Avec une prévalence en constante augmentation, le diabète de type II est devenu un réel enjeu de santé publique. Cette pathologie se caractérise par une hausse de la production hépatique de glucose, reflet d'une néoglucogenèse accrue qui évoluera en hyperglycémie chronique. Le foie est donc un tissu-cible privilégié pour lutter contre les déséquilibres du métabolisme glucidique. Une nouvelle drogue dérivée de la Metformine et dénuée d'effets secondaires, le E008, a été synthétisée par Merck-Santé pour normaliser la glycémie des sujets diabétiques. Le double objectif de notre travail a consisté à (i) étudier les modifications des flux métaboliques au niveau hépatique dans un modèle nutritionnel de rats développant un syndrome métabolique, (ii) analyser les effets de ce nouveau composé médicamenteux et tenter d'élucider ses mécanismes d'action. Le régime enrichi en graisses entraîne une hausse de la néoglucogenèse associée à des perturbations de la fonction mitochondriale : hausse des radicaux libres, inhibition de la respiration, variation du potentiel rédox. Un dénominateur commun à ces évènements pourrait être une altération mutuelle de la composition des lipides membranaires et des quinones. L'administration du nouvel agent antidiabétique E008 à des rats sous régime gras permet de réduire leur production hépatique exacerbée de glucose, en modifiant le contrôle des voies métaboliques. De plus, il induit une inhibition subtile de la respiration cellulaire en agissant à la fois sur la chaîne respiratoire et sur le système phosphorylant (complexe I inhibé et expression réduite de l'ANT). Son action est également liée à une activation de la protéine kinase AMP dépendante (AMPK), par altération des rapports des nucléotides adényliques.

La plupart des traitements anticancéreux induisent l'apoptose des cellules tumorales in vitro comme in vivo. Les agents anticancéreux classiques agissent au niveau de cibles primitives, principalement localisées au niveau nucléaire, et activent consécutivement les différentes voies apoptotiques conduisant au stade ultime à la mort des cellules. Cependant, la résistance à l'induction de l'apoptose par les agents chimiothérapeutiques classiques reste un problème crucial. De nouvelles approches ont été développées pour dépasser la résistance à l'apoptose. Parmi elles, le ciblage de la mitochondrie apparaît comme une stratégie prometteuse pour tuer les cellules cancéreuses résistantes. Ainsi, de nouvelles molécules ciblant la mitochondrie ont été identifiées. Parmi celles-ci, notre laboratoire s'est intéressé aux Lamellarines, alcaloïdes pyrroliques hexacycliques d'origine marine. Outre leur effet inhibiteur des topoisomérases-I nucléaires, elles agissent également sur les mitochondries des cellules cancéreuses. Mon travail a consisté 1) à évaluer l'avantage des Lamellarines dans le traitement de lignées de cellules cancéreuses résistantes, défaillantes dans les voies apoptotiques (cas des carcinomes pulmonaires non à petites cellules, NSCLC) et 2) à décrypter les voies apoptotiques déclenchées par les Lamellarines. Ainsi, 1) sur les cellules NSCLC hautement résistantes à l'apoptose induite par les chimiothérapies classiques, nous avons évalué deux agents anticancéreux potentiels de la famille des Lamellarines. La Lamellarine-D (Lam-D) et son dérivé de synthèse PM031379 agissent directement sur la mitochondrie, induisant l'activation de Bax, la libération mitochondriale de cytochrome-c et d'AIF, et l'activation de la caspase-3. Cependant, seul le PM031379 induit la mort cellulaire qui s'accompagne de la translocation nucléaire d'AIF. De plus, cet effet létal nécessite la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) d'origine exclusivement mitochondriale. Ces résultats ont permis de comprendre les mécanismes permettant de restaurer l'apoptose des cellules chimiorésistantes. 2) La seconde partie de ce travail a consisté à caractériser les voies apoptotiques déclenchées par la Lam-D en évaluant précisément le rôle du noyau et des mitochondries dans son effet pro-apoptotique. La Lam-D exerce une remarquable cytotoxicité envers un large panel de tumeurs. A des concentrations de l'ordre du micromolaire, elle provoque l'apoptose nucléaire dans les cellules leucémiques sans blocage du cycle cellulaire. Les signaux transmis par la Lam-D initient l'apoptose via la voie apoptotique intrinsèque mitochondriale, activant Bax et réduisant les taux des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et cIAP2, en association avec l'activation des caspases-9 et -3. Nos résultats ont également permis d'évincer l'implication de la voie apoptotique extrinsèque dans la mort cellulaire induite par la Lam-D. Par ailleurs, la Lam-D engendre une réponse aux dommages à l'ADN générés par son effet inhibiteur de topoisomérase-I, résultant en la phosphorylation de l'histone H2AXγ, l'expression de la protéine de réparation Rad51 et de p53. Grâce à diverses lignées de cellules cancéreuses, nous avons également démontré que les mécanismes apoptotiques induits par la Lam-D sont indépendants du statut p53 des cellules tumorales. De plus, des cellules dépourvues de noyau (cytoplastes) subissent aussi l'apoptose induite par la Lam-D. L'ensemble de ces résultats démontre que la Lam-D ne nécessite pas la signalisation nucléaire pour promouvoir la mort des cellules cancéreuses et que la mitochondrie est la cible primordiale responsable de son effet pro-apoptotique. Ainsi, la Lamellarine-D et ses dérivés de synthèses, de part leur mécanisme d'action original ciblant directement les mitochondries, sont capables d'induire l'apoptose de cellules tumorales y compris résistantes aux chimiothérapies classiques (NSCLC, mélanomes).

Le monoxyde d'azote (NO) est formé à partir de L-arginine par la famille des NO synthases. La dysrégulation de la synthèse de cette molécule de signalisation cellulaire est impliquée dans le développement d'un grand nombre de pathologies. Les effets cellulaires du NO sont en partie dus à une inhibition des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale. Nous nous sommes intéressés aux effets du NO sur la régulation de l'oxydation phosphorylante et de le transition de perméabilité, deux processus mitochondriaux gouvernant la survie cellulaire. Nous avons ainsi démontré que l'inhibition de la cytochrome c oxydase (COX) par le NO était associée à une inhibition de la respiration et de la synthèse d'ATP. Cependant le NO augmente l'efficacité de l'oxydation phosphorylante (ATP/O) en diminuant le processus de « slipping ». Toutefois, notre travail a mis en exergue un effet du NO dépendant du substrat utilisé. En présence de NADH seul, le NO n'a pas l'effet bénéfique sur le rendement de l'oxydation phosphorylante, obtenu avec le FADH2 seul ou associé au NADH. L'étude de l'état d'oxydoréduction des cytochromes de la COX a révélé que dans les mitochondries énergisées avec du FADH2 seul ou en association avec le NADH, les cytochromes aa3 sont plus réduits qu'en présence de NADH seul. Nous pouvons suggérer que le « slipping » au niveau de la COX soit dépendant de l'état d'oxydoréduction de ses cytochromes. Le NO pourrait donc être un régulateur physiologique du processus d'oxydation phosphorylante. Nous avons également cherché à étayer l'hypothèse selon laquelle l'inhibition du complexe I aurait un effet anti-apoptotique en inhibant l'ouverture du PTP et la libération de cytochrome c. Le NO ayant un effet sur la chaîne respiratoire dans sa globalité, nous n'avons pu certifier que son effet activateur sur l'ouverture du pore soit dû à l'inhibition d'un complexe en particulier. Il semble que le phénomène de transition de perméabilité soit sensible à l'inhibition du complexe II. L'inhibition du complexe II par un inhibiteur comme le TTFA ou le malonate aurait un effet pro-apoptotique et ce malgré la présence d'inhibiteurs puissants du PTP comme la ciclosporine. Ces résultats suggèrent que le complexe II ferait partie des complexes protéiques régulateurs du PTP et que son inhibition soit dominante sur l'effet induit par l'inhibition du complexe I.

Thèse de doctorat : Biologie moléculaire et cellulaire : Strasbourg 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 273-279.

La signalisation calcique joue un rôle crucial dans la réponse des cellules aux signaux extracellulaires. Ces dernières années, les progrès des techniques de microscopie ont permis de montrer que l'organisation spatio-temporelle du signal calcique était un élément fondamental de la réponse des cellules. L'organisation temporelle du signal calcium se caractérise ainsi par l'observation d'oscillations de calcium dont la fréquence varie en fonction du stimulus. Pour de nombreux types cellulaires, et notamment pour les hépatocytes, modèle cellulaire de notre étude, l'amplitude et la fréquence des oscillations de calcium sont très régulières et finement régulées. Les nombreux facteurs qui interviennent pour assurer cette régulation rendent l'étude de ce processus difficile. Ceci explique que l'étude des oscillations de calcium est un des domaines dans lequel l'aspect expérimental est communément complété avec la modélisation mathématique.Parmi les nombreux éléments qui participent à la régulation du signal calcique, les mitochondries qui ont longtemps été considérées comme ayant un rôle passif, pourraient jouer un rôle important. En effet il a été établi que les mitochondries étaient capables d'accumuler de façon active le calcium libéré par le reticulum endoplasmique. Notre objectif a donc été d'étudier l'importance des mitochondries dans la régulation des oscillations de calcium dans les hépatocytes, et grâce à nos résultats expérimentaux, de mettre au point un modèle mathématique. Pour cela nous avons choisi de modifier la prise de calcium par les mitochondries en altérant le moins possible leur fonctionnement normal. Nous avons utilisé une protéine altérant directement la prise de calcium par les mitochondries (HINT 2) et une autre protéine altérant l'interaction entre le reticulum endoplasmique et les mitochondries (R-1). Nos résultats expérimentaux et computationnels démontrent que la protéine HINT 2 augmente l'activité de la chaine respiratoire, ce qui a pour effet d'accélérer l'accumulation de calcium par les mitochondries et d'augmenter la fréquence des oscillations de calcium cytosolique dans les hépatocytes. En effet le modèle élaboré permet à la fois de reproduire les observations expérimentales mais également de prédire avec succès que l'absence de la protéine Hint 2 rend les mitochondries plus sensibles à l'ouverture du pore de transition mitochondrial (mPTP). Nous avons également démontré que le R-1 n'affecte pas significativement la prise de calcium par les mitochondries mais que sa surexpression aboutit à une élévation de la concentration calcique de base des cellules hépatocytaires. A la lumière de nos résultats, cette élévation de la concentration de calcium basale semble être due à son interaction physique avec la pompe ATPase SERCA 2. Nos résultats nous ont permis de mettre en évidence à la fois la contribution des mitochondries dans la régulation des oscillations de calcium dans les hépatocytes grâce à la protéine Hint 2, mais aussi le lien direct entre la surexpression du R-1 et l'élévation de la concentration en calcium de base dans les cellules HepG2.

L'import d'ARN dans les mitochondries est un processus ubiquitaire chez les eucaryotes. Dans Saccharomyces cerevisiae un isoaccepteur cytosolique de l'ARNtLys, l'ARNtLys(CUU) (tRK1), est partiellement importé dans les mitochondries. L'adressage vers la surface mitochondriale a été étudié en détail mais l'étape de translocation dans les mitochondries reste toujours à démontrer. L'objectif principal de ce travail de thèse était l'identification et la caractérisation des protéines qui participent dans ce processus. Deux protéines de la membranes externe capables de former des canaux, Tom40 et VDAC1, ont été identifiées et leur rôle dans l'étape de translocation a été évalué in vitro et in vivo en utilisant des souches mutantes appropriées ou des agents capables de bloquer de manière spécifique les canaux formés par les protéines Tom40 et VDAC1. Ainsi il a été démontré que la délétion de VDAC1 ou l'inhibition du canal VDAC1 a conduit à une inhibition importante, néanmoins pas complète, de l'import de tRK1. Le blocage simultané des canaux Tom40 et VDAC1 par contre a causé un arrêt complet de l'import de tRK1 in vitro. Vu ces résultats, nous proposons que la translocation de tRK1 à travers la membrane mitochondriale externe puisse suivre deux chemins alternatifs.

Le surpoids et l'obésité, en constante augmentation à l'échelle mondiale à un rythme exponentiel, conduit au développement du syndrome métabolique et du diabète de type 2. Plusieurs études ont mis en évidence l'association entre l'excès de masse grasse, en particulier dans la région abdominale, et le développement des maladies cardiovasculaires. Une telle augmentation de masse grasse corporelle caractérise le vieillissement normal, qui est considéré per se comme un facteur de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires. De plus, dans le monde industrialisé, l'incidence des maladies cardiovasculaires est encore plus élevée et fortement liée aux habitudes occidentales (régimes obésogènes, sédentarité) qui contribuent à l'accumulation de la graisse abdominale. L'objectif général de ce travail consiste à suivre les changements corporels qui surviennent entre la jeunesse et l'âge moyen où commence à survenir les complications cardio-vasculaires et à savoir comment l'obésité induite par l'alimentation peut modifier ces aspects. Dans un premier temps, nous avons montré que les coeurs des rats Wistar d'âge moyen sont caractérisés par une moindre restauration de l'activité mécanique cardiaque au cours de la réperfusion post-ischémique en raison de perturbations de la perfusion coronaire et d'une insuffisance de l'apport en oxygène. La présence d'un stress oxydant systémique suite à l'augmentation de la masse grasse survenant entre la jeunesse et l'âge adulte est également en cause. Une diminution progressive de la dilatation endothélium-dépendante des microvaisseaux coronaires est également observé avec le vieillissement, ce qui résulte d'une évolution différentielle du comportement fonctionnel des cellules endothéliales et musculaires lisses apparemment liée au métabolisme énergétique et au stress oxydant. L'obésité induite par un régime riche en graisse provoque un certain nombre de modifications corporelles, métaboliques et cardiovasculaires au cours de cette période du vieillissement. L'excès de masse grasse abdominale induit une augmentation du stress oxydant aux niveaux systémique, cytosolique et mitochondrial accompagné par des altérations biochimiques concernant le métabolisme du glucose et les niveaux plasmatiques de cholestérol et de triglycérides. L'obésité induite par une hyperphagie et la présence d'un diabète de type 2 chez les rats Zucker obèses diabétiques provoque également une insulino-résistance sévère. Ces deux modèles d'obésité sont caractérisés par une diminution de la fonction cardiaque ex vivo liée au métabolisme énergétique mitochondrial et au stress oxydant. En outre, ils sont tous les deux caractérisés par une adaptation des microvaisseaux coronaires dont la réactivité est augmentée dans le cas de régime riche en graisse et maintenue dans le cas du diabète. Ces adaptations sont dues à des mécanismes différents dans les deux modèles d'obésité. Elles permettent de mieux répondre aux exigences métaboliques élevées liées à l'obésité. En conclusion, notre travail montre que les caractéristiques corporelles et métaboliques, le métabolisme énergétique mitochondrial, la fonction cardiaque et la réactivité coronaire sont modifiés lors du vieillissement dans les conditions normales ou obésogènes. Ces résultats encouragent la recherche ultérieure des mécanismes mis en jeu. Les interventions visant à réduire la masse grasse, qu'elle soit spontanément accrue par l'âge ou qu'elle résulte du régime alimentaire, seraient d'un grand intérêt pour retarder les complications cardiovasculaires.

La thérapie cellulaire régénératrice offre des perspectives d'applications dans de nombreuses pathologies entraînant une perte cellulaire. Cependant, suite à un infarctus du myocarde et donc une diminution importante du nombre de cardiomyocytes, l'injection de cellules souches n'a permis de mettre en évidence qu'une amélioration légère et transitoire de la fonction cardiaque. Ces résultats suggèrent qu'il est nécessaire d'améliorer l'efficacité des protocoles de thérapie cellulaire cardiaque. Cette amélioration passe par une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu par les cellules souches dans la régénération myocardique. Parmi les hypothèses soulevées, la fusion entre les cellules souches et les cardiomyocytes a été décrite dans plusieurs études mais le rôle physiologique de ce phénomène reste inconnu. Mon travail de thèse a consisté à étudier ce mécanisme in vitro au sein de cocultures entres des cellules souches adultes humaines (cellules hMADS pour human multipotent adipose derived stem cells) et des cardiomyocytes murins adultes. Nous avons pu mettre en évidence un processus de fusion hétérologue entre ces deux types cellulaires, aboutissant à la reprogrammation du cardiomyocyte vers un stade de progéniteur. Les cellules hybrides résultant de cette fusion ont exprimé des marqueurs cardiomyogéniques précoces et de prolifération et ont été montrées comme ayant un génotype exclusivement murin. Ces cellules hybrides ou progéniteurs cardiaques se sont formés préférentiellement par un mécanisme de fusion partielle par l'intermédiaire de structures intercellulaires appelées nanotubes composés de f-actine et de microtubules. En outre, nous avons montré que le transfert de mitochondries des cellules souches vers les cardiomyocytes était indispensable pour la reprogrammation des cardiomyocytes. En conclusion, nos résultats apportent de nouveaux éléments dans la compréhension des mécanismes de régénération médiés par les cellules souches qui est un pré-requis pour optimiser les protocoles de thérapie cellulaire cardiaque

La découverte récente d'adipocytes bruns fonctionnels chez les humains adultes a conduit à envisager leur utilisation afin d’augmenter la dépense énergétique dans de potentiels traitements contre l'obésité et les maladies associées. Par ailleurs, des ilots d’adipocytes bruns, appelés adipocytes "brite" (brown in white), émergent dans le tissu adipeux blanc après une exposition au froid ou une stimulation des récepteurs β3-adrénergiques. En utilisant les cellules hMADS, nous avons identifié plusieurs miARNs régulés pendant le « britening ». miR-125b et let-7i ont des niveaux d’expression plus bas dans les adipocytes « brites ». Des analyses fonctionnelles utilisant un « mimic » de miR-125b ou un inhibiteur ont révélé que miR-125b agit comme un frein sur le « brunissage » des cellules hMADS en altérant leur respiration ainsi que leur contenu mitochondrial. In vivo, nous avons montré que miR-125b et let-7i sont moins exprimés dans le tissu adipeux brun par rapport au tissu adipeux blanc. La stimulation des récepteurs β3-adrénergiques ou l'exposition au froid induit une diminution d’expression des miARNs dans les deux tissus et est associée à l'activation du tissu adipeux brun et au recrutement des adipocytes « brites ». Nous avons constaté que l’injection de miR-125b ou let-7i dans le tissu adipeux blanc sous-cutané inhibait l’expression de gènes du « brunissage » induite par la stimulation de la voie β3-adrénergique. En conclusion, nos observations ont montré que miR-125b et let-7i jouaient un rôle important dans la modulation des adipocytes « brites » et des adipocytes « bruns » en ciblant l’expression de gènes mitochondriaux et en diminuant la biogenèse mitochondriale. / The recent discovery of functional brown adipocytes in adult humans has led to the consideration of their use to increase energy expenditure in the treatment of obesity and associated metabolic disorders. Furthermore, in rodents and humans, islands of thermogenic adipocytes, termed “brite” (brown in white) adipocytes, emerge within white adipose tissue after cold exposure or β3-adrenergic receptor stimulation. Using hMADS cells, we identified several miRNAs regulated during “britening” including miR-125b and let-7i which showed lower levels in brite adipocytes. Functional analysis using miR-125b mimic or miR-125b inhibitor transfection revealed that miR-125b-5p acts as a brake of the browning of hMADS cells by impairing respiration rate as well as their mitochondrial content. miR-125b and let-7i levels were lower in brown compared to white adipose tissue. In vivo, we showed that both miRNAs levels were down regulated in mice sub-cutaneous white and brown adipose tissues upon β3-adrenergic receptors stimulation or cold exposure, which is associated with BAT activation and brite adipocyte recruitment. We found that injection of both miRNA mimics in subcutaneous white adipose tissue inhibited β3-adrenergic-induced brown adipocyte markers expression. Altogether, our observations showed that miR-125b and let-7i played an important role in the modulation of brite and brown adipocytes function targeting oxygen consumption and mitochondrial gene expression.

Le VDAC (Voltage-Dependent Anion-selective Channel) est un canal ionique de la membrane externe de la mitochondrie. Il est caractérisé par une haute conductance (4nS dans du KCl 1M) à des faibles différences de potentiel et des fermetures vers des niveaux de conductance inférieurs suite à l’application de voltages élevés. La selectivité de l’état de haute conductance est anionique alors que celle du principal état de faible conductance est fortement cationique. La structure secondaire et la fonction est bien conservée chez les animaux, les plantes et les champignons alors que les séquences sont très différentes (moins de 30% d’identités). Au sein des différents groupes, quelques isoformes coexistent.<p>La première partie du travail consiste à étudier l’évolution des isoformes de VDAC, à déterminer le nombre et les propriétés des isoformes. Nous montrons que les végétaux possèdent plus d’isoformes que les mammifères et que celles-ci sont également moins bien conservées. Nous avons défini trois classes d’isoformes sur base de leur charge nette :faiblement, moyennement ou fortement chargées. Les VDAC fortement exprimés et très bien conservés chez les champignons, les plantes et les animaux sont moyennement chargés. A l’opposé, les isoformes portant les plus hautes charges nettes sont très divergentes et peu exprimées. Ces particularités permettent pour la première fois de comparer les isoformes de groupes évolutivement distants.<p>Ensuite, pour relier la structure et la topologie du VDAC à sa fonction, nous avons construit un modèle topologique. Il consiste en feuillet bêta de 18 brins antiparallèles reployés de manière à former un tonneau transmembranaire présentant une courte hélice alpha à son extrémité aminoterminale. Le modèle est compatible avec les séquences de VDAC fongiques, végétaux et animaux. Il rend compte des résultats expérimentaux obtenus par spectroscopie infrarouge et par microscopie électronique de cristaux 2D. Enfin, les résultats d’études topologiques et fonctionnelles publiées dans la littérature supportent également notre modèle.<p>Nos travaux concernant le VDAC32 de Phaseolus coccineus a permis d’améliorer le protocole de purification et d’en obtenir la séquence. La structure et la stabilité du VDAC32 a été étudiée par spectroscopie infrarouge. L’étude de l’orientation du VDAC à l’aide de lumière infrarouge polarisée se base sur des modèles définissant deux angles, alpha et bêta correspondant à l’inclinaison de l’axe du tonneau par rapport à la normale à la membrane et l’inclinaison des brins par rapport à l’axe du tonneau. Nous proposons que l’angle alpha dépend également de l’asymétrie de la protéine. Nos mesures en spectroscopie infrarouge indiquent que la présence du VDAC diminue la température de transition de la membrane et que la structure protéique est sensible à la transition de phase des lipides membranaires. Enfin, nous montrons que la structure du VDAC est modifiée quand le rapport lipides/protéines diminue. L’orientation des brins bêta se rapproche de l’axe et les chaînes latérales des tyrosines deviennent moins ordonnées.<p>Les VDAC sont insérés dans la membrane mitochondriale qui contient environ 5% de stérols. Certains auteurs ont détecté le VDAC dans les membranes plasmiques. Ces dernières sont beaucoup plus riches en stérols. Nous montrons dans ce travail que le VDAC possède la même fonction dans des membranes contenant 0% ou 5% de stérols alors que sa structure est légèrement modifiée. Par contre, en présence de hautes concentrations en stérols, la fonction du VDAC est sensiblement altérée. Ces résultats suggèrent que le VDAC a des propriétés différentes dans la membrane plasmique et dans l’enveloppe de la mitochondrie.<p> / Doctorat en sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished