Thesis (Ph. D.)--University of Missouri-Columbia, 1996. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 116-131). Also available on the Internet.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri-Columbia, 1996. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 116-131). Also available on the Internet.

Thesis (Ph.D.)--Memorial University of Newfoundland, Faculty of Medicine, / Typescript. Bibliography: leaves [199]-[223].

A ciclodextrina glucosiltransferase (CGTase) é uma enzima industrialmente muito importante, capaz de converter o amido em ciclodextrinas (CDs). As CDs são capazes de formar complexos de inclusão com uma grande gama de compostos orgânicos e inorgânicos, podendo mudar suas propriedades químicas e físicas, propriedades estas que lhes confere extensiva aplicabilidade na indústria de alimentos, farmacêutica, química, cosmética e agrícola. Atualmente, diversas CGTases já foram isoladas e caracterizadas a partir de vários microrganismos, principalmente Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus e Thermoanaerobacterium. Neste trabalho, demonstramos o primeiro relato envolvendo a clonagem e expressão heteróloga da CGTase de Stenotrophomonas maltophilia, microrganismo isolado do solo brasileiro. O gene codificador da CGTase de S. maltophilia, foi amplificado com êxito através da técnica de PCR, clonado no vetor pET-23a(+) e expresso em Escherichia coli BL21(DE3). As células recombinantes necessitaram de aproximadamente 4 horas de cultivo em meio Luria Bertani (LB) após a adição de 0,1 mM de IPTG para a expressão elevada da proteína alvo. Porém, a CGTase recombinante foi expressa sob forma de corpos de inclusão permanecendo na fração insolúvel, sendo necessário utilizar protocolos para solubilização, incluindo diferentes concentrações de uréia, mas a precipitação não foi eficaz. Embora tenha sido observada uma expressão elevada da proteína com cerca de 60 kDa em SDS-PAGE 12%, que correspondeu ao tamanho esperado da proteína, a forma ativa da enzima não foi obtida. Uma análise bioinformática foi realizada, onde foi observou-se uma proteína conhecida como uma importante possível facilitadora transmembrana (PMFTP – putative Major Facilitator Transmembrane Protein) que ancora o gene cgt. Proteína esta que pode ser utilizada em novos estudos a fim de desenvolver um novo e mais eficaz sistema para expressão da CGTase, podendo facilitar a sua expressão extracelular. Assim, mais estudos são necessários para desenvolver um sistema de co-expressão de rCGTase::PMFTP em E. coli e obter mais informações desta proteína de Stenotrophomonas maltophilia. / Cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) is an industrially important enzyme, capable to convert starch into cyclodextrins (CDs). The CDs are able to form inclusion complexes with a wide range of organic and inorganic compounds, which can change their chemical and physical properties, that gives them extensive applicability in the food, pharmaceutical, chemical, cosmetics and agricultural. Currently, many CGTases have been isolated and characterized from various microorganisms, particularly Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus and Thermoanaerobacterium. This work demonstrates the first report involving cloning and expression of heterologous CGTase from Stenotrophomonas maltophilia, microorganism isolated from Brazilian soil. The gene encoding the S. maltophilia CGTase, was successfully amplified by PCR, cloned into the vector pET-23a (+) and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Recombinant cells required about 4 h of cultivation in Luria Bertani (LB) after addition of 0.1 mM IPTG for high expression of the target protein. However, the CGTase was expressed recombinant form of inclusion bodies remaining in the insoluble fraction, being necessary use protocols for solubilization, including different concentrations of urea, but the precipitation was not effective. Although it was observed a high expression of the protein about 60 kDa on SDS-PAGE 12%, corresponding to the expected size of the protein, but the active form of the enzyme was not obtained. Bioinformatic analysis was performed and observed a Putative Major Facilitator Transmembrane Protein (PMFTP) harboring the cgt gene. This protein can be used in further studies to develop a new and more effective system for expression of the CGTase, which may facilitate its extracellular expression. Thus, more studies are needed to develop a system of co-expression of rCGTase::PMFTP in E. coli and acquire more information about this protein of Stenotrophomonas maltophilia.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-10-06Bitstream added on 2014-06-13T19:04:26Z : No. of bitstreams: 1 rego_rocc_dr_arafo.pdf: 771295 bytes, checksum: 5b0351282506ff58004e2c6aac89a587 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros clínicos e microbiológicos periodontais de crianças e adolescentes sob terapia ortodôntica com aparelho fixo ou removíveis. Trinta indivíduos (14,5l1,7 anos - Grupo FIX) que utilizavam aparelhos fixos e 18 que utilizavam aparelho extra bucal removível ou placa de Hawley há pelo menos 6 meses (9,6 l 1,5 anos - Grupo REM) foram comparados a dois grupos controle, constituídos por indivíduos da mesma idade (14,2 l 1,7 anos - Grupo C-FIX e 9,3 l 1,9 anos - Grupo C-REM) que não utlizavam esses dispositivos. Foi analisada a presença de placa bacteriana visível (IP), sangramento gengival (IG), profundidade de sondagem (PS) e perda de inserção clínica (PIC). Amostras de placa bacteriana subgengival foram coletadas e analisadas por meio de sondas de oligonucleotídeos para A. actinomycetemcomitans (Aa), C. rectus, Capnocytophaga sp. E. corrodens, F. nucleatum, F. vincentii, M. micros, Neisseriaceae., P. gingivalis, P. intermedia, espiroquetas, T. forsythensis e Treponema sp. Diferenças significantes (p<0,05) foram observadas entre os grupos FIX e C-FIX quanto aos parâmetros IP (66,8% e 47,7%), IG (43% e 15,6%), e para as prevalências de todas as bactérias avaliadas, exceto as da familia Neisseriaceae. Entre dentes bandados e seus análogos no grupo controle foram encontradas diferenças significantes para os parâmetros PV (80,3% e 58,8%), SM (64,3% e 20,6%) e PS (2,9 mm e 2,5 mm), respectivamente. Entre os grupos REM e C-REM, essas diferenças também foram observadas para IP (58,7% e 14,3%) e IG (19,8% e 8,8%) e para as prevalências de Aa, C. rectus, E. corrodens, Neisseriaceae e espiroquetas. Entre os dentes retentores de grampo e seus análogos no grupo controle verificou-se diferenças significantes para IP (77,8% e 31,3%). Não foi verificado aumento da PS associado a PIC. Também foi avaliada a... . / The purpose of this study was to compare clinical and microbiological parameters in children and adolescents with and without fixed or removable orthodontic appliances. Thirty subjects (mean age 14.5l1.7 years) treated with fixed appliances and 18 treated with removable appliances for at least 6 months were selected as test groups, FIX and REM, respectively. The control groups were comprised of 30 subjects (mean age 14.2l1.7 years - Group C-FIX) and 18 subjects (mean age 9.3l1.9 years - Group C-REM) that did not receive orthodontic treatment. Clinical evaluations were made for plaque index (PI), gingival index (GI), probing depth (PD) and clinical attachment loss (CAL). Subgingival plaque samples were collected from the patients and analyzed by oligonucleotide probes for the presence of A. actinomycetemcomitans (Aa), C. rectus, Capnocytophaga sp. E. corrodens, F. nucleatum, F. vincentii, M. micros, Neisseriaceae., P. gingivalis, P. intermedia, spirochetes, T. forsythensis and Treponema sp. Additionally, two subgingival dental plaque samples from one subject of each test group were further analyzed by cloning and sequencing the amplified 16S rDNA. Significant differences were noted between FIX and C-FIX for PI (66.8% versus 47.7%), GI (43.8% versus 15.6%) and between the banded teeth in the FIX group and the analogous teeth in the C-FIX group for PI (80.3% versus 58.8%), GI (64.3% versus 20.6%) and PD (2.9 mm versus 2.5 mm). Significant differences were noted between FIX and C-FIX for all targeted bacteria but Neisseriaceae. Results: Significant differences were also noted between REM and C-REM for PI (58.7% versus 14.3%) and GI (19.8% versus 8.8%) and between the clasped teeth in the test group and the analogous teeth in the control group for PI (77.8% versus 31.3%). Significant differences were noted between the REM and C-REM for Aa... (Complete abstract, click electronic address below).

A ciclodextrina glucosiltransferase (CGTase) é uma enzima industrialmente muito importante, capaz de converter o amido em ciclodextrinas (CDs). As CDs são capazes de formar complexos de inclusão com uma grande gama de compostos orgânicos e inorgânicos, podendo mudar suas propriedades químicas e físicas, propriedades estas que lhes confere extensiva aplicabilidade na indústria de alimentos, farmacêutica, química, cosmética e agrícola. Atualmente, diversas CGTases já foram isoladas e caracterizadas a partir de vários microrganismos, principalmente Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus e Thermoanaerobacterium. Neste trabalho, demonstramos o primeiro relato envolvendo a clonagem e expressão heteróloga da CGTase de Stenotrophomonas maltophilia, microrganismo isolado do solo brasileiro. O gene codificador da CGTase de S. maltophilia, foi amplificado com êxito através da técnica de PCR, clonado no vetor pET-23a(+) e expresso em Escherichia coli BL21(DE3). As células recombinantes necessitaram de aproximadamente 4 horas de cultivo em meio Luria Bertani (LB) após a adição de 0,1 mM de IPTG para a expressão elevada da proteína alvo. Porém, a CGTase recombinante foi expressa sob forma de corpos de inclusão permanecendo na fração insolúvel, sendo necessário utilizar protocolos para solubilização, incluindo diferentes concentrações de uréia, mas a precipitação não foi eficaz. Embora tenha sido observada uma expressão elevada da proteína com cerca de 60 kDa em SDS-PAGE 12%, que correspondeu ao tamanho esperado da proteína, a forma ativa da enzima não foi obtida. Uma análise bioinformática foi realizada, onde foi observou-se uma proteína conhecida como uma importante possível facilitadora transmembrana (PMFTP – putative Major Facilitator Transmembrane Protein) que ancora o gene cgt. Proteína esta que pode ser utilizada em novos estudos a fim de desenvolver um novo e mais eficaz sistema para expressão da CGTase, podendo facilitar a sua expressão extracelular. Assim, mais estudos são necessários para desenvolver um sistema de co-expressão de rCGTase::PMFTP em E. coli e obter mais informações desta proteína de Stenotrophomonas maltophilia. / Cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) is an industrially important enzyme, capable to convert starch into cyclodextrins (CDs). The CDs are able to form inclusion complexes with a wide range of organic and inorganic compounds, which can change their chemical and physical properties, that gives them extensive applicability in the food, pharmaceutical, chemical, cosmetics and agricultural. Currently, many CGTases have been isolated and characterized from various microorganisms, particularly Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus and Thermoanaerobacterium. This work demonstrates the first report involving cloning and expression of heterologous CGTase from Stenotrophomonas maltophilia, microorganism isolated from Brazilian soil. The gene encoding the S. maltophilia CGTase, was successfully amplified by PCR, cloned into the vector pET-23a (+) and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Recombinant cells required about 4 h of cultivation in Luria Bertani (LB) after addition of 0.1 mM IPTG for high expression of the target protein. However, the CGTase was expressed recombinant form of inclusion bodies remaining in the insoluble fraction, being necessary use protocols for solubilization, including different concentrations of urea, but the precipitation was not effective. Although it was observed a high expression of the protein about 60 kDa on SDS-PAGE 12%, corresponding to the expected size of the protein, but the active form of the enzyme was not obtained. Bioinformatic analysis was performed and observed a Putative Major Facilitator Transmembrane Protein (PMFTP) harboring the cgt gene. This protein can be used in further studies to develop a new and more effective system for expression of the CGTase, which may facilitate its extracellular expression. Thus, more studies are needed to develop a system of co-expression of rCGTase::PMFTP in E. coli and acquire more information about this protein of Stenotrophomonas maltophilia.

A ciclodextrina glucosiltransferase (CGTase) é uma enzima industrialmente muito importante, capaz de converter o amido em ciclodextrinas (CDs). As CDs são capazes de formar complexos de inclusão com uma grande gama de compostos orgânicos e inorgânicos, podendo mudar suas propriedades químicas e físicas, propriedades estas que lhes confere extensiva aplicabilidade na indústria de alimentos, farmacêutica, química, cosmética e agrícola. Atualmente, diversas CGTases já foram isoladas e caracterizadas a partir de vários microrganismos, principalmente Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus e Thermoanaerobacterium. Neste trabalho, demonstramos o primeiro relato envolvendo a clonagem e expressão heteróloga da CGTase de Stenotrophomonas maltophilia, microrganismo isolado do solo brasileiro. O gene codificador da CGTase de S. maltophilia, foi amplificado com êxito através da técnica de PCR, clonado no vetor pET-23a(+) e expresso em Escherichia coli BL21(DE3). As células recombinantes necessitaram de aproximadamente 4 horas de cultivo em meio Luria Bertani (LB) após a adição de 0,1 mM de IPTG para a expressão elevada da proteína alvo. Porém, a CGTase recombinante foi expressa sob forma de corpos de inclusão permanecendo na fração insolúvel, sendo necessário utilizar protocolos para solubilização, incluindo diferentes concentrações de uréia, mas a precipitação não foi eficaz. Embora tenha sido observada uma expressão elevada da proteína com cerca de 60 kDa em SDS-PAGE 12%, que correspondeu ao tamanho esperado da proteína, a forma ativa da enzima não foi obtida. Uma análise bioinformática foi realizada, onde foi observou-se uma proteína conhecida como uma importante possível facilitadora transmembrana (PMFTP – putative Major Facilitator Transmembrane Protein) que ancora o gene cgt. Proteína esta que pode ser utilizada em novos estudos a fim de desenvolver um novo e mais eficaz sistema para expressão da CGTase, podendo facilitar a sua expressão extracelular. Assim, mais estudos são necessários para desenvolver um sistema de co-expressão de rCGTase::PMFTP em E. coli e obter mais informações desta proteína de Stenotrophomonas maltophilia. / Cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) is an industrially important enzyme, capable to convert starch into cyclodextrins (CDs). The CDs are able to form inclusion complexes with a wide range of organic and inorganic compounds, which can change their chemical and physical properties, that gives them extensive applicability in the food, pharmaceutical, chemical, cosmetics and agricultural. Currently, many CGTases have been isolated and characterized from various microorganisms, particularly Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus and Thermoanaerobacterium. This work demonstrates the first report involving cloning and expression of heterologous CGTase from Stenotrophomonas maltophilia, microorganism isolated from Brazilian soil. The gene encoding the S. maltophilia CGTase, was successfully amplified by PCR, cloned into the vector pET-23a (+) and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Recombinant cells required about 4 h of cultivation in Luria Bertani (LB) after addition of 0.1 mM IPTG for high expression of the target protein. However, the CGTase was expressed recombinant form of inclusion bodies remaining in the insoluble fraction, being necessary use protocols for solubilization, including different concentrations of urea, but the precipitation was not effective. Although it was observed a high expression of the protein about 60 kDa on SDS-PAGE 12%, corresponding to the expected size of the protein, but the active form of the enzyme was not obtained. Bioinformatic analysis was performed and observed a Putative Major Facilitator Transmembrane Protein (PMFTP) harboring the cgt gene. This protein can be used in further studies to develop a new and more effective system for expression of the CGTase, which may facilitate its extracellular expression. Thus, more studies are needed to develop a system of co-expression of rCGTase::PMFTP in E. coli and acquire more information about this protein of Stenotrophomonas maltophilia.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T02:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_TatianaAmabilede_D.pdf: 3044211 bytes, checksum: 4bdf180c662f55913d6301220e0b3ed4 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Quarenta e nove linhagens de Escherichia coli isoladas de aves isoladas de aves doentes (24 de aves com septicemia - S, 14 de aves com síndrome da cabeça inchada SHS e 11 de aves com onfalite - O) e 30 linhagens isoladas da região cloacal de aves saudáveis (C) foram analisadas em relação à presença de genes de virulência, grupos filogenéticos de E. coli, similaridade do gene mc. Estes dados foram comparados a um estudo populacional previamente obtido a partir de ERIC PCR (Silveira et al.,2002b), para a caracterização de possíveis dones patogênicos presentes nesta população. Os resultados demonstraram que os genes de virulência analisados foram mais freqüentes entre as linhagens isoladas de aves doentes. Linhagens isoladas de aves saudáveis, de aves com onfalite e de aves com septicemia derivam-se de grupos clonais não patogênicos de E. coli (A, e 81). Por 'outro lado, linhagens SHS e com septicemia derivam-se de grupos clonais patogênicos (82 e D). A comparação destes dados com os dados de ERIC-PCR demonstrou que estas linhagens constituem de três grupos principais: (i) 1 não patogênico, formado por linhagens isoladas de aves com onfalite e de aves saudáveis ambas derivadas principalmente de grupos clonais não patogênicos de E. coli (A); (ii) outro composto por linhagens SHS, derivadas principalmente do grupo clonal patogênico de E. coli (grupo D); e um terceiro grupo (iii) formado por linhagens isoladas por aves com septicemia onde 46% derivaram-se do grupo não patogênico A e outros 46% do grupo patogênico D. Estes dados sugerem que linhagens SHS provavelmente constituem um grupo clonal patogênico dentro da população analisada. Por outro lado, linhagens S possivelmente apresentam uma origem polifilética de dois ancestrais diferentes (um patogênico e outro não patogênico) onde a aquisição de genes de virulência através de transmissão horizontal possivelmente seja responsável por eventos que conduziram a um processo de evolução convergente. O agrupamento das linhagens isoladas de aves saudáveis e de linhagens O, sugere que a onfalite seja causada por linhagens não patogênicas. Os dados de similaridade do gene fIíC demonstram que houve a formação de dois grupos: um formado por linhagens isoladas de aves doentes e outro formada por linhagens isoladas de aves saudáveis. Estes dados sugerem que o gene fliC pode estar associado à diferenciação de possíveis dones patogênicos e não patogênico em linhagens de E. coli de origem aviária, assim como o observado em E. calí patogênicas para humanos / Abstract: Forty and nine Escherichía coli strains isolated frem sick chickens (24 frem septicaemia - S, 14 frem swollen head syndrem - SHS, and 11 frem omphalitis - O), and 30 strains isolated frem the cloacae region (C) of healthy chickens were analyzed in relation of the presence of virulence-related genes, E. colí phylogenetical groups, fliC gene similarity. These data were compared to a ERIC-PCR study realized of the same strains (Silveira et a/.,2002b) to characterize possible pathogenic clones present in this population. The results demonstrated that the virulence genes were more frequent among E. colí strains isolated from sick chicken. Strains isolated frem healthy chicken, frem omphalitis and from septicemic chickens were derived frem E. colí non pathogenic greups (A and B 1). SHS and septicemic strains belonged to E. coli pathogenic greups (B2 and D). The comparison of these data with the ERIC-PCR study demonstrated that these strains compounded three main clusters: (i) one non pathogenic, comp<?unded by E. colí strains isolated frem healthy chickens and frem omphalitis; (ii) one compounded by SHS strains belonged to D phylogenetical group; (iii) one compounded by septicemic strains where 46% belonged to A E. colí greup and 46% belonged to D E. calí greup. These data suggests the SHS strains prebably form a pathogenic clonal group inside the population analyzed. By contrast, septicemic strains may have a poliphyletical origin frem two ancestors (one pathogenic and another non pathogenic) where the horizontal acquisition of virulence genes may be respansible for events that conduced to a convergent evolution. The clustering of omphalitis and strains isolated frem healthy chickens suggests that omphalitis is caused by non pathogenic E. colí strains. The mc similarity data demonstrated that were two clusters one compounded by strains isolated frem healthy chickens and other compounded by strains isolated frem sick chickens. These data suggest that f/iC gene can be associated to pathogenic and non pathogenic clones differentiation like described among E. colí strains pathogenic for human / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O DNA de plasmídeos naturais de uma cepa de B. stearothermophilus foi clivado com a enzima de restrição Hind III e os fragmentos resultantes foram ligados com T 4 DNA ligase ao vetor pBR 322 (Bolívar et. al., 1977) que já havia sido previamente tratado com Hind III e fosfatase alcalina. A terça parte desta mistura de ligação foi usada para transformar células de E. coli HB 101. Foram obtidos cerca de 3.500 transformantes, dos quais 46% eram recombinantes. Duas cepas que mostraram caracter amilolítico consideravelmente maior que a doadora do gene continham o plasmídeo pBR 322 com uma inserção de 5.4 Kb. O mapa de restrição, tratamento com a enzima BAL 31 e, sucessivas subclonagens (Silva, E.F. et. al.,1986)mostraram que o gene que codifica e expressa a enzima amilolítica está contido em um fragmento de 2 Kb. A enzima produzida pelas células transformadas tem peso molecular de 60.000, é estabilizada por Ca+2, tem um ótimo de temperatura de 72ºC e retém 90% da atividade original após aquecimento a 85°C por 1 hora. Estes resultados, em conjunto com a análise dos produtos de hidrólise desta enzima em cromatografia de papel, sugerem que foi clonada a alfa - amilase de B. stearothermophilus em células de E. coli. Células de duas cêpas de B. subtilis, IA 289 e BD 241 foram transformadas respectivamente com os plasmídeos p USP 33.2 (Silva, E.F. et al., 1986;1987) e p BU 217 ami 2 (Silva, E.F. & Pueyo, M.T.,1988) para produzir em ambos os casos colônias fortemente amiloliticas. Os mecanismos pelos quais as 2 cêpas passaram a apresentar o fenótipo AMY + , são provavelmente diferentes. / The DNA of natural plasmids. from a B. stearothermophilus strain was cut with Hind III endonuclease and the resulting fragments were joined with T4 DNA ligase to the vector pBR 322 (Bolivar et al. , 1977), which had previously been treated with Hind III and alkaline phosphatase. One-third of the ligation mixture was used to transform E. coli HB 101 cells. It was obtained about 3.500 transformants, which included 46% recombinans. Two strains displayng amylolytic act ivity remarkably higher than the donor gene strain, harbored the plasmid pBR 322 with an insertion of 5.4 kb. The restriction map, Bal 31 treatment and successive subcloning (Silva, E.F, et al.,1986) showed that the entire gene which codifies and allows the expression of the amylolytic enzyme is contained in a 2 Kb fragment. The enzyme has a molecular weight of 60.000, is stabilized by Cata, has a temperature optimum at 72°C and retains 90% of the original activity after heating for 1h at 85°C. These features, together with the analysis of hydrolysis produts carried on paper chromatography , suggests that we succeded in cloning the amylase from B. stearothermophilus in E. coli cells. Cells from two B. subtilis strains, IQ 289 and BD 241 were transformed with the plasmid sp USP 33.2 (Silva E. F. et al., 1986 1987) and pBU 271 ami 2 (Silva, E. F. & Pueyo, M.T., 1988) , and produce in both strains, amyiolytic colonies. The methods in which the two strains have got the AMY + fenotype, may be very different.

Abstract Congenital nephrotic syndrome of the Finnish type (NPHS1, CNF) is an autosomal recessive disease that affects 1:8000 newborns in Finland. NPHS1 is characterised by heavy proteinuria already in utero and typical signs of nephrotic syndrome (NS) are present at or soon after birth. Due to the evident absence of extrarenal symptoms, NPHS1 has been considered a model disease for NS. In this study, the NPHS1 locus on chromosome 19q13.1 was sequenced and analysed with computer programs to identify new genes in the region. Genes were further characterised and sequenced from NPHS1 patient samples, as well as from controls. Analysis of the data resulted in the identification of the affected gene with two mutations that were found to explain 94% of the Finnish NPHS1 cases. The NPHS1 gene was found to encode a novel single-pass transmembrane protein, termed nephrin, which belongs to the immunoglobulin superfamily of cell adhesion molecules. The NPHS1 gene was cloned and recombinant nephrin fragments were produced in prokaryotic and eukaryotic expression systems. These fragments were used to raise antibodies that were utilized to characterise the spatial and temporal expression of nephrin in kidney glomeruli. Nephrin was localised by electron microscopy (EM) in ladder-like structures of the early junctional complexes of developing columnar podocytes at the capillary stage. In mature glomeruli, nephrin was localised to the slit diaphragm (SD) between adjacent glomerular podocyte foot processes. In order to investigate the more general involvement of nephrin in proteinuric disease, its expression was studied in primary acquired NS by immunofluorescence microscopy. The level of nephrin expression was found to be significantly reduced in membranous glomerulonephritis, minimal change disease and in focal segmental glomerulosclerosis. The known effects of nephrin mutations, together with the structure predicted from its sequence and localisation of the protein to the SD, emphasizes its indispensable role in maintaining the integrity of the glomerular filtration barrier. The glomerular basement membrane has long been considered to possess the size-selective filtration property of the filtration barrier. However, the identification of nephrin in the SD, as well as its alterations in proteinuria, has led us to reconsider SD as the final decisive size-selective filter.