Epilepsia é uma desordem neurológica que afeta o sistema nervoso central, predispondo o paciente a crises recorrentes, as quais apresentam uma alta demanda energética cerebral, e que culminam na depleção dos níveis de glicose cerebrais conforme a crise epiléptica progride de aguda (até 5 min) à prolongada (de 5 min até algumas horas). A presente tese mapeou os diferentes modelos de crises e síndromes epilépticas com enfoque em peixe-zebra, no intuito de selecionar o melhor modelo em nosso universo experimental para investigar quais outros substratos energéticos poderiam ser utilizados pelo cérebro frente ao hipometabolismo da glicose em crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol. Hipotetizou-se um ambiente produtor de peróxido de hidrogênio como agente modulatório do metabolismo energético neste tipo de crise epiléptica. Para tanto se caracterizou o protocolo de respirometria de alta resolução em dissociado cerebral de peixe-zebra adulto. Os peixes foram expostos a pentilenotetrazol por diferentes tempos. Detectou-se um desacoplamento entre o metabolismo da glicose e o consumo de O2 para produção de ATP em crises epilépticas prolongadas de 20 min. Neste momento, testou-se o impacto dos seguintes substratos energéticos sobre o consumo de O2 para produção de ATP: L-glutamato, L-glutamina, L-lactato, e β-hidroxibutirato. Também foi avaliado o sistema pró/antioxidante em amostras de cérebro de peixe-zebra adulto submetido a crises epilépticas prolongadas por 20 min (CEUA – 28043). Os resultados indicam o uso do L-glutamato e da L-glutamina como substratos energéticos para a manutenção de crises epilépticas prolongadas, e um ambiente favorável à produção de peróxido de hidrogênio, pela redução da atividade do Complexo I mitocondrial, pelo aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase e glutationa peroxidase, e pelo aumento da oxidação de diclorofluoresceína. A literatura aponta para uma inibição da glicerol-3-fosfato-desidrogenase e piruvato-cinase, e uma ativação da glicose-6-fosfato-desidrogenase por aumento de peróxido de hidrogênio, o que culmina na diminuição da utilização da glicose como substrato energético. A completa oxidação do glutamato na presença de baixos níveis de piruvato ocorre via saída do malato da matriz mitocondrial e sua conversão a piruvato pela enzima málica. Ambas as enzimas produtoras de Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzida citadas acimas apresentam atividade aumentada no modelo de convulsão abordado. Portanto, o metabolismo glutamatérgico é fundamental para a manutenção energética, e para a atividade de defesas antioxidantes em momentos de crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol em peixe zebra adulto. / Epilepsy is a brain disorder, which promotes the predisposition to events of high energy expenditure known as epileptic seizure. As epileptic seizure progress form acute (until 5 min of duration) to prolonged (above 5 min of duration), lower is the concentration of glucose in the brain. This thesis mapped all models of zebrafish epileptic seizure and epileptic syndrome to choose the best model in our experimental conditions to evaluate the impact of other substrates under glucose brain hypometabolism related to prolonged epileptic seizure induced by pentylenetetrazole. It was hypothesized that an environment with high concentrations of hydrogen peroxide could be connecting with the fast metabolic modulation in this model. To do so, the highresolution respirometry protocol for zebrafish brain dissociated was characterized. Fish were exposed to pentylenetetrazole by different duration. There was a decoupling between glucose brain metabolism and O2 consumption to ATP synthesis after 20 min of exposure to pentylenetetrazole. At this moment, the impact of the following substrates were measured under O2 consume to ATP synthesis: L-glutamate, L-glutamine, L-lactate, and β-hydroxybutyrate. The redox balanced was evaluated as well (CEUA – 28043). Data indicate L-glutamate and L-glutamine as the main energy substrate to maintain prolonged epileptic seizure. There was an environment prone to hydrogen peroxide, because mitochondrial complex I activity was impered, and the enzymes superoxide dismutase and glutamine peroxidase were activity, as well as the oxidation of diclorofluoresceine was increased. Hydrogen peroxide activates glucose-6-phosphate-dehydrogenase, and inhibits glycerol-3-phosphatedehydroganase as well as piruvate kinase. Therefore the glucose metabolism would be modulated to antioxidant defense instead of glycolysis. In low pyruvate concentrations, malate from glutamate is transported to the cytosol and converted to pyruvate and Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. The activity of glucose-6- phosphate-dehydrogenase and citosolic malic enzyme were increased. Therefore, glutamate metabolismo is imperative to energy maintain prolonged epileptic seizure and to antioxidante defense to avoid further damage.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27 / Objetivos:Avaliar o efeito da varicocele na integridade do DNA nuclear,na atividade mitocondrial,na peroxidação lipídica e na integridade acrossômica dos espermatozóides.Métodos:as amostras foram obtidas e analisadas de acordo com os parâmetros da OMS(1999) e morfologia segundo critério estrito de Kruger.O grupo de estudo incluiu 30 homens com varicocele grauII ou III e o grupo controle incluiu 32 homens sem varicocele.A integridade do DNA nuclear dos espermatozóides foi avaliada pelo ensaio Cometa alcalino, e as células foram classificadas de acordo com a intensidade de dano no DNA:grau I(alta integridade do DNA),grau II(DNA ainda íntegro ou em início de fragmentação),grau III(DNA moderadamente fragmentado)e grau IV(DNA altamente fragmentado).A atividade mitocondrial foi avaliada pelo método colorimétrico proposto por Hrudka(1987),e as células foram classificadas em:classe I(mitocôndrias todas ativas),classe II (mais de 50 por cento de mitocôndrias ativas),classe III(menos de 50 por cento de mitocôndrias ativas)e classe IV(mitocôndrias todas inativas).A peroxidação lipídica foi determinada usando-se o método descrito por Ohkawa(1979),que se baseia na determinação de MDA devido à sua reação com o TBA, e o nível de peroxidação lipídica foi descrito em nanogramas de TBARS/mL de sêmen.A integridade do acrossoma foi avaliada através da sonda fluorescente PNA(Peannut Agglutinin)-FITC (Fluorescein isothiocyanite)conjugada, e o resultado foi expresso em porcentagem de espermatozóides com acrossoma íntegro.Resultados: quanto à integridade do DNA,o grupo de homens com varicocele apresentou uma menor porcentagem de espermatozóides com DNA nuclear íntegro(grau II, p=0,040).Não houve diferença na porcentagem de células grau I,III e IV.Quanto à atividade mitocondrial, o grupo de homens com varicocele apresentou uma porcentagem maior de espermatozóides com mitocôndrias inativas(classe III, p=0,020)e uma porcentagem menor de espermatozóides com mitocôndrias ativas(classe I, p=0,005).Não houve diferença na porcentagem de células classe II e IV.Quanto à integridade acrossômica, o grupo de homens com varicocele apresentou uma menor porcentagem de espermatozóides com acrossoma íntegro(p=0,0002).Por fim, com relação ao nível de peroxidação lipídica,não foi encontrada nenhuma diferença estatisticamente significante entre os grupos com e sem varicocele.Conclusões: Neste estudo, homens com varicocele apresentaram um aumento nas taxas de fragmentação de DNA e uma redução na atividade mitocondrial e na integridade acrossômica dos espermatozóides.Todavia, nenhuma diferença entre os níveis seminais de MDA foi encontrada, o que sugere que talvez as alterações funcionais encontradas não estejam associadas diretamente com o estresse oxidativo, ou que o estresse oxidativo leve a alterações no DNA, mitocôndrias e acrossoma durante a espermatogênese, e não após a ejaculação / Objectives: to assess the effect of varicocele on sperm nuclear DNA integrity, mitochondrial activity, lipid peroxidation and acrosome integrity. Methods: semen samples were obtained and analyzed according to the World Health Organization guidelines (1999) and sperm morphology was evaluated by Kruger’s strict criteria (1986). The study group included 30 men with varicocele grades II or III and the control group included 32 men without varicocele. Sperm nuclear DNA integrity was assessed by the alkaline Comet assay, and cells were graded according to the intensity of DNA damage: class I (high DNA integrity), class II (DNA still intact or initiating fragmentation), class III (DNA fairly fragmented) and class IV (DNA extremely fragmented). Mitochondrial activity was evaluated by the colorimetric method proposed by Hrudka (1987). Cells were classified according to the proportion of active mitochondria: class I (100% of active mitochondria), class II (more than 50% of active mitochondria), class III (less than 50% of active mitochondria) and class IV (100% of inactive mitochondria). Lipid peroxidation was determinated by Ohkawa’s method, which is based on the measurement of malondialdehyde (MDA) due to its reaction with thiobarbituric acid (TBA), and the levels of lipid peroxidation were described as nanograms of TBARS/mL. Acrosome integrity was assessed by use of the conjugated fluorescent probe PNA-FITC and the results were expressed in percentages of intact acrosomes (fluorescence was observed over the entire acrosomal region of the sperm head). Results: Concerning DNA integrity, the varicocele group showed less spermatozoa with intact nuclear DNA (grade II, p=0,040). There was no significant difference in classes I, III and IV between the two groups. Regarding mitochondrial activity the varicocele group showed more cells with inactive mitochondria (class III, p=0,001) and less cells with active mitochondria (class I, p=0,005). There was no difference in classes II and IV. Also, the varicocele group showed less spermatozoa with intact acrosomes (p=0,0002), when compared to the controls. Finally, no significant differences were observed in lipid peroxidation levels. Conclusions: This study was able to demonstrate that varicocele in adults is associated with increased DNA fragmentation, reduced mitochondrial activity and decreased acrosome integrity even when semen quality does not differ from men without varicocele. However, levels of seminal products of lipid degradation (MDA) are not increased in these patients, suggesting that perhaps the functional changes found are not directly associated with oxidative stress, or that oxidative stress leads to changes in DNA, acrosomes and mitochondria during spermatogenesis, and not after ejaculation. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Epilepsia é uma desordem neurológica que afeta o sistema nervoso central, predispondo o paciente a crises recorrentes, as quais apresentam uma alta demanda energética cerebral, e que culminam na depleção dos níveis de glicose cerebrais conforme a crise epiléptica progride de aguda (até 5 min) à prolongada (de 5 min até algumas horas). A presente tese mapeou os diferentes modelos de crises e síndromes epilépticas com enfoque em peixe-zebra, no intuito de selecionar o melhor modelo em nosso universo experimental para investigar quais outros substratos energéticos poderiam ser utilizados pelo cérebro frente ao hipometabolismo da glicose em crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol. Hipotetizou-se um ambiente produtor de peróxido de hidrogênio como agente modulatório do metabolismo energético neste tipo de crise epiléptica. Para tanto se caracterizou o protocolo de respirometria de alta resolução em dissociado cerebral de peixe-zebra adulto. Os peixes foram expostos a pentilenotetrazol por diferentes tempos. Detectou-se um desacoplamento entre o metabolismo da glicose e o consumo de O2 para produção de ATP em crises epilépticas prolongadas de 20 min. Neste momento, testou-se o impacto dos seguintes substratos energéticos sobre o consumo de O2 para produção de ATP: L-glutamato, L-glutamina, L-lactato, e β-hidroxibutirato. Também foi avaliado o sistema pró/antioxidante em amostras de cérebro de peixe-zebra adulto submetido a crises epilépticas prolongadas por 20 min (CEUA – 28043). Os resultados indicam o uso do L-glutamato e da L-glutamina como substratos energéticos para a manutenção de crises epilépticas prolongadas, e um ambiente favorável à produção de peróxido de hidrogênio, pela redução da atividade do Complexo I mitocondrial, pelo aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase e glutationa peroxidase, e pelo aumento da oxidação de diclorofluoresceína. A literatura aponta para uma inibição da glicerol-3-fosfato-desidrogenase e piruvato-cinase, e uma ativação da glicose-6-fosfato-desidrogenase por aumento de peróxido de hidrogênio, o que culmina na diminuição da utilização da glicose como substrato energético. A completa oxidação do glutamato na presença de baixos níveis de piruvato ocorre via saída do malato da matriz mitocondrial e sua conversão a piruvato pela enzima málica. Ambas as enzimas produtoras de Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzida citadas acimas apresentam atividade aumentada no modelo de convulsão abordado. Portanto, o metabolismo glutamatérgico é fundamental para a manutenção energética, e para a atividade de defesas antioxidantes em momentos de crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol em peixe zebra adulto. / Epilepsy is a brain disorder, which promotes the predisposition to events of high energy expenditure known as epileptic seizure. As epileptic seizure progress form acute (until 5 min of duration) to prolonged (above 5 min of duration), lower is the concentration of glucose in the brain. This thesis mapped all models of zebrafish epileptic seizure and epileptic syndrome to choose the best model in our experimental conditions to evaluate the impact of other substrates under glucose brain hypometabolism related to prolonged epileptic seizure induced by pentylenetetrazole. It was hypothesized that an environment with high concentrations of hydrogen peroxide could be connecting with the fast metabolic modulation in this model. To do so, the highresolution respirometry protocol for zebrafish brain dissociated was characterized. Fish were exposed to pentylenetetrazole by different duration. There was a decoupling between glucose brain metabolism and O2 consumption to ATP synthesis after 20 min of exposure to pentylenetetrazole. At this moment, the impact of the following substrates were measured under O2 consume to ATP synthesis: L-glutamate, L-glutamine, L-lactate, and β-hydroxybutyrate. The redox balanced was evaluated as well (CEUA – 28043). Data indicate L-glutamate and L-glutamine as the main energy substrate to maintain prolonged epileptic seizure. There was an environment prone to hydrogen peroxide, because mitochondrial complex I activity was impered, and the enzymes superoxide dismutase and glutamine peroxidase were activity, as well as the oxidation of diclorofluoresceine was increased. Hydrogen peroxide activates glucose-6-phosphate-dehydrogenase, and inhibits glycerol-3-phosphatedehydroganase as well as piruvate kinase. Therefore the glucose metabolism would be modulated to antioxidant defense instead of glycolysis. In low pyruvate concentrations, malate from glutamate is transported to the cytosol and converted to pyruvate and Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. The activity of glucose-6- phosphate-dehydrogenase and citosolic malic enzyme were increased. Therefore, glutamate metabolismo is imperative to energy maintain prolonged epileptic seizure and to antioxidante defense to avoid further damage.

Epilepsia é uma desordem neurológica que afeta o sistema nervoso central, predispondo o paciente a crises recorrentes, as quais apresentam uma alta demanda energética cerebral, e que culminam na depleção dos níveis de glicose cerebrais conforme a crise epiléptica progride de aguda (até 5 min) à prolongada (de 5 min até algumas horas). A presente tese mapeou os diferentes modelos de crises e síndromes epilépticas com enfoque em peixe-zebra, no intuito de selecionar o melhor modelo em nosso universo experimental para investigar quais outros substratos energéticos poderiam ser utilizados pelo cérebro frente ao hipometabolismo da glicose em crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol. Hipotetizou-se um ambiente produtor de peróxido de hidrogênio como agente modulatório do metabolismo energético neste tipo de crise epiléptica. Para tanto se caracterizou o protocolo de respirometria de alta resolução em dissociado cerebral de peixe-zebra adulto. Os peixes foram expostos a pentilenotetrazol por diferentes tempos. Detectou-se um desacoplamento entre o metabolismo da glicose e o consumo de O2 para produção de ATP em crises epilépticas prolongadas de 20 min. Neste momento, testou-se o impacto dos seguintes substratos energéticos sobre o consumo de O2 para produção de ATP: L-glutamato, L-glutamina, L-lactato, e β-hidroxibutirato. Também foi avaliado o sistema pró/antioxidante em amostras de cérebro de peixe-zebra adulto submetido a crises epilépticas prolongadas por 20 min (CEUA – 28043). Os resultados indicam o uso do L-glutamato e da L-glutamina como substratos energéticos para a manutenção de crises epilépticas prolongadas, e um ambiente favorável à produção de peróxido de hidrogênio, pela redução da atividade do Complexo I mitocondrial, pelo aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase e glutationa peroxidase, e pelo aumento da oxidação de diclorofluoresceína. A literatura aponta para uma inibição da glicerol-3-fosfato-desidrogenase e piruvato-cinase, e uma ativação da glicose-6-fosfato-desidrogenase por aumento de peróxido de hidrogênio, o que culmina na diminuição da utilização da glicose como substrato energético. A completa oxidação do glutamato na presença de baixos níveis de piruvato ocorre via saída do malato da matriz mitocondrial e sua conversão a piruvato pela enzima málica. Ambas as enzimas produtoras de Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzida citadas acimas apresentam atividade aumentada no modelo de convulsão abordado. Portanto, o metabolismo glutamatérgico é fundamental para a manutenção energética, e para a atividade de defesas antioxidantes em momentos de crises epilépticas prolongadas induzidas por pentilenotetrazol em peixe zebra adulto. / Epilepsy is a brain disorder, which promotes the predisposition to events of high energy expenditure known as epileptic seizure. As epileptic seizure progress form acute (until 5 min of duration) to prolonged (above 5 min of duration), lower is the concentration of glucose in the brain. This thesis mapped all models of zebrafish epileptic seizure and epileptic syndrome to choose the best model in our experimental conditions to evaluate the impact of other substrates under glucose brain hypometabolism related to prolonged epileptic seizure induced by pentylenetetrazole. It was hypothesized that an environment with high concentrations of hydrogen peroxide could be connecting with the fast metabolic modulation in this model. To do so, the highresolution respirometry protocol for zebrafish brain dissociated was characterized. Fish were exposed to pentylenetetrazole by different duration. There was a decoupling between glucose brain metabolism and O2 consumption to ATP synthesis after 20 min of exposure to pentylenetetrazole. At this moment, the impact of the following substrates were measured under O2 consume to ATP synthesis: L-glutamate, L-glutamine, L-lactate, and β-hydroxybutyrate. The redox balanced was evaluated as well (CEUA – 28043). Data indicate L-glutamate and L-glutamine as the main energy substrate to maintain prolonged epileptic seizure. There was an environment prone to hydrogen peroxide, because mitochondrial complex I activity was impered, and the enzymes superoxide dismutase and glutamine peroxidase were activity, as well as the oxidation of diclorofluoresceine was increased. Hydrogen peroxide activates glucose-6-phosphate-dehydrogenase, and inhibits glycerol-3-phosphatedehydroganase as well as piruvate kinase. Therefore the glucose metabolism would be modulated to antioxidant defense instead of glycolysis. In low pyruvate concentrations, malate from glutamate is transported to the cytosol and converted to pyruvate and Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. The activity of glucose-6- phosphate-dehydrogenase and citosolic malic enzyme were increased. Therefore, glutamate metabolismo is imperative to energy maintain prolonged epileptic seizure and to antioxidante defense to avoid further damage.