividade da CpUCP, investigada em mitocôndrias livre de ácidos graxos, foi estimulada por ácido linoléico (LA) e inibida por GTP. A atividade da CpUCP, após a adição de LA, foi verificada pelo aumento da respiração em estado 4, devido ao decréscimo no DY e à diminuição da razão ADP/O dissipando assim, a energia da oxidação fosforilativa. Essa dependência de voltagem do fluxo de elétrons indica que o LA teve um efeito puramente protonofórico. A descoberta da CpUCP demonstra que as proteínas tipo UCP ocorrem em pelo menos quatro reinos eucarióticos: animal, vegetal, fungos e protista. s mitocôndrias de C. parapsilosis possuem uma oxidase alternativa (AOX) constitutiva, além da cadeia respiratória clássica (CRC) e da cadeia respiratória paralela (PAR), ambas terminado em citocromo c oxidases diferentes. A AOX da C. parapsilosis foi identificada imunologicamente e verificou-se que a mesma apresenta uma regulação tipo-fúngica na qual o GMP age como estimulador e o LA como inibidor. A análise da inibição da respiração, através da determinação da razão ADP/O e da respiração em estado 3, demonstraram que (i) o oxigênio pode ser reduzido pelas três oxidases terminais através das quatro vias respiratórias, implicando em uma interligação entre CRC e PAR, (ii) a somatória das capacidades da CRC, AOX e PAR é maior do que a respiração total (sem aditividade) e seu aumento pode ser progressivo dependendo do estado redox da ubiquinona, primeiro via dos citocromos, depois AOX e finalmente PAR. Através dessas evidências, foi proposto nesta tese um novo modelo para a cadeia respiratória de C. parapsilosis / Abstract: In this thesis, we studied Ca2+ transport in permeabilized Candida parapsilosis spheroblasts prepared by a new technique using lyticase. An intracellular non-mitochondrial Ca2+-uptake pathway, insensitive to orthovanadate and sensitive to the V-H+-ATPase inhibitor bafilomycin A1, nigericin and FCCP was characterized. Acidification of this Ca2+ compartment was followed using the fluorescent dye acridine orange. Acidification was stimtlated by the Ca2+ chelator EGTA and inhibited by Ca2+. These results, when added to the observation that Ca2+ induces alkalization of a cellular compartment, provided evidence for the presence of a Ca2+/nH+ antiporter in the acidic compartment membrane. Interestingly, like in the acidocalcisomes of trypanosomatids, the antioxidant BHT inhibits the V-H+-ATPase. In addition, the antifungal agent ketoconazole promoted a fast alkalization of this acidic compartment. Ketoconazole effects were dose-dependent and occurred in a concentration range close to that attained in the blood plasma of patients treated with this drug. An uncoupling protein (UCP) was identified in mitochondria from C. parapsilosis (CpUCP), a non- fermentative parasitic yeast. Activity of CpUCP, investigated in mitochondria depleted of free fatty acids, was stimulated by linoleic acid (LA) and inhibited by GTP. Activity of CpUCP enhanced state 4 respiration by decreasing YDand lowered the ADP/O ratio. Thus, it was able to divert energy from oxidative phosphorylation. The voltage dependence of electron flux indicated that LA had a pure protonophoretic effect. The discovery of CpUCP proves that UCP-like proteins occur in four eukaryotic kingdoms: animals, plants, fungi and protists. We have also demonstrated that mitochondria of C. parapsilosis contain a constitutive ubiquinol alternative oxidase (AOX) in addition to a classical respiratory chain (CRC) and a parallel respiratory chain (PAR) both terminating by two different cytochrome c oxidases. The C. parapsilosis AOX is characterized by a fungi-type regulation by GMP (as a stimulator) and linoleic acid (as an inhibitor). Inhibitor screening of the respiratory network by the ADP/O ratio and state 3 respiration determinations showed that (i) oxygen can be reduced by the three terminal oxidases through four paths implying one bypass between CRC and PAR, (ii) the sum of CRC, AOX and PAR capacities is higher than the overall respiration (no additivity) and that their engagement could be progressive according to the redox state of ubiquinone, i.e. first cytochrome pathway, then AOX and finally PAR / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador : Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T11:15:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leite_HelenaMariaFerreira_M.pdf: 5073478 bytes, checksum: f45ba206a5e644c432eb6057171da955 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: Estudos recentes deste laboratório indicaram que o baixo grau de acoplamento entre a respiração e a fosforiIação oxidativa em mitocôndrias isoladas de tubérculos de batata parece estar relacionado à existência de uma proteína de aproximadamente 35 KDa presente na membrana interna destas mitocôndrias, com a propriedade de transportar H+ por um mecanismo sensível a nucleotídeos de purina. No presente trabalho, obtivemos mitocôndrias de batata com controle respiratório mais elevado que em estudos anteriores, graças à modificações introduzidas no procedimento de isolamento. Ainda assim, a velocidade de respiração destas mitocôndrias, no estado IV, foi reduzida pela adição de ATP e ADP, mesmo na presença de carboxiatractilato (CAT). Experimentos de ligação de nucleotídeos de purina mostraram que estas mitocôndrias apresentaram a habilidade de ligar 1,3 nmol ATP.mg proteína; 1,1 nmol -1 . ¿1 ADP. mg proteína; 0,7 nmol GTP. mg ¿1 proteína. Experimentos de competição mostraram ainda: a maior afinidade de ligação destas mitocôndrias por nucleotídeos de adenina. A construção de um potencial de membrana mais elevado por mitocôndrias de batata e de cole6ptiles de milho é dependente da presença de BSA e nucleotídeos de purina. A presença destes não afeta o potencial construído por mitocôndrias de feijão, beterraba e fígado de rato. Anticorpos contra esta proteína de 35KDa isolada de mitocôndrias de batata foram obtidos e utilizando a técnica de Western Blotting foi verificado que as outras mitocôndrias vegetais em estudo neste laboratórIo como as de coleóptiles 'de milho, feijão e beterraba possuem esta proteína ou similar como mostrado pela reação cruzada com estes anticorpos. Contrariamente, uma série de mitocôndrias não vegetaIs, taIs como as de fígado de rato, coração bovino e T.cruzi epimastigotas não mostraram reação com estes anticorpos. Experimentos de reconstituição desta proteína isolada de batata e da UCP isolada de tecido adiposo marrom foram realizados e demonstraram que, no sistema por nós utilizado, elas apresentam comportamento similar, isto é, nas vesículas com proteína incorporada, a velocidade de efluxo de H + foi maior que em vesículas controle, preparadas na ausência de proteína / Abstract: Early studles from thls laboratory have lndicated that the low degree of coupling between respiration and oxidative phosphorylation in potato mitochondria seems to be related to a 35 KDa protein, present in the inner membrane of those mitochondria, with the ability to translocate H with a: mechanism sensitive to purine nucleotides. In this work, we obtained potato mitochondria with better respiratory control, thanks to modificatlons made in the isolation procedure. In spite of the lsolation method, the respiration rate of these mitochondria ln state IV decreased after additltion of ADP or ATP nucleotides ln the presence of carboxyatractylate (CAT). Binding experiments showed that the mitochondria have the ability to bind 1,3 nmol ATP.mg ¿1 protein 1,1 nmol ADP. Mg ¿1 protein; 0,7 nmol GTP. Mg -1proteln. Competition experiments showed the largest affinity of binding of these mltochondria towards adenlne nucleotides. The increase of potato and corn mitochondria membrane potential is dependent on the presence of BSA and purine nucleotides. The presence of BSA and nucleotides dld not affect the membrane potential of red beet roots (Beta vulgaris); bean (Phaseolus vulgaris) and rat liver mltochondria. Antibodies against a 35 KDa protein isolated from potato mitochondria were obtained and, using the Western blotting techique, we verified that the other plant mitochondria in studies in this laboratory, such as corn, red beet roots and bean, have this or a similar protein as shown by cross reactivity wlth these antibodies. In contrast a series of non-plant mitochondria, also studied in thls laboratory, such as those from rat liver, beef heart and T. cruzi epimastigotes did not show cross reactivity with these antibodies. Reconstitution experiments of this protéln and of UCP isolated from brown adipose tissue were performed and showed that, in the system used, they have similar behavior. In the vesicles with protein incorporated, the rate of H+ efflux was larger than in control vesicles, prepared without either protein / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Orlando Castro e Silva Jr / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-22T08:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Boin_IlkadeFatimaSantanaFerreira_D.pdf: 5318814 bytes, checksum: 09b8a0af2111ac76048a59d3e9a21701 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A oc1usão vascular temporária do fluxo hepático é um dos procedimentos essenciais na cirurgia hepática. A reperfusão do tecido hepático isquêmico está associada à distúrbios circulatórios sistêmicos e aumento da permeabilidade vascular, edema, desarranjo estrutural hepatocelular, podendo, na dependência do tempo de isquemia ocorrer morte celular. Isto acontece devido à geração de mediadores inflamatórios como o fator de ativação plaquetária (PAF). O objetivo deste trabalho foi verificar a efetividade do WEB 2086, .como protetor das lesões oriundas da liberação do P AF, após 60 e 90 minutos de isquemia hepática seletiva normotérmica e 60 minutos de reperfusão. F oram usados 192 ratos Wistar para estudo da avaliação bioquímica sérica pelas dosagens de AST, ALT e DHLs Avaliou-se a função mitocondrial (consumo de O2 nos estados lU e IV da respiração mitocondrial e a relação E UI/E IV = razão de controle respiratório (RCR), a lipoperoxidação do conteúdo hepático (glutationa e malondialdeído) e realizou-se a análise histológica das biópsias hepáticas. Outros 48 ratos foram usados para avaliação hemo dinâmica. Os animais foram submetidos à isquemia hepática seletiva normotérmica por pinçamento do pedículo vascular dos lobos mediano e lateral esquerdo. Os animais foram distribuídos em dois grupos. Os animais do, grupo A receberam soro fisiológico cinco minutos antes da isquemia e os do grupo B" receberam WEB 2086 (10 mg/kg peso corpóreo). Os animais dos subgrupos isquêmicos de 60 minutos foram A2 e B2 e seus subgrupos controle foram AI e B 1. Os dos subgrupos isquêmicos de 90 minutos foram A4 e B4 e seus subgrupos controle foram A3 e B3. O estudo foi realizado no início do experimento (C), pré-reperfusão (RO), após 15 (RI5) minutos e 60 (R60) minutos da reperfusão. Observou-se que as dosagens das enzimas AST, ALT e DHLs foram elevadas após a reperfusão em todos os subgrupos isquêmicos. Os valores do E lU foram maiores no subgrupo isquêmico B2 em relação ao subgrupo A2 (RI5) e no E IV esta diferença foi observada aos 15 e 60 minutos da reperfusão. A RCR dos subgrupos isquêmicos A2 e A4 foi menor do que a de seus subgrupos controle (RO). Os valores de malondialdeído (MDA) do subgrupo isquêmico A4 foi maior após 15 minutos de reperfusão do que no período isquêmico. Os valores da glutationa (GSH) do subgrupo isquêmico B4 foi maior que a do subgrupo A4 (R15). O grau de congestão hepática foi maior nos subgrupos isquêmicos em relação aos subgrupos controle após o início da reperfusão. O gFau da vacuolização citoplasmática dos subgrupo B4 e B2 foi maior que a dos subgrupos A4 (RO) e Bl(R15).Os valores da pressão arterial média do subgrupo A4 foram menores que a dos subgrupos B4 e A3 aos 15 minutos de reperfusão. Os valores da pressão venosa central do subgrupo B4 foram maiores que os do subgrupo A4. Concluiu-se que a droga WEB 2086 inibiu o efeito hipotensor do fator de ativação plaquetária (P AF) e a lipoperoxidação do conteúdo mitocondrial ocorridos nos animais submetidos a 90 minutos de isquemia e 15 minutos de reperfusão / Abstract: Temporary hepatic inflow occlusion is one of the essential procedures during liver surgery and liver transplantation. Reperfusion of ischemic tissues is associated with a variety of microvascular changes, including endothelial cell swelling, increased vascular permeability and other alterations in the liver function tests. The platelet-activating factor (P AF) is an endogenous lipid-mediator that catalyses various inflammatory processes. It has been shown to be involved in tissue injury after ischemia/reperfusion, when ftee radicals were released. The aim of this study was to verify, in Wistar rats, the effectiveness of WEB 2086 (P AF antagonist), on preventing the alterations caused by warm partial liver ischemia by clamping the hilar area of the left lateral and medial hepatic lobes during 60 and 90 minutes followed by zero, lS and 60 minutes of reperfusion. The study was conducted on 192 male Wistar rats which were divided into two groups. Group A used saline solution and group B used WEB 2086 (10 mg/Kg body weight) tive minutes before clamping. No intestinal congestion occurred with this maneuver. The control gioups which were submitted to 60 minutes ofliver ischemia, were AI and Bl, and the control groups which were submitted to 90 minutes were A3 and B3. The ischemic groups of 60 minutes were A2 and B2 and the ischemic groups of 90 minutes ' were A4 and B4. Before and after the ischemia (C and RO) and IS and 60 minutes after the reperfusion (RIS and R60), the plasma AST, ALT, DHLs, and liver mitochondrial function (m state, IV state and the ratio IIIIIV=RCR), liver reduced glutathione and (GSH) and alondialdehyde (MDA) and histology analyses were performed. Another 48 animals were submitted to the same procedure and in these rats hemodynamic alterations (medial arterial pressureIMAP and central venous pressure/CVP) were studied. AST, ALT and DHLs, were markedly increased after reperfusion in ali the animals.State lU values were more elevated in group B2 than A2 (RIS). The same difference occured in IV state (RIS and R60). The group A2 and A4 showed reduced RCR in comparison to the non-ischemic controls. MDA levels were not different between alI the groups, but the GSH levels were seen to be elevated in the group B4 vs A4 after reperfusion (RIS). The same results were observed in MAP. CVP levels were increased in group B4 Vs A4. All groups showed light cell necrosis, cell congestion, reduced neutrophils: and vacuolization of the midzonal areas of the lobules main1y after reperfusion. In conc1usion, after 90 minutes of warm ischaemia, WEB 2086 increased GSH levels after reperfusion and medial arterial pressure after 15 minutes of reperfusion. This suggests that warm ischaemia injury is related to the generation of P AF and WEB 2086 was most effective in inhibiting hypotension and lipid peroxid in this oxidative stress / Doutorado / Doutor em Cirurgia

Orientador: Denise Vaz de Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T04:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 El-Khatib_Soraya_M.pdf: 6333671 bytes, checksum: 5c4191d777bf9617a7ca7cd1502b61c7 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A natureza do Poro de Transição de Permeabilidade (PIP) existente em mitocôndrias isoladas tem sido estudada desde a década de 70 até os dias de hoje por diversos autores, sem ainda haver um concenso a respeito de sua composição molecular. Vários trabalhos formularam a hipótese de que o carreador ADP/ATP (AAC) poderia fazer parte da estrutura do PTP. Outros, mostraram que a abertura do PTP poderia ocorrer em situações de isquemia/reperfusão. Porém, na literatura, ainda não foi excluída a possibilidade de estar se estudando um artefato, pois estes trabalhos sempre se basearam no efeito de concentrações suprafisiológicas de Ca2+ (acima de 10 µM) ou seja, concentrações muito distantes das que poderiam ocorrer 'in vivo¿. Neste trabalho, procuramos verificar a ocorrência de abertura do PTP na presença de concentrações fisiopatológicas de Ca2+ (0-500 nM) em condições que simulassem 'in vitro' as conseqüências de um processo de isquemia/reperfusão para as mitocôndrias. Ainda nestas condições, tentamos verificar o envolvimento do AAC na formação do PTP. Para tanto, variamos diferentes parâmetros dos ensaios como: [Ca2+], tempo de pré-incubação na presença do íon e temperatura do meio de reação. A caracterização da abertura do PTP, sensível a ciclosporina A (CsA), foi feita através da medida da velocidade de consumo de O2 nos estados respiratórios 3 e 4 (V3 e V4 respectivamente) e controle respiratório (CR); formação de potencial elétrico de membrana (??), através da captação do cátion lipofílico TPP+ e inchamento mitocondrial. Para verificar como a abertura do PTP, nestas condições experimentais, influenciava a atividade do AAC realizamos uma titulação com CAT (carboxiatractilato) e extração e dosagem de nucleotídeos de adenina. Os resultados mostraram que nossas condições experimentais de baixas concentrações de Ca2+, foram suficientes para induzir abertura do PTP. Aparentemente a ação do Ca2+ é potencializada pelo aumento do período de pré-incubação das organelas com o íon, onde observamos uma diminuição em V3 e ligeiro estímulo em V4, levando à queda no CR; aumento na permeabilidade da membrana a H+ e inchamento mitocondrial de baixa amplitude. Embora muitos trabalhos na literatura tenham mostrado algumas destas interrelações, a originalidade do nosso trabalho está em mostrar, pela primeira vez, a ocorrência da abertura do PTP em condições fisiopatológicas. A diminuição em V3 sugere que nestas condições ocorreu uma inibição na atividade do AAC. Esta inibição poderia ocorrer ou devida a uma diminuição no conteúdo de AAC ativos, que poderia estar se mobilizando para fazer parte da estrutura do poro, ou devida à perda de nucleotídeos de adenina endógenos com a abertura do poro, essenciais para troca obrigatória que o carreador catalisa. Nossos dados mostraram que o período de pré-incubação com concentrações fisiopatológicas de Ca2+, foi suficiente para induzir despolarização da membrana e perda de nucleotídeos de adenina do interior das organelas, sugerindo um envolvimento do AAC com a abertura do PTP nos seus estágios iniciais / Abstract: Although the mitochondrial permeability transition pore (PTP) has been studied since the late 70s, there is no precise knuoledge about its molecular structure. Ischemia and reperfusion process has been pointed as one of the conditions that might trigger the PTP opening and some authors suggest that the ADP/ATP carrier (AAC) is one of the proteins involved in the pore structure. This process is Ca2+- dependent and, due to the high Ca2+ concentrations (above 10 µM) used throughout the literature, the possibility of the PTP be na artifact and not occur 'in vivo', under physiological conditions, could not be excluded. Here we have studied the occurrence of the PTP in the presence of Ca2+ concentration (0-500 nM), under conditions where na ischemia/reperfusion process was simulated and the involviment of the AAC was analysed. The mitochondria were incubated at Ca2+ concentrations, preincubation times in the presence of Ca2+ and at different temperatures. The CsA-sensitive PTP opening was studied through the determination of O2 consumption under respiratory States 3 and 4 (V3 and V4 respectively) and of the respiratory control (RC= v3/v4); through the generation of membrane electrical potential (??), using the uptake of the lipophilic cation TPP+ and also trough the mitochondrial swelling. Under the same conditions the involvement of the AAC was analysed by a titration with carboxyatractilate (CAT) and extration followed by the determination of adenine nucleotide release. Our results showed that these experimental concentrations were enough to open the PTP. It seems that the Ca2+ effect is potencialized by na increase on the mitochondria preincubation time in the presence of the ion, without addition of exogenous respiratory substrates. A decrease in V3 and a slight increase in V4 was observed, leading to a decrease in RC. There was also an increased permeability to H+ and a small amplitude mitochondrial swelling. Although most of these effects have already been reported in the literature, the originality of ours results is to show, for the first time, the PTP occurrence under phisiopathological Ca2+ concentrations. The observed decrease in V3 suggests a possible inhinition of the AAC activity. This could be explained either through a decrease of active carriers beeing mobilized to form PTP or due to endogenous adenine nucleotides loss, which are needed to the exchange the carrier catalyses. Our data show that preincubation under physiopathological concentrations was sufficient to induce a membrane despolarization and loss of internal adenine nucleotides, suggesting the involviment of the AAC at the very beginning of PTP generation / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores : Lucia Pereira da Silva, Denise Vaz de Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T15:07:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Molnar_AgnesMargareth_M.pdf: 4798652 bytes, checksum: 67ad1ea63c1a6563c6eed7cd225d2319 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O BN-Page ("Blue Native Polyacrylamide gel electrophoresis") é uma técnica desenvolvida para análise de proteínas de membrana. Associada à coloração histoquímica, essa técnica permite análise e caracterização dos complexos enzimáticos da cadeia de transporte de elétrons. A grande vantagem dessa técnica é a utilização de uma pequena quantidade de tecido (30mg) permitindo análise das atividades das enzimas acima especificadas, sem a necessidade do isolamento de mitocôndrias. Dessa forma, esse método pode ser utilizado no estudo de diversas alterações que podem ser induzidas por condições especiais, dentre as quais: o exercício físico, a DPOC e doenças que afetam a função mitocondrial (Parkinson, Alzheimer etc). O objetivo desse trabalho foi a padronização da técnica de BN-Page associada à coloração histoquímica específica dos complexos I e IV da cadeia de transporte de elétrons em músculo esquelético de rato. Os músculos utilizados foram o sóleo, o gastrocnêmio (porção vermelha e branca) e o semitendinoso. A atividade das enzimas foi medida através de densitometria óptica usando a banda referente ao complexo V isolado por eletroforese e corado com Coomassie Blue como padrão interno. Nossos resultados indicaram uma boa resolução dos géis e uma correlação ótima entre a atividade da enzima citrato sintas e (conhecida como marcador de quantidade de mitocôndria) e a área/intensidade da banda referente ao complexo V, indicando que essa também pode ser utilizada como marcador de conteúdo mitocondrial. A atividade do complexo I e IV dos músculos mais oxidativos (sóleo e gastrocnêmio vermelho) apresentou uma variação bem pequena e uma correlação linear com a área do complexo V. Já nos músculos mais glicolíticos houve maior variação na atividade de ambos complexos e sua correlação com o complexo V foi menor / Abstract: BN-PAGE (Blue Native Polyacrylamide gel electrophoresis) is a technique developed for the analysis of membrane proteins. This technique added to the histochemical staining enables the analysis and characterization of the activity of the enzymatic complexes of the mitochondrial electron transport chain. A key advantage of this technique is the small quantity of tissue required (30 mg) for homogenate extraction, allowing the use of this analysis for tissues from different species, inc1uding humano This method can be used for protein defects characterization in mitochondrial myopaties such as Leber's disease, Parkinson and A1zheimer diseases among other pathologies such as COPD (chronic obstructive pulmonary disease) and biochemical adaptations induced by physical exercise. The aim of this work was the standardization of this technique using histochemical staining for Complexes I and N of the eletron-transport chain in four rat skeletal musdes (soleus, red and white gastrocnemius and semitendinosus). The enzyme activity was measured by optical density (Image master lD - Pharmacia Biotech) using the Blue stained complex V area obtained from BN-Page as an internal standard. Its good resolution and the good correlation between its areajintensity and citrate synthase activity indicates that complex V is a good quantitative marker of mithocondrial contento The activity of complex I and N of oxidative musc1es (soleus and red gastrocnemius) presented a narrow range of values and a dose linear correlation wtih complex V. On the other hand, the glycolytic musdes (white gastrocnemius and semitendinosus) presented a wide range in their enzyme activity of both complexes and had a little correlation / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T06:31:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Junqueira_AnaCarolinaMartins_M.pdf: 12941577 bytes, checksum: 3d6f13df3b05138d41e328ffb7129a0f (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado