La thérapie cellulaire régénératrice offre des perspectives d'applications dans de nombreuses pathologies entraînant une perte cellulaire. Cependant, suite à un infarctus du myocarde et donc une diminution importante du nombre de cardiomyocytes, l'injection de cellules souches n'a permis de mettre en évidence qu'une amélioration légère et transitoire de la fonction cardiaque. Ces résultats suggèrent qu'il est nécessaire d'améliorer l'efficacité des protocoles de thérapie cellulaire cardiaque. Cette amélioration passe par une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu par les cellules souches dans la régénération myocardique. Parmi les hypothèses soulevées, la fusion entre les cellules souches et les cardiomyocytes a été décrite dans plusieurs études mais le rôle physiologique de ce phénomène reste inconnu. Mon travail de thèse a consisté à étudier ce mécanisme in vitro au sein de cocultures entres des cellules souches adultes humaines (cellules hMADS pour human multipotent adipose derived stem cells) et des cardiomyocytes murins adultes. Nous avons pu mettre en évidence un processus de fusion hétérologue entre ces deux types cellulaires, aboutissant à la reprogrammation du cardiomyocyte vers un stade de progéniteur. Les cellules hybrides résultant de cette fusion ont exprimé des marqueurs cardiomyogéniques précoces et de prolifération et ont été montrées comme ayant un génotype exclusivement murin. Ces cellules hybrides ou progéniteurs cardiaques se sont formés préférentiellement par un mécanisme de fusion partielle par l'intermédiaire de structures intercellulaires appelées nanotubes composés de f-actine et de microtubules. En outre, nous avons montré que le transfert de mitochondries des cellules souches vers les cardiomyocytes était indispensable pour la reprogrammation des cardiomyocytes. En conclusion, nos résultats apportent de nouveaux éléments dans la compréhension des mécanismes de régénération médiés par les cellules souches qui est un pré-requis pour optimiser les protocoles de thérapie cellulaire cardiaque / Regenerative cell therapy offers potential applications in many diseases involving cell loss. However, following myocardial infarction and the dramatic decrease in the number of cardiomyocytes, the injection of stem cells led to a poor and transient improvement of cardiac function. Therefore stem cell-based therapy to treat myocardial infarction requires a better understanding of the mechanisms brought into play by stem cells in heart regeneration. Among the different hypothesis raised, cell fusion between stem cells and cardiomyocytes has been described in several studies. However, the respective physiological impact of cell fusion remains unknown. During my thesis, I investigated this cell fusion mechanism in vitro in a coculture model between human multipotent adipose-derived stem cells (hMADS) and murine fully differentiated cardiomyocytes. We showed intercellular exchanges of cytoplasmic and nuclear material between both cell types, followed by a heterologous cell fusion process promoting cardiomyocyte reprogramming back to a progenitor-like state. The resulting hybrid cells expressed early cardiac commitment and proliferation markers and exhibited a mouse genotype. We provided evidence that cardiac hybrid cells were preferentially generated through partial cell fusion mediated by intercellular structures composed of f-actin and microtubule filaments. Furthermore, we showed that stem cell mitochondria were transferred into cardiomyocytes and were required for somatic cell reprogramming. In conclusion, by providing new insights into previously reported cell fusion processes, our results might contribute to a better understanding of stem cell-mediated regenerative mechanisms and thus, the development of more efficient stem cell-based heart therapies

Les mutations germinales activatrices de la voie RAS sont responsables de maladies rares regroupées sous le nom de RASopathies : le Syndrome de Noonan, le Syndrome de Noonan avec de Multiples Lentigines, la Neurofibromatose de type 1, le Syndrome de Malformations Capillaires et Malformations Artério-Veinseuses, le Syndrome Cardio-Facio-Cutané, le Syndrome de Legius et le Syndrome de Costello. Cette thèse s’intéresse au syndrome de Costello causé par une mutation hétérozygote de novo du gène HRAS. Ce syndrome est révélé dans les premiers mois de la vie et se caractérise par un retard de croissance postnatal, des traits du visage épais, un déficit intellectuel, des anomalies cutanées, ainsi qu’une prédisposition à développer des tumeurs. De plus, les patients atteints du syndrome de Costello développent une cardiomyopathie hypertrophique, de l’hypertension, une hypotonie et une myopathie d'origine moléculaire inconnue. En lien avec une association de malade et le service de génétique du CHU de Bordeaux, nous avons mené une exploration des anomalies protéomiques dans les tissus d’une souris modèle du syndrome de Costello ainsi que dans des fibroblastes de patients et des cellules modèles exprimant les formes mutées de HRASG12S et HRASG12A. Cette analyse globale et sans a priori a révélé des altérations au niveau du métabolisme énergétique et plus particulièrement de la composition des mitochondries. Le déficit fonctionnel des mitochondries, centrale énergétique du corps humain, a été caractérisé par des approches de biochimie, de bioénergétique et de biologie cellulaire. De plus, l’analyse des données ‘omiques’ a permis de suggérer une nouvelle hypothèse dans la physiopathologie du syndrome de Costello. Cette hypothèse considère l’implication d’un micro-ARN, le miR-221* dans l’inhibition du métabolisme oxydatif. Les analyses génétiques réalisées sur les cellules de patients et les cellules modèles ont démontré l’inhibition de l’expression de la protéine AMPK, un régulateur majeur du métabolisme mitochondrial, par le miR-221* sous le contrôle de HRASG12S et HRASG12A. Ces découvertes ont permis d’élaborer une stratégie thérapeutique visant à réduire la cardiomyopathie dans le syndrome de Costello. Les analyses précliniques effectuées sur les modèles cellulaires et le modèle murin ont permis d’évaluer l’efficacité d’une stimulation pharmacologique du métabolisme mitochondrial. Cette thèse révèle donc l’implication des mitochondries dans le syndrome de Costello et l’analyse moléculaire réalisée propose une série de données ‘Omiques’ qui permettront de progresser dans la compréhension de cette maladie rare. / Germline activating mutations of the RAS pathway are responsible for rare diseases grouped under the name of RASopathies: Noonan Syndrome, Noonan Syndrome with multiple Lentigines, Type 1-neurofibromatosis, Capillaries malformations and arteriovenous malformations syndrome, Cardio-Facio-Cutaneous Syndrome, Legius Syndrome and Costello Syndrome. This Ph.D thesis focuses on Costello syndrome that is caused by a heterozygous de novo mutation of the HRAS gene. This syndrome is revealed in the first months of life and is characterized by postnatal growth retardation, thick facial features, intellectual deficit, skin abnormalities, and a predisposition to developing tumors. In addition, patients with Costello syndrome develop hypertrophic cardiomyopathy, hypertension, hypotonia and myopathy of unknown molecular origin. In connection with a patients association and the genetics department of Bordeaux University Hospital, we conducted an exploration of proteomic abnormalities in the tissues of a mouse model of the Costello syndrome as well as in patients’ fibroblasts and cell models expressing mutated forms of HRASG12S and HRASG12A. This global and unbiased analysis revealed alterations in energy metabolism and more particularly in the composition of mitochondria. The functional deficiency of mitochondria, energy plants of the human body, has been characterized by biochemistry, bioenergetics and cell biology approaches. In addition, the 'omic' analysis of Costello syndrome suggested a new pathophysiology hypothesis that considered the involvement of a microRNA, miR-221* in the alteration of oxidative metabolism. Functional genetic analyzes performed on patient cells and cell models demonstrated the inhibition of the expression of the major mitochondrial metabolism regulator AMPK protein by miR-221* under the control of HRASG12S and HRASG12A. These findings led to the development of a preclinical therapeutic strategy to reduce cardiomyopathy in Costello syndrome. Preclinical investigations performed on the cellular models and the murine model made it possible to evaluate the efficacy of a pharmacological stimulation of mitochondrial metabolism. This thesis thus reveals the involvement of mitochondria in Costello syndrome and the molecular analysis carried out makes available a series of 'Omics' data that will allow progress in the understanding of this rare disease.

Les aminoacyl-ARNt synthétases catalysent la formation des aminoacyl-ARNt, utilisés lors de la synthèse protéique et peuvent également former des complexes multi-synthétasiques (MSC). Chez S. cerevisiae, le complexe AME associe les glutamyl- et méthionyl-ARNt synthétases à la protéine d’ancrage Arc1 et joue un rôle primordial dans la coordination de l’expression des génomes nucléaire et mitochondrial. Tous les composants de ce MSC sont multi-localisés et assurent des fonctions essentielles dans d’autres compartiments. Pour étudier ces localisations multiples, nous avons élaboré un outil, basé sur la Split-GFP, qui nous permet de visualiser spécifiquement la fraction organellaire d’une protéine multi-localisée. Pour cela, la GFP a été séparée en deux fragments : i) β1-10, restreint à un compartiment subcellulaire et ii) β11, fusionné aux protéines d’intérêts. Cet outil nous a permis d’étudier diverses relocalisations, ainsi que de délimiter des signaux d’import. / Aminoacyl-tRNA synthetases catalyze aminoacyl-tRNA formation, required for protein synthesis but can also associate into multi-synthetase complexes (MSC). In S. cerevisiae, the AME complex contains glutamyl- and methionyl-tRNA synthetases bound to the anchor protein Arc1 and is responsible for the coordination of nuclear and mitochondrial genome expression. The three MSC partners are multi-localized and present simultaneously in several compartments. The detection of the organellar pools of these multilocalized proteins in vivo is difficult, since they are mainly cytosolic. Therefore, we engineered a split-GFP based localization tool that allows us to specifically visualize organellar fractions of multi-localized proteins. To do so, GFP was split into two parts: β1-10, restricted to a subcellular compartment and β11, fused to the protein of interest. This tool allowed us to study relocalization of cytosolic proteins and characterize targeting signals.

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que le catabolisme des nutriments, la phosphorylation oxydative, l'apoptose et la régulation des flux calciques. Elles ont une structure dynamique, qui s'adapte en permanence aux besoins cellulaires, et sont sous le contrôle de réseaux de régulation coordonnant leur masse, leur structure et leurs fonctions. Le protéome mitochondrial est ainsi composé d'une très grande diversité de protéines qui dérive en partie de l'ancêtre procaryote des mitochondries et résulte majoritairement d'une information codée par le génome nucléaire, mais aussi d'une information plus restreinte portée par le génome mitochondrial. Sept cents protéines mitochondriales ont été caractérisées chez l'homme, grâce à diverses approches de protéomique, de génomique et de bio-informatique, mais il est probable que les mitochondries en comportent un nombre bien supérieur. La caractérisation de ces protéines est essentielle à la compréhension des nombreuses maladies génétiques et communes associées à des dysfonctionnements mitochondriaux. Au cours de ce travail de thèse nous avons comparé in silico les séquences des protéines mitochondriales humaines avec celles des procaryotes, mettant en évidence que les protéines impliquées dans les pathologies sont majoritairement homologues à des protéines procaryotes. Nous avons ensuite développé une stratégie de recherche bio-informatique de nouvelles protéines mitochondriales basée sur leur origine procaryote et la présence d'une extension N-terminale caractéristique. L'ensemble des protéomes procaryotes connus a été comparé au génome humain et différents outils de filtrage ont été développés pour identifier de nouvelles protéines. Parallèlement à cette stratégie globale de criblage, nous nous sommes focalisés sur l'étude d'une des protéines participant à la fusion mitochondriale qui est associée à l'atrophie optique autosomique dominante, la protéine Opa1. Cette dynamine GTPase est impliquée dans le remodelage de la membrane interne mitochondriale, l'apoptose, la maintenance de l'ADN mitochondrial et le métabolisme énergétique. Nous avons développé une base de données internationale répertoriant les différents variants affectant Opa1 afin de caractériser son spectre mutationnel. Cet outil a secondairement servi à une étude clinique multicentrique portant sur près de mille patients porteurs d'une neuropathie optique. À travers ces deux approches, nous avons pu développer de nouveaux outils bio-informatiques qui devraient contribuer à une meilleure compréhension de la physiopathologie mitochondriale.

Le rat Lou/C, issu de la souche Wistar, reste maigre tout au long de sa vie. Le but de ce travail était de caractériser la balance énergétique du rat Lou/C et d'établir quel(s) étai(en)t le(s) tissu(s) thermogène(s) impliqué(s) dans la dissipation de l'énergie alimentaire ingérée en excès. Si la quantité d'énergie ingérée, rapportée par unité de masse corporelle, n'était pas différente entre les deux souches de rats, la dépense énergétique du Lou/C était supérieure au repos, suite à un repas et lors de l'exercice physique. Le rat Lou/C montrait également une hyperactivité locomotrice spontanée volontaire bien supérieure à celle du Wistar. De façon inattendue, le tissu adipeux brun (BAT) des Lou/C était peu actif, comme l'ont montré des approches fonctionnelles in vivo, biochimiques in vitro ou moléculaires. L'absence d'activation du BAT du rat Lou/C n'était pas liée à une déficience du tissu puisqu'il était aisément activable par une exposition prolongée au froid. La forte activité physique spontanée du Lou/C ne s'accompagnait pas de l'activation de processus thermogènes particuliers des mitochondries isolées de BAT ou de muscle squelettique. En revanche, nous avons mis en évidence un mécanisme potentiel de découplage des oxydations phosphorylantes mitochondriales dans le foie des Lou/C. Contre toute attente, le rat Lou/C disposait de capacités de synthèse des acides gras équivalentes à celles du Wistar dans le foie et supérieures dans le tissu adipeux blanc avec de fortes capacités d'oxydation de ces substrats dans ces tissus, suggérant un possible cycle futile entre la synthèse des acides gras et leur oxydation dans le foie et le tissu adipeux blanc. Le rat Lou/C représente donc un modèle original de régulation de la balance énergétique qui n'est pas basé sur l'activité thermogène du BAT. Le muscle squelettique, le foie et le tissu adipeux blanc du Lou/C pourraient participer à un métabolisme actif des lipides et contribuer à la dissipation accrue de l'énergie ingérée en excès.

Résumé La ribonucléase P (RNase P) est une ribonucléoprotéine omniprésente dans tous les règnes du vivant, elle est responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNs de transfert (ARNts) et quelques autres petits ARNs. L’enzyme est composée d'une sous unité catalytique d'ARN (ARN-P) et d'une ou de plusieurs protéines selon les espèces. Chez les eucaryotes, l’activité de la RNase P cytoplasmique est distincte de celles des organelles (mitochondrie et chloroplaste). Chez la plupart des espèces, les ARN-P sont constituées de plusieurs éléments structuraux secondaires critiques conservés au cours de l’évolution. En revanche, au niveau de la structure, une réduction forte été observé dans la plupart des mtARN-Ps. Le nombre de protéines composant la RNase P est extrêmement variable : une chez les bactéries, environ quatre chez les archéobactéries, et dix chez la forme cytoplasmique des eucaryotes. Cet aspect est peu connu pour les formes mitochondriales. Dans la plupart des cas, l’identification de la mtRNase P est le résultat de longues procédures de purification comprenant plusieurs étapes dans le but de réduire au minimum le nombre de protéines requises pour l’activité (exemple de la levure et A. nidulans). Cela mène régulièrement à la perte de l’activité et de l’intégrité des complexes ribonucléo-protéiques natifs. Dans ce travail, par l’utilisation de la technique de BN-PAGE, nous avons développé une procédure d’enrichissement de l’activité RNase P mitochondriale native, donnant un rendement raisonnable. Les fractions enrichies capables de cette activité enzymatique ont été analysées par LC/MS/MS et les résultats montrent que l’holoenzyme de la RNase P de chacune des fractions contient un nombre de protéines beaucoup plus grand que ce qui était connue. Nous suggérons une liste de protéines (principalement hypothétiques) qui accompagnent l’activité de la RNase P. IV De plus, la question de la localisation de la mtRNase P de A. nidulans a été étudiée, selon nos résultats, la majorité de la mtRNase P est attachée á la membrane interne de la mitochondrie. Sa solubilisation se fait par l’utilisation de différents types de détergent. Ces derniers permettent l’obtention d’un spectre de complexes de la RNase P de différentes tailles. / Abstract RNase P is a ribonucleo-protein complex (an RNA enzyme or ribozyme) that cleaves 5’ leader sequences of precursor tRNAs and a few other small RNAs. It occurs in all three domains of life, Bacteria, Archaea and Eukarya, with the latter containing distinct nuclear and organellar (mitochondrial or plastid) activities. In most instances, the complex contains a single, well-conserved RNA subunit that carries the active center of the enzyme. Yet, compare to bacterial and nuclear P RNA, most mtP RNAs are structurally highly reduced. The number of P proteins is highly variable: one in Bacteria, about four in Archaea, and ten in the cytoplasmic form of Eukarya. Much less is known in the case of mitochondria. MtRNase P is usually purified by using numerous separation steps that include unphysiological conditions, leading to complexes having a minimum number of subunits (e.g., in yeast and Aspergillus nidulans), that often loose their activity. Here, using BN PAGE, we have developed an enrichment procedure for A. nidulans mtRNase P that avoids some of the most disruptive conditions. The protein composition of active fractions was identified with LC/MS/MS, indicating that the RNase P holoenzyme is much larger than previously thought. Finally, the question of mtRNase P localization within mitochondria was investigated, by tracing its RNA subunit by RT PCR. We found that mtRNase P of A. nidulans is a predominantly membrane-attached enzyme; it is in part solubilized by detergents such as digitonin and Triton.

L’objectif central de cette thèse de Doctorat était d’investiguer les dysfonctions mitochondriales qui surviennent précocement au cours de la phase compensée du remodelage ventriculaire pathologique et qui pourraient jouer un rôle causal dans la progression vers l’insuffisance cardiaque. Nos travaux antérieurs, réalisés à l’aide d’un modèle de surcharge volumique chronique induite par une fistule aorto-cavale (ACF) chez le Rat WKHA, ont montré qu’au cours du remodelage ventriculaire, les mitochondries développaient une vulnérabilité à l’ouverture du pore de perméabilité transitionnelle (PTP : un élément clé de la signalisation de la mort cellulaire) [1]. Ceci était observable au stade compensé du remodelage en absence des dysfonctions mitochondriales majeures typiquement observées dans le cœur insuffisant. Ces résultats nous ont amenés à suggérer que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP pourrait constituer un mécanisme précoce favorisant la progression de la cardiopathie. Dans l’étude 1 de cette thèse, nous avons tenté de tester cette hypothèse en induisant une ACF chez deux souches de rats affichant de très nettes différences au niveau de la propension à développer l’insuffisance cardiaque : les souches WKHA et Sprague Dawley (SD). Nos études in vitro sur organelles isolées et in situ sur l’organe entier ont permis de confirmer que, dans le cœur ACF, les mitochondries développent une vulnérabilité à l’ouverture du PTP et à l’activation de la voie mitochondriale de la mort cellulaire lorsqu’exposées à des stress pertinents à la pathologie (surcharge calcique, ischémie-reperfusion [I-R]). Cependant, bien que comparativement aux animaux WKHA, les animaux SD démontraient un remodelage ventriculaire plus rapide et prononcé et une progression précoce vers l’insuffisance cardiaque, aucune différence n’était observable entre les deux groupes au niveau des dysfonctions mitochondriales, suggérant quelles ne sont pas à l’origine de la progression plus rapide de la pathologie chez la souche SD, à tout le moins en réponse à la surcharge volumique. Nous avons par la suite déterminé, à l’aide des mêmes approches expérimentales, si cette vulnérabilité mitochondriale était observable dans une cardiopathie d’étiologie différente, plus spécifiquement celle qui est associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique causée par une mutation de la protéine dystrophine. Nos études menées (études 2-4) sur de jeunes souris mdx (le modèle murin de la DMD) exemptes de tout signe clinique de cardiopathie n’ont révélé aucune différence au niveau des fonctions mitochondriales de base. Cependant, tout comme dans le modèle d’ACF, les mitochondries dans le cœur de souris mdx étaient significativement plus vulnérables à l’ouverture du PTP lorsque soumises à une I-R (étude 2). Par ailleurs, nous avons démontré que l’administration aiguë de sildénafil aux souris mdx induisait une abolition de l’ouverture du PTP et de ses conséquences signalétiques, une diminution marquée du dommage tissulaire et une meilleure récupération fonctionnelle à la suite de l’I-R (étude 3). Nous avons ensuite testé chez la souris mdx l’administration aiguë de SS31, un peptide anti-oxydant ciblé aux mitochondries, cependant aucun effet protecteur n’a été observé, suggérant que le tamponnement des radicaux libres est d’une utilité limitée si les perturbations de l’homéostasie calcique typiques à cette pathologie ne sont pas traitées simultanément (étude 4). Globalement, les travaux effectués au cours de cette thèse démontrent que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP constitue une dysfonction précoce et commune qui survient au cours de remodelages ventriculaires pathologiques d’étiologies différentes. Par ailleurs, ces travaux suggèrent des stratégies d’intervention pharmacologiques ciblant ce processus, dont l’efficacité pour la prévention de l’insuffisance cardiaque demande à être établie. / The central objective of this doctoral thesis was to investigate the mitochondrial dysfunction that occurs early during the compensated phase of pathological ventricular remodeling and which may play a causal role in the progression to heart failure. Our previous work using a model of chronic volume overload induced by aorto-caval fistula (ACF) in rats WKHA showed that during the ventricular remodeling, mitochondria developed a vulnerability to permeability transition pore opening (PTP: a key component of cell death signaling) [1]. This was observed at the stage of compensated remodeling in the absence of major mitochondrial dysfunction typically observed in the failing heart. These results led us to suggest that the vulnerability to PTP opening could be a mechanism facilitating the progression of the cardiomyopathy. In our first study of this thesis we have attempted to test this hypothesis by inducing ACF in two strains of rats displaying sharp differences in the propensity to develop heart failure: WKHA strains and Sprague Dawley (SD). Our studies in vitro on isolated organelles and in situ on the whole organ have confirmed that, in the ACF heart, mitochondria develop a vulnerability to PTP opening and activation of mitochondrial cell death when exposed to stresses relevant to the pathology (calcium overload, ischemia-reperfusion [I-R]). However, SD animals compared to WKHA showed a more rapid and pronounced ventricular remodeling and early progression to heart failure, no difference was found between the two groups in terms of mitochondrial dysfunction, suggesting that this is not behind the more rapid progression of the disease in the SD strain, at least in response to volume overload. We subsequently determined, using the same experimental approaches, if this vulnerability was observed in mitochondria of heart disease from other etiology more specifically that associated with Duchenne muscular dystrophy (DMD), a genetic disease caused by a mutation of the protein dystrophin. Our studies (studies 2-4) on young mdx mice (the mouse model of DMD) free of clinical signs of heart disease showed no difference in basal mitochondrial functions. However, as in the model of ACF, the mitochondria of mdx mice heart were significantly more vulnerable to PTP opening when subjected to I-R (study 2). Furthermore, we demonstrated that acute administration of sildenafil to mdx mice abolished the PTP opening and its signaling consequences, markedly reduced of tissue damage and improved functional recovery following I-R (Study 3). We then tested in mdx mice acute administration of SS31, an antioxidant peptide that targets and accumulates in mitochondria. However, no protective effect was observed, suggesting that the buffering of free radicals have a limited utility if the typical perturbations of the calcium homeostasis in this disease are not treated simultaneously (Study 4). Overall, the work done during this thesis show that the vulnerability to PTP opening is a common and early dysfunction that occurs during pathological ventricular remodeling of different etiologies. Moreover, these studies suggest pharmacological intervention strategies targeting this process, whose effectiveness in preventing heart failure needs to be established.

Tout d'abord considérés comme simples composants d'une barrière imperméable, il a été démontré que les lipides membranaires auraient en fait un rôle biologique bien plus important, pouvant modifier l'environnement des enzymes membranaires et moduler l'activité de ces dernières. Dans la thèse présentée ici, ces relations ont été étudiées dans les mitochondries de l'huître creuse Crassostrea gigas. Les bivalves subissent d'importants changements environnementaux et l'adaptation à ces changements peut passer par un remodelage des membranes, ce qui fait de ces animaux des modèles intéressants pour les études des relations entre la structure des membranes et les activités d'enzymes associées. Des huîtres ont été nourries en écloserie avec deux régimes d'algues monospécifiques, T-Iso et Chaetoceros gracilis, et un mélange équilibré de ces deux algues. Malgré d'importantes modifications de composition en acides gras induites par les différents régimes alimentaires, une grande stabilité des processus membranaires mitochondriaux a été observée. D'un autre côté, la comparaison entre des huîtres élevées en écloserie et des huîtres élevées dans leur milieu naturel a révélé d'importantes modifications de capacités mitochondriales, qui pourraient être liées à une modulation des classes de phospholipides et de leur insaturation. Ces différences ne peuvent pas s'expliquer par une influence des cycles tidaux dans la mesure où, malgré un changement de production d'ATP, l'activité des mitochondries a été montrée comme étant similaire chez les huîtres collectées en émersion et en immersion. L'homéostasie mitochondriale observée dans cette étude pourrait être un moyen pour les huîtres de faire face aux variations biotiques (disponibilité en nourriture) et abiotiques (disponibilité en oxygène) de l'environnement naturel de C. gigas, et de maintenir leurs fonctions physiologiques malgré ces variations.

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Chez les végétaux, peu de canaux ioniques sont identifiés moléculairement. Nos travaux, par l’apport de preuves fonctionnelles, mettent en évidence les propriétés électrophysiologiques d’une protéine de la membrane mitochondriale externe (MOM) de Phaseolus coccineus, VDAC32. Nous montrons que cette protéine forme un canal partageant plusieurs caractéristiques électrophysiologiques typiques des canaux anioniques voltages dépendants (VDACs) (cinétique d'ouverture et de fermeture, sensibilité au voltage, conductance relativement grande, courbe de voltage dépendance en forme de cloche). <p>Nous avons constaté que la concentration saline avait un effet sur la voltage-dépendance du canal. En effet, le VDAC devient insensible à la différence de potentiel appliquée lorsqu'il est reconstitué dans des concentrations physiologiques en sel. Nombreuses sont les expériences réalisées dans des conditions non physiologiques (1 M KCl), mais nous montrons dans ce travail que le canal ne se comporte pas de la même manière en conditions physiologiques (0,1 M KCl).<p>La première partie de notre travail a été consacrée à l’étude de l’effet du cholestérol et deux phytostérols les plus abondants (sitostérol et stigmastérol) sur la voltage-dépendance du VDAC. Dans ce chapitre, nous avons montré l’effet des stérols sur la fonction des canaux ioniques au niveau moléculaire. Le rôle des stérols sur la sélectivité et la voltage-dépendance du VDAC a été mis en évidence. L’étude des phytostérols a permis de comprendre comment les propriétés du VDAC peuvent être modulées avec le type de stérol et son abondance dans la membrane. De même, la réversibilité de l’effet des phytostérols sur le VDAC en présence de la Méthyle-β-cyclodextrine a été prouvée. La conductance unitaire n’était pas affectée par l’addition des stérols.<p>Le deuxième chapitre de cette thèse a été consacré à l’étude des deux principaux phospholipides membranaires ;la phosphatidylcholine (PC) et phosphatidyl-éthalamine (PE). Il a été montré qu’à des concentrations salines similaires à celles trouvées in vivo, la voltage-dépendance du VDAC est inhibée en présence de membrane formée de PC mais pas en présence de membrane formée de PE et/ou PE méthylé une fois et deux fois. De même, la voltage-dépendance est restaurée suite à l’ajout de 2% de phytostérol ou de 2% de PE ou lorsque le degré de méthylation de la choline diminue. L’effet des stérols sur la voltage-dépendance est réversible. Nous avons montré que la sélectivité aux anions augment lorsque le degré de méthylation de la choline diminue tandis que la conductance unitaire du canal est invariable.<p>Nos résultats indiquent que l’interaction lipide-protéine est essentielle pour la régulation de l’activité du canal VDAC. La nature de la tête polaire des lipides est déterminante pour cette régulation ce qui suggère qu’elle s’effectue au niveau de l’interface membrane-solution. <p>La suite de nos travaux nous a conduit à l’étude de l’effet du cation monovalent, divalent et trivalent sur le VDAC. Nous avons montré que la voltage-dépendance est perdue dans des concentrations faibles en KCl (100 mM) et que cette dernière est restaurée en présence de 800 mmolale en KCl ou 100 mM de calcium ou 30 mM de lanthane. Ces résultats suggèrent que la restauration de la voltage-dépendance à des faibles concentrations en sel (100 mmolale) impliquerait un effet électrostatique/In plants, only some ion channels are identified molecularly. By providing functional evidence, our work highlights electrophysiological properties of the outer mitochondrial membrane (MOM) protein of Phaseolus coccineus, VDAC32. We show that this protein forms a channel sharing several typical electrophysiological characteristics of voltages dependent anion channels (VDACs) (gating kinetics, voltage sensitivity, relatively large conductance, voltage dependence curve bell-shaped).<p>We found that the salt concentration had an effect on the voltage-dependence of channel. Indeed, VDAC becomes insensitive to the applied potential difference when it was reconstituted in physiological salt concentrations. The greater part of the experiments were performed under non-physiological conditions (1 M KCl), but we show in our work that the channel does not have the same behavior under physiological conditions (0.1 M KCl).<p>The first part of our work has been devoted to the study of the effect of cholesterol and the two most abundant phytosterols (sitosterol and stigmasterol) on the VDAC voltage dependence. In this chapter, we have shown the effect of sterols on ion channel function at the molecular level. The role of sterols on the selectivity and the voltage-dependence of VDAC was highlighted. The study of phytosterols helped us to understand how the properties of VDAC can be modulated with the type of sterol and its abundance in the membrane. Similarly, the reversibility of the effect of phytosterols on the VDAC in the presence of Methyl-β-cyclodextrin has been proven. The unit conductance was not affected by the addition of sterols.<p>The second chapter of this thesis was devoted to the study of the two major membrane phospholipids, phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethalamine (PE). It has been shown that in similar salt concentrations to those found in vivo, the VDAC voltage-dependence is inhibited in the presence of membrane formed by PC but not in the presence of membrane formed by PE and/or PE methylated once and two times. Similarly, the voltage-dependence is recovered following the addition of 2% of phytosterol or 2% of PE or when the degree of methylation of choline decreases. The effect of sterols on the voltage-dependence is reversible. We have shown that the anion selectivity increases when the degree of methylation of choline decreases while the unitary conductance of the channel is invariable.<p>Our results indicate that lipid-protein interaction is essential for the regulation of the activity of VDAC channel. The nature of the lipids polar head is crucial for this regulation suggesting that it occurs at the membrane-solution interface.<p>The rest of our work has led us to study the effect of monovalent, divalent and trivalent cation on VDAC. We have shown that the voltage-dependence is lost in low concentrations of KCl (100 mM) and it is restored in the presence of 800 mmolale of KCl or 100 mM of calcium or 30 mM of lanthanum. These results suggest that the restoration of the voltage-dependence at low salt concentrations (100 mmolale) involve an electrostatic effect.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished