Orientadores: Sandra Cecília Botelho Costa, Eros Antonio de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T09:16:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Batista_AngelicaMartins_D.pdf: 10617483 bytes, checksum: 6e76f5ea9c45674436a2aa740178f813 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Atualmente, o diagnóstico laboratorial da doença de Chagas crônica baseia-se em métodos sorológicos convencionais. Entretanto, resultados falso-negativos e falso-positivos podem ocorrer. A hemocultura também pode ser utilizada como método diagnóstico, mas sua sensibilidade é limitada na fase crônica. Métodos diagnósticos baseados em princípios de biologia molecular vêm sendo estudados e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido a técnica mais utilizada ultimamente. Este estudo teve como objetivo principal avaliar o desempenho da PCR qualitativa e quantitativa no diagnóstico da doença de Chagas em pacientes portadores de megaesôfago. Foram estudadas amostras de DNA de sangue de 26 pacientes com sorologia não reagente ou inconclusiva e de 33 pacientes soropositivos para doença de Chagas. O alvo genético mais adequado para PCR qualitativa, que apresentou maior positividade, foi o Sat-DNA de T. cruzi. Quando comparada com os resultados de PCR quantitativa, houve concordância de 72,72% em ambos os grupos. Além disso, observou-se que todos os pacientes com hemocultura positiva apresentaram PCR qualitativa positiva. A metodologia quantitativa, embora considerada altamente sensível, não detectou DNA de T. cruzi em uma amostra de paciente com hemocultura positiva. Nossos resultados indicam um possível subdiagnóstico da doença de Chagas em pacientes com megaesôfago devido aos exames sorológicos negativos ou inconclusivos. A PCR qualitativa mostra-se uma ferramenta útil para esclarecimento da etiologia do megaesôfago e, por apresentar positividade semelhante à qPCR, não se justifica o uso de metodologia quantitativa para fins exclusivamente diagnósticos / Abstract: Current laboratory diagnosis of chronic Chagas disease relies on conventional serological tests but false-positive and false-negative results may occur. Hemoculture can also be used as a diagnostic method but its sensitivity in chronic phase is limited due to the low/intermittent parasitemia. Molecular diagnosis methods have been studied and the main technique that has been extensively tested is the Polymerase Chain Reaction (PCR). This study aimed to evaluate the qualitative and quantitative PCR performance for diagnostic purposes in patients with megaesophagus. We studied DNA blood samples from 26 patients with negative or inconclusive conventional serology for Chagas disease and from 33 patients with positive serology. The most suitable target for qualitative PCR presenting high positivity was the Sat-DNA of T. cruzi. When compared to the quantitative results, the concordance between the two molecular methods in both groups was 72.72%. In addition, we observed that all patients with positive results of hemoculture had positive qualitative PCR. The qPCR methodology although highly sensitive could not detect minimal amounts of T. cruzi DNA in one patient with positive hemoculture. Our results indicate a possible misdiagnosis of patients with megaesophagus given by the negative or inconclusive serology for Chagas disease. Due to its good performance, the qualitative PCR is a useful tool to determine the megaesophagus etiology / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

<p>UVOD: Tuberkuloza je odavno poznata bolest koja i danas u 21. veku jo&scaron; uvek predstavlja veliki javnozdravstveni problem, uprkos primeni moćnih antituberkuloznih lekova. Trećina svetske populacije inficirana je bacilom tuberkuloze. Svake godine oboli oko osam miliona, a umre oko dva miliona ljudi, zbog čega je tuberkuloza i dalje infektivno oboljenje sa najvećom stopom smrtnosti. Kasna dijagnoza, multirezistentna tuberkuloza i udruženost sa HIV infekcijom predstavljaju jednu od najvećih prepreka za efikasnu kontrolu ove bolesti u svetu. Rano otkrivanje se oslanja na kvalitetnu bakteriolo&scaron;ku dijagnostiku koja je kamen temeljac svakog nacionalnog programa za kontrolu tuberkuloze. Brza i tačna mikrobiolo&scaron;ka dijagnostika predstavlja osnovu programa kontrole tuberkuloze i zbog toga je uvođenje novih i brzih laboratorijskih testova od veoma velikog značaja. Razvijen je novi komercijalno dostupni imunohromatografski test koji se zasniva na detekciji antigena MPT64 glavnog sekretovanog proteina M. tuberculosis. Test je brz i pouzdan u identifikaciji izolovanih sojeva M. tuberculosis i jeftiniji je od konvencionalnih biohemijskih i molekularnih testova. CILJ: Ciljevi istraživanja su bili da se evaluiraju karakteristike novog brzog imunohromatografskog testa u identifikaciji mikobakterija izolovanih iz respiratornih uzoraka bolesnika sa tuberkulozom pluća i referentnih sojeva klinički značajnih vrsta netuberkuloznih mikobakterija (NTM). MATERIJAL I METODE: Istraživanje je sprovedeno u periodu od 1.1.2010. do 31.12.2013. i obuhvatilo je 43563 respiratornih uzoraka dobijenih od bolesnika hospitalizovanih u Institutu za plućne bolesti Vojvodine. Iz obrađenih respiratornih uzoraka izolovano je 3469 izolata mikobakterija. Identifikacija do nivoa vrste urađena je primenom standardnih biohemijskih testova, molekularnog testa (GenoType&reg; Mycobacterium) i imunohromatografskog testa (BDMGIT Tbc). U istraživanje je uključeno 100 sojeva Gram pozitivnih i Gram negativnih bakterija (n = 19 vrsta) izolovanih iz respiratornih kliničkih uzoraka. Identifikacija do nivoa vrste je potvrđena komercijalnim identifikacionim sistemima. REZULTATI: U toku četvorogodi&scaron;njeg istraživanja izolovano je 3469 izolata mikobakterija iz respiratornih uzoraka. U ispitivanom periodu ne postoji opadajući trend izolacije mikobakterija &scaron;to potvrđuje i koeficijent korelacije (r = 0,31). Svi izolati mikobakterija su identifikovani konvencionalnim biohemijskim ispitivanjima koja pokazuju da je 89% od svih izolata identifikovano kao Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), a 11% izolata kao NTM. Mycobacterium xenopi je bila najzastupljenija NTM vrsta identifikovana kod 55,3% izolata. Nakon biohemijske identifikacije kod 300 izolata M. tuberculosis i 100 izolata NTM, identifikacija je potvrđena komercijalno dostupnim molekularnim i imunohromatografskim testom. Na osnovu rezultata testiranja mikobakterija imunohromatografskim testom, senzitivnost, specifičnost, pozitivne i negativne prediktivne vrednosti bile su: 99,7%, 100%, 100% i 99%. U poređenju imunohromatografskog testa sa konvencionalnim biohemijskim ispitivanjima nije nađena statistički značajna razlika (p&gt; 0,5). Kappa vrednost testa je iznosila 0,993, a interval poverenja CI =0,98 &ndash; 1,00. U poređenju imunohromatografskog sa molekularnim testom vrednost kappa je iznosila 0,993, a interval poverenja CI = 0,98 &ndash; 1,00. Slaganje rezultata je potvrđeno i McNemar testom sa vredno&scaron;ću 0,99. Utvrđena je stabilnost sekretovanog antigena MPT64 i posle 5 godina od prvog testiranja. ZAKLJUČAK: Visoka senzitivnost i specifičnost imunohromatografskog testa omogućuju tačnu i preciznu identifikaciju M. tuberculosis kao i pouzdanu diferencijaciju M.tuberculosis od NTM &ndash; a. Imunohromatografski test može da predstavlja zamenu za konvencionalne biohemijske i molekularne testove u identifikaciji M. tuberculosis. Jeftiniji je, jednostavniji za izvođenje i brže se dobijaju rezultati čime seskraćuje vreme za postavljanje dijagnoze.</p> / <p>INTRODUCTION: Tuberculosis (TB) has been known as a disease for a long time, but nevertheless it represents a major public health issue even nowadays in the 21st century, despite potent antituberculous drugs applied. One third of the world population is infected by the TB bacillus. About eight million people get infected and two million die of tuberculosis in a year, so tuberculosis is still an infectious disease with the greatest mortality rate. Late diagnosis, multiresistant tuberculosis and concomitant HIV infection interfere mostly with an efficient control of the disease all over the world. Early TB detection largely depends on the high-quality bacteriological diagnostics, which is the corner stone of each national TB control programme. A fast and accurate microbiological TB diagnosis plays a crucial role in any TB control programme. It is therefore very important to introduce new and fast laboratory tests. A novel commercially available immunochromatographic test has been designed, based on the MPT64 antigen of the major M. tuberculosis &ndash; secreted protein. This is a rapid and reliable test to identify the isolated strains of M. tuberculosis, which is not expensive as conventional biochemical and molecular tests. OBJECTIVE: The objective of the investigation was to evaluate the new immunochromatographic rapid test to identify mycobacteria isolated from respiratory samples from pulmonary TB patients, and referential strains of clinically relevant species of nontuberculous mycobacteria (NTM). MATERIAL AND METHODS: The research was carried out in the period from 1st January, 2010 to 31st December, 2013. It included 43 563 respiratory samples obtained from the patients hospitalized in the Institute for Pulmonary Diseases of Vojvodina, Sremska Kamenica (Serbia). There were 3 469 mycobacterial isolates obtained from the processed respiratory samples. The species &ndash; level identification was performed by standard biochemical tests, the molecular test (GenoType&reg;Mycobacterium), and the immunochromatographic test (BD MGIT Tbc). The study included one hundred (100) of Gram positive and Gram negative bacteria (n = 19 species) isolated from respiratory clinical samples. The species &ndash; level identification was confirmed by commercial identification systems. RESULTS: During the four &ndash; year investigation, 3 469 mycobacterial isolates were obtained from respiratory samples. No declining tendency of mycobacterial isolation was registered in the examined period, as confirmed by the correlation coefficient (r = 0.31). All mycobacterial isolates were identified by conventional biochemical tests showing that 89% of all isolates were identified as M. tuberculosis, and 11% of the isolates as NTM. Mycobacterium xenopi was the most common NTM species identified in 55.3% of the isolates. Following the biochemical identification in 300 M. tuberculosis isolates and 100 NTM isolates, the identification was confirmed by commercially available molecular and immunochromatographic tests. Based on immunochromatographic testing of mycobacteria, the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the test were 99.7%, 100%, 100% and 99% respectively. There is no statistically significant difference (p&gt; 0.5) when comparing features of immunochromatographic test with conventional biochemical assay. The kappa test value was 0.993, and the confidence interval CI = 0.98 &ndash; 1.00. Comparing the immunochromatographic with the molecular test, the kappa value was 0.993, and the confidence interval CI = 0.98 &ndash; 1.00. The congruence of the tests findings was also confirmed by the McNemar test, estimated to 0.99. The stability of the secreted MPT64 antigen was registered even five years after the first testing episode. CONCLUSION: The high sensitivity and specificity of the imunochromatographic test enable an accurate and precise identification of M. tuberculosis, as well as a reliable differentiation of M. tuberculosis from NTM. The immunochromatographic test may substitute conventional biochemical and molecular tests to identify M. tuberculosis. It is easier to perform and provides faster test results, thus reducing the time of establishing the diagnosis.</p>

INTRODUÇÃO: Os desequilíbrios genômicos constituem causa frequente de abortamento, anomalias congênitas (AC) e atraso de desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM). O aprimoramento de novas técnicas de diagnóstico citogenômico, como por exemplo, a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) e a triagem ampla do DNA utilizando arrays, mostraram que a alteração no número normal de cópias genômicas (CNVs) influencia na patogenicidade dos fenótipos em diversas síndromes. OBJETIVOS: Com isso, os objetivos do presente estudo foram identificar CNVs em pacientes com MC e ADNPM utilizando a técnica de MLPA e, a partir dos resultados alterados, aplicar da técnica de array para a identificação de possíveis rearranjos complexos, além de associar as alterações moleculares encontradas com o fenótipo dos pacientes. MÉTODOS: Participaram do estudo 416 pacientes com MC e ADNPM. As amostras de DNA foram analisadas utilizando a técnica de MLPA com kits comerciais para as principais síndromes de microdeleções (P064) e regiões subteloméricas (P036 e P070). Dois kits de MLPA específicos para as regiões 7q11.23 (P029) e 22q11.2 (P250) também foram utilizados para complementar a identificação de CNVs atípicas. Entre os casos que apresentavam alterações pela técnica de MLPA, 15 pacientes foram submetidos à técnica de array, utilizando três diferentes plataformas: Agilent SurePrint G3 Genoma Humano microarray 180 K, HumanCytoSNP-12 BeadChip, CytoScan(TM) HD array 6.0 Affymetrix®. RESULTADOS: A análise molecular pela técnica de MLPA possibilitou a detecção de microdeleções e/ou microduplicações em 97 pacientes sendo que: em 46 pacientes foi possível encontrar alterações utilizando apenas o kit P064 (microdeleções), em 34 pacientes utilizando apenas os kits P036 e P070 (regiões subteloméricas) e em quatro pacientes só foi possível identificar a alteração utilizando outro kit de MLPA (P250), específico para alterações genômicas em 22q11.2. Rearranjos complexos, envolvendo mais de três cromossomos, foram observados em 10 pacientes. DISCUSSÃO: A MLPA permitiu detectar CNVs em 97/416 pacientes (23,3%), sendo uma técnica ideal para ser aplicada em pacientes com sinais fenotípicos inespecíficos. Algumas alterações genômicas encontradas estão relacionadas também com alterações específicas, como a presença de malformação cardíaca ou convulsões. E em outros casos a alta variabilidade fenotípica pode ser associada a um conjunto de CNVs consideradas patogênicas. Além disso, a inclusão de outra técnica de triagem, com maior cobertura do genoma permitiu detectar rearranjos complexos antes não observados mesmo em síndromes bem descritas como as síndromes de midrodeleções 7q11.23 e 22q11.2. CONCLUSÃO: A MLPA com kits combinados, por possuir maior abrangência de regiões detectadas e menor custo, é uma ferramenta valiosa para ser utilizada como um teste de triagem diagnóstica / INTRODUCTION: Genomic imbalances are the most common cause of miscarriage, congenital anomalies (CA) and mental retardation (MR). With the improvement of new cytogenomics diagnostic techniques, such as the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) and the array techniques, it have been shown that changes in the normal gene copy number influence the pathogenic variability of phenotypes in different syndromes. AIMS: The aims of the present study were to identify CNVs in patients with CM and RM using the MLPA technique and, from the abnormalities results, to apply the array methodology for the identification of complex rearrangements. Furthermore, the study aimed to associate the alterations found by molecular techniques with the phenotype of patients. METHODS: 416 patients with CM and RM participated in the study. The samples were analysed by MLPA technique with commercial kits for the main microdeletion syndromes (P064) and subtelomeric regions (P036 and P070). Two more MLPA kits for specific regions 7q11.23 (P029) and 22q11.2 (P250) were used to confirm the altered results and to complement some results with the identification of atypical abnormalities. From the patients who presented abnormalities by MLPA technique, 15 underwent by microarray-based comparative genomic hybridization (CGH-array) technique, using three different platform: Agilent SurePrint G3 Human Genome microarray 180 kb, HumanCytoSNP -12 BeadChip, CytoScan(TM) HD ® and Affymetrix 6.0. RESULTS: The molecular analysis by MLPA technique allowed the detection of microdeletions and/or microduplications in 97 patients. In 46 patients it was possible to find genomic alteration using only MLPA kit P064 and in 34 patients using only the subtelomeric kits P036 and P070. For four patients it was only possible to identify the genomic abnormalities using another specific MLPA kit (P250), involving the 22q11.2 region. Complex rearrangements involving more than three chromosomes were detected in 10 patients. DISCUSSION: The MLPA technique was capable of detecting CNVs in 97/416 (23,3%) of patients, being an ideal technique to be applied in patients with non-specific signs phenotypic. Some genomic alterations found are, also related to specific changes, such as the presence of cardiac malformation or convulsions. In other cases, the high phenotypic variability may be associated to certain group of pathogenic CNVs. Moreover, the inclusion of additional screening method, with greater coverage, allowed the detection of complex rearrangements not seen before even in syndromes as well described microdeletions syndromes on 7q11.23 and 22q11.2 regions. CONCLUSION: The MLPA technique can be a valuable tool used as a molecular screening test, because it has greater coverage and lower cost of detected regions

O genótipo e a carga parasitária constituem dois dos principais fatores associados à patogênese na toxoplasmose congênita. Na Europa e nos EUA, o genótipo II é o mais prevalente em infecções congênitas, enquanto que na América do Sul existem evidências apontando uma maior frequência de genótipos atípicos ou recombinantes, associados a casos mais graves. A carga parasitária também parece atuar como fator de risco independente associado ao prognóstico fetal. Os objetivos do estudo foram padronizar uma amplificação quantitativa (qPCR) com iniciadores do gene B1 para avaliar a carga parasitária; determinar o genótipo parasitário por multiplex-nested-PCR-RFLP dos marcadores 5\'-SAG2, 3\'-SAG2, SAG3 e GRA6, seguido de sequenciamento para confirmação da RFLP e análise de mutações; e verificar se existiria associação entre a carga parasitária e os genótipos parasitários nas mesmas gestações. Foram analisadas 76 amostras de líquido amniótico de gestações com toxoplasmose e 31 amostras controle. A qPCR apresentou LOD de 10 parasitos/mL, detectou as 76 amostras de estudo e nenhum controle. As cargas parasitárias variaram de 222 a 808.328 parasitos/mL. Houve duas amostras com valores acima de 104 parasitos/mL, apesar de todas as gestantes serem tratadas. Na genotipagem, SAG3 amplificou 55 amostras (54 tipo III e uma tipo II); 5\' e 3\'-SAG2 amplificaram 54 amostras (todas tipo I), e GRA6, amplificou 20 amostras (todas tipo III). A única amostra com genótipo parasitário SAG3-tipo II foi a que apresentou mais mutações (n=4), carga parasitária de 958 parasitos/mL, porém o recém-nascido foi assintomático. Houve diferença do número de amostras amplificadas por SAG3, e 5\' e 3\'-SAG2 em relação a GRA6 (McNemar, p<0,001). Os sequenciamentos confirmaram 100% dos resultados de RFLP, e foram encontradas 24 amostras com e 52 sem mutações, não existindo diferenças entre as cargas parasitárias dos dois grupos (Mann-Whitney, p= 0,085). Mais de uma mutação foi observada em cinco amostras. Foram detectadas 37 mutações no estudo: 26 heterozigotas/sinônimas e 11 homozigotas/sinônimas, não havendo regiões hot spot. Quanto à correlação clínico-laboratorial, dos 76 recém-nascidos, todos apresentaram IgM positiva ao nascimento, e 75 eram assintomáticos. O único recém-nascido sintomático apresentava tríade de Sabin e uma das duas cargas parasitárias mais elevadas do estudo (309.574 parasitos/mL), porém o genótipo não foi discriminante e não havia mutações. A outra amostra com carga parasitária acima de 104 parasitos/mL pertencia a recém-nascido assintomático, com genótipo não discriminante, e sem mutações. O estudo concluiu que a técnica de Real Time PCR (qPCR) foi padronizada com sucesso, usando os iniciadores B22 e B23 do gene B1 do parasito, podendo ser empregada na rotina diagnóstica. Além disso, foi possível realizar a genotipagem das amostras incluídas no estudo, com melhor desempenho de SAG3 e 5\' e 3\'-SAG2. O sequenciamento confirmou a confiabilidade da técnica de RFLP, e encontrou frequência elevada de mutações, todas sinônimas, sem regiões hot spot, e aparentemente sem associação com a carga parasitária. Houve elevada variabilidade das cargas parasitárias, porém grande homogeneidade dos genótipos parasitários, não tendo sido observada associação entre a carga parasitária e os genótipos de T. gondii no estudo. / The genotype and the parasite load are two of the main factors associated with pathogenesis in congenital toxoplasmosis. In Europe and the USA, genotype II is the most prevalent in congenital infections, while in South America there is evidence pointing to a higher frequency of atypical or recombinant genotypes associated with more severe cases. The parasite load also appears to act as an independent risk factor associated with fetal prognosis. The study objectives were to standardize a quantitative amplification (qPCR) with B1 gene primers to assess the parasite load; determine the genotype by multiplex-nested-PCR-RFLP of 5\' and 3\'-SAG2, SAG3 and GRA6 markers, followed by sequencing to confirm RFLP and analyze mutations, verifying whether there is association between parasite load and parasite genotypes in the same pregnancies. We analyzed 76 amniotic fluid samples from pregnancies with toxoplasmosis and 31 controls. The qPCR presented LOD of 10 parasites/mL, detected the 76 study samples and no control. Parasite loads ranged from 222 to 808,328 parasites/mL. There were two samples with values above 104 parasites/mL, despite all pregnant women be treated. In genotyping, SAG3 amplified 55 samples (54 type III and 1 type II); 5 \'and 3\'-SAG2 amplified 54 samples (all type I); and GRA6, amplified 20 samples (all type III). The only sample with genotype SAG3-type II showed the highest number of mutations (n=4), parasite load of 958 parasites/mL, but the newborn was asymptomatic. There were differences in the number of samples amplified by SAG3, and 5 \'and 3\'-SAG2 over GRA6 (McNemar test, p <0.001). Sequencing confirmed 100% of the RFLP results; and found 24 samples with and 52 without mutations, with no difference between the parasite load of these two groups (Mann-Whitney, p= 0.085). More than one mutation was observed in five samples. A total of 37 mutations were detected in this study: 26 heterozygotes/synonymous and 11 homozygous/synonyms, with no hot spot regions. Regarding the clinical-laboratory correlation, among the 76 newborns, all showed positive IgM at birth, and 75 were asymptomatic. The only symptomatic newborn presented the Sabin\'s triad and one of the two higher parasite loads in the study (309,574 parasites/mL). However, the genotype was not discriminant and no mutations were detected. The other sample with parasite load above 104 parasites/mL belonged to an asymptomatic newborn with a non-discriminating genotype, and no mutations. The study concluded that the Real Time PCR (qPCR) was successfully developed with primers B22 and B23 of the parasite B1 gene, and can be used in routine practice. Moreover, it was possible to perform the samples genotyping, with better performance of SAG3 and 5 \'and 3\'-SAG2. Sequencing results confirmed the RFLP reliability, and found a high frequency of mutations, all synonymous, with no hot spot regions, and apparently not associated with the parasite load. There was a high variability in parasite load, however great homogeneity of parasite genotypes, with no association between the parasite load and T. gondii genotypes in the study.

INTRODUÇÃO: Os desequilíbrios genômicos constituem causa frequente de abortamento, anomalias congênitas (AC) e atraso de desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM). O aprimoramento de novas técnicas de diagnóstico citogenômico, como por exemplo, a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) e a triagem ampla do DNA utilizando arrays, mostraram que a alteração no número normal de cópias genômicas (CNVs) influencia na patogenicidade dos fenótipos em diversas síndromes. OBJETIVOS: Com isso, os objetivos do presente estudo foram identificar CNVs em pacientes com MC e ADNPM utilizando a técnica de MLPA e, a partir dos resultados alterados, aplicar da técnica de array para a identificação de possíveis rearranjos complexos, além de associar as alterações moleculares encontradas com o fenótipo dos pacientes. MÉTODOS: Participaram do estudo 416 pacientes com MC e ADNPM. As amostras de DNA foram analisadas utilizando a técnica de MLPA com kits comerciais para as principais síndromes de microdeleções (P064) e regiões subteloméricas (P036 e P070). Dois kits de MLPA específicos para as regiões 7q11.23 (P029) e 22q11.2 (P250) também foram utilizados para complementar a identificação de CNVs atípicas. Entre os casos que apresentavam alterações pela técnica de MLPA, 15 pacientes foram submetidos à técnica de array, utilizando três diferentes plataformas: Agilent SurePrint G3 Genoma Humano microarray 180 K, HumanCytoSNP-12 BeadChip, CytoScan(TM) HD array 6.0 Affymetrix®. RESULTADOS: A análise molecular pela técnica de MLPA possibilitou a detecção de microdeleções e/ou microduplicações em 97 pacientes sendo que: em 46 pacientes foi possível encontrar alterações utilizando apenas o kit P064 (microdeleções), em 34 pacientes utilizando apenas os kits P036 e P070 (regiões subteloméricas) e em quatro pacientes só foi possível identificar a alteração utilizando outro kit de MLPA (P250), específico para alterações genômicas em 22q11.2. Rearranjos complexos, envolvendo mais de três cromossomos, foram observados em 10 pacientes. DISCUSSÃO: A MLPA permitiu detectar CNVs em 97/416 pacientes (23,3%), sendo uma técnica ideal para ser aplicada em pacientes com sinais fenotípicos inespecíficos. Algumas alterações genômicas encontradas estão relacionadas também com alterações específicas, como a presença de malformação cardíaca ou convulsões. E em outros casos a alta variabilidade fenotípica pode ser associada a um conjunto de CNVs consideradas patogênicas. Além disso, a inclusão de outra técnica de triagem, com maior cobertura do genoma permitiu detectar rearranjos complexos antes não observados mesmo em síndromes bem descritas como as síndromes de midrodeleções 7q11.23 e 22q11.2. CONCLUSÃO: A MLPA com kits combinados, por possuir maior abrangência de regiões detectadas e menor custo, é uma ferramenta valiosa para ser utilizada como um teste de triagem diagnóstica / INTRODUCTION: Genomic imbalances are the most common cause of miscarriage, congenital anomalies (CA) and mental retardation (MR). With the improvement of new cytogenomics diagnostic techniques, such as the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) and the array techniques, it have been shown that changes in the normal gene copy number influence the pathogenic variability of phenotypes in different syndromes. AIMS: The aims of the present study were to identify CNVs in patients with CM and RM using the MLPA technique and, from the abnormalities results, to apply the array methodology for the identification of complex rearrangements. Furthermore, the study aimed to associate the alterations found by molecular techniques with the phenotype of patients. METHODS: 416 patients with CM and RM participated in the study. The samples were analysed by MLPA technique with commercial kits for the main microdeletion syndromes (P064) and subtelomeric regions (P036 and P070). Two more MLPA kits for specific regions 7q11.23 (P029) and 22q11.2 (P250) were used to confirm the altered results and to complement some results with the identification of atypical abnormalities. From the patients who presented abnormalities by MLPA technique, 15 underwent by microarray-based comparative genomic hybridization (CGH-array) technique, using three different platform: Agilent SurePrint G3 Human Genome microarray 180 kb, HumanCytoSNP -12 BeadChip, CytoScan(TM) HD ® and Affymetrix 6.0. RESULTS: The molecular analysis by MLPA technique allowed the detection of microdeletions and/or microduplications in 97 patients. In 46 patients it was possible to find genomic alteration using only MLPA kit P064 and in 34 patients using only the subtelomeric kits P036 and P070. For four patients it was only possible to identify the genomic abnormalities using another specific MLPA kit (P250), involving the 22q11.2 region. Complex rearrangements involving more than three chromosomes were detected in 10 patients. DISCUSSION: The MLPA technique was capable of detecting CNVs in 97/416 (23,3%) of patients, being an ideal technique to be applied in patients with non-specific signs phenotypic. Some genomic alterations found are, also related to specific changes, such as the presence of cardiac malformation or convulsions. In other cases, the high phenotypic variability may be associated to certain group of pathogenic CNVs. Moreover, the inclusion of additional screening method, with greater coverage, allowed the detection of complex rearrangements not seen before even in syndromes as well described microdeletions syndromes on 7q11.23 and 22q11.2 regions. CONCLUSION: The MLPA technique can be a valuable tool used as a molecular screening test, because it has greater coverage and lower cost of detected regions

O genótipo e a carga parasitária constituem dois dos principais fatores associados à patogênese na toxoplasmose congênita. Na Europa e nos EUA, o genótipo II é o mais prevalente em infecções congênitas, enquanto que na América do Sul existem evidências apontando uma maior frequência de genótipos atípicos ou recombinantes, associados a casos mais graves. A carga parasitária também parece atuar como fator de risco independente associado ao prognóstico fetal. Os objetivos do estudo foram padronizar uma amplificação quantitativa (qPCR) com iniciadores do gene B1 para avaliar a carga parasitária; determinar o genótipo parasitário por multiplex-nested-PCR-RFLP dos marcadores 5\'-SAG2, 3\'-SAG2, SAG3 e GRA6, seguido de sequenciamento para confirmação da RFLP e análise de mutações; e verificar se existiria associação entre a carga parasitária e os genótipos parasitários nas mesmas gestações. Foram analisadas 76 amostras de líquido amniótico de gestações com toxoplasmose e 31 amostras controle. A qPCR apresentou LOD de 10 parasitos/mL, detectou as 76 amostras de estudo e nenhum controle. As cargas parasitárias variaram de 222 a 808.328 parasitos/mL. Houve duas amostras com valores acima de 104 parasitos/mL, apesar de todas as gestantes serem tratadas. Na genotipagem, SAG3 amplificou 55 amostras (54 tipo III e uma tipo II); 5\' e 3\'-SAG2 amplificaram 54 amostras (todas tipo I), e GRA6, amplificou 20 amostras (todas tipo III). A única amostra com genótipo parasitário SAG3-tipo II foi a que apresentou mais mutações (n=4), carga parasitária de 958 parasitos/mL, porém o recém-nascido foi assintomático. Houve diferença do número de amostras amplificadas por SAG3, e 5\' e 3\'-SAG2 em relação a GRA6 (McNemar, p<0,001). Os sequenciamentos confirmaram 100% dos resultados de RFLP, e foram encontradas 24 amostras com e 52 sem mutações, não existindo diferenças entre as cargas parasitárias dos dois grupos (Mann-Whitney, p= 0,085). Mais de uma mutação foi observada em cinco amostras. Foram detectadas 37 mutações no estudo: 26 heterozigotas/sinônimas e 11 homozigotas/sinônimas, não havendo regiões hot spot. Quanto à correlação clínico-laboratorial, dos 76 recém-nascidos, todos apresentaram IgM positiva ao nascimento, e 75 eram assintomáticos. O único recém-nascido sintomático apresentava tríade de Sabin e uma das duas cargas parasitárias mais elevadas do estudo (309.574 parasitos/mL), porém o genótipo não foi discriminante e não havia mutações. A outra amostra com carga parasitária acima de 104 parasitos/mL pertencia a recém-nascido assintomático, com genótipo não discriminante, e sem mutações. O estudo concluiu que a técnica de Real Time PCR (qPCR) foi padronizada com sucesso, usando os iniciadores B22 e B23 do gene B1 do parasito, podendo ser empregada na rotina diagnóstica. Além disso, foi possível realizar a genotipagem das amostras incluídas no estudo, com melhor desempenho de SAG3 e 5\' e 3\'-SAG2. O sequenciamento confirmou a confiabilidade da técnica de RFLP, e encontrou frequência elevada de mutações, todas sinônimas, sem regiões hot spot, e aparentemente sem associação com a carga parasitária. Houve elevada variabilidade das cargas parasitárias, porém grande homogeneidade dos genótipos parasitários, não tendo sido observada associação entre a carga parasitária e os genótipos de T. gondii no estudo. / The genotype and the parasite load are two of the main factors associated with pathogenesis in congenital toxoplasmosis. In Europe and the USA, genotype II is the most prevalent in congenital infections, while in South America there is evidence pointing to a higher frequency of atypical or recombinant genotypes associated with more severe cases. The parasite load also appears to act as an independent risk factor associated with fetal prognosis. The study objectives were to standardize a quantitative amplification (qPCR) with B1 gene primers to assess the parasite load; determine the genotype by multiplex-nested-PCR-RFLP of 5\' and 3\'-SAG2, SAG3 and GRA6 markers, followed by sequencing to confirm RFLP and analyze mutations, verifying whether there is association between parasite load and parasite genotypes in the same pregnancies. We analyzed 76 amniotic fluid samples from pregnancies with toxoplasmosis and 31 controls. The qPCR presented LOD of 10 parasites/mL, detected the 76 study samples and no control. Parasite loads ranged from 222 to 808,328 parasites/mL. There were two samples with values above 104 parasites/mL, despite all pregnant women be treated. In genotyping, SAG3 amplified 55 samples (54 type III and 1 type II); 5 \'and 3\'-SAG2 amplified 54 samples (all type I); and GRA6, amplified 20 samples (all type III). The only sample with genotype SAG3-type II showed the highest number of mutations (n=4), parasite load of 958 parasites/mL, but the newborn was asymptomatic. There were differences in the number of samples amplified by SAG3, and 5 \'and 3\'-SAG2 over GRA6 (McNemar test, p <0.001). Sequencing confirmed 100% of the RFLP results; and found 24 samples with and 52 without mutations, with no difference between the parasite load of these two groups (Mann-Whitney, p= 0.085). More than one mutation was observed in five samples. A total of 37 mutations were detected in this study: 26 heterozygotes/synonymous and 11 homozygous/synonyms, with no hot spot regions. Regarding the clinical-laboratory correlation, among the 76 newborns, all showed positive IgM at birth, and 75 were asymptomatic. The only symptomatic newborn presented the Sabin\'s triad and one of the two higher parasite loads in the study (309,574 parasites/mL). However, the genotype was not discriminant and no mutations were detected. The other sample with parasite load above 104 parasites/mL belonged to an asymptomatic newborn with a non-discriminating genotype, and no mutations. The study concluded that the Real Time PCR (qPCR) was successfully developed with primers B22 and B23 of the parasite B1 gene, and can be used in routine practice. Moreover, it was possible to perform the samples genotyping, with better performance of SAG3 and 5 \'and 3\'-SAG2. Sequencing results confirmed the RFLP reliability, and found a high frequency of mutations, all synonymous, with no hot spot regions, and apparently not associated with the parasite load. There was a high variability in parasite load, however great homogeneity of parasite genotypes, with no association between the parasite load and T. gondii genotypes in the study.

Orientador: Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T02:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingues_HelenaGallicchio_D.pdf: 1037559 bytes, checksum: 5f1aa70035e934b591bffbdd05c647b9 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: No presente estudo, técnicas para a detecção do vírus respiratório sincicial bovino, BRSV, visando ao diagnóstico e caracterização molecular deste patógeno, foram adaptadas e aplicadas em amostras coletadas de animais sem levar em consideração a presença de sinais e sintomas clínicos característicos de infecções causadas por esse agente. Foi coletado um total de 278 amostras de secreções nasais e fragmentos pulmonares de rebanhos bovinos provenientes dos estados de São Paulo e Rio Grande do Sul. Utilizando a técnica de RT-PCR detectou-se a presença de BRSV em sete amostras, duas de secreções nasais e cinco de fragmentos de pulmões. As amostras positivas foram submetidas ao isolamento viral e um novo isolado, denominado BRSV-108-BR, foi obtido após nove passagens em cultivos de células. Os fragmentos de 603 pb correspondentes ao segmento genômico da proteína G das amostras de BRSV em estudo, obtidos com a técnica de RT-PCR, foram submetidos à análise por enzimas de restrição-REA e ao seqüenciamento, visando sua caracterização molecular. Com a técnica de REA foram identificadas variações genéticas entre as amostras de BRSV detectadas, sugestivas de que duas amostras pertenciam ao subgrupo AB e cinco, ao subgrupo B de BRSV. Entretanto, a análise filogenética realizada pelo alinhamento das seqüências obtidas com seqüências disponíveis no GeneBank revelou que todas as amostras detectadas pertenciam ao subgrupo B. Com este estudo sugerimos que a técnica de REA possui utilidade limitada para classificação de BRSV em subgrupos, podendo ser utilizada como um instrumento prévio na caracterização das amostras, sendo, todavia, estritamente necessária uma análise baseada no seqüenciamento do gene da proteína G para caracterização de BRSV em subgrupos / Abstract: In this study techniques to detect the bovine respiratory syncytial virus (BRSV), aiming at the diagnosis and molecular characterization of this pathogen, where adapted and applied in samples collected from animals regardless of the presence of clinical signs and symptoms characteristic of infections caused by this agent. A total of 278 samples of nasal secretion and pulmonary fragments of bovine herds from the States of São Paulo and Rio Grande do Sul. By using the RT-PCR technique it was detected the presence of BRSV in seven samples, two of the nasal secretion samples, and five of the pulmonary fragments samples. The positive samples were submitted to viral isolation, and a new isolate named BRSV-108-BR was obtained after nine passages in cell cultivations. 603 pb fragments corresponding to the genomic segment of the G protein of the BRSV samples in study and obtained through the RT-PCR technique were submitted to restriction enzyme analysis (REA) and sequencing, aiming at their molecular characterization. With the REA technique, genetic variations were identified among the detected BRSV samples, suggesting that two samples belonged to the BSRV AB subgroup and five belonged to the BRSV B subgroup. However, phylogenetic analysis carried out by sequence alignment obtained with sequences available at the GeneBank revealed that all samples detected belonged to subgroup B. With this study we suggest that the REA technique to classify BRSV subgroups has a limited usefulness, serving only as a prior instrument to characterize the samples. Nevertheless, a subsequent analysis based on G protein sequencing is extremely necessary to characterize samples in one of the different BRSV existing subgroups / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O genoma humano é composto por diversos tipos de variações estruturais, como por exemplo, as variações no número de cópias (CNVs), que, mesmo sendo muito pequenas, podem gerar diversas alterações clínicas específicas, como as malformações congênitas e o atraso do desenvolvimento neuropsicomotor (MC/ADNPM). Para a detecção destas alterações existem diferentes técnicas citogenômicas dentre elas a FISH (Fluorescent in situ Hibridization) e a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), que investigam um número limitado de regiões do genoma, como as regiões envolvidas nas síndromes de microdeleções/microduplicações mais comuns e as regiões subteloméricas. Outros métodos como a cariotipagem clássica e o array genômico possibilitam uma análise completa do DNA em uma única reação, aumentando a taxa de detecção de desequilíbrios complexos. Alcançar um diagnóstico inequívoco é fundamental para entender a natureza da doença, fornecendo respostas sobre o prognóstico, sobre os riscos de recorrência e direcionando o paciente à terapia específica, o que pode minimizar o custo financeiro dessas doenças e até mesmo possibilitar a inclusão desses indivíduos na sociedade. O projeto teve como objetivo comparar a capacidade diagnóstica destas tecnologias (FISH, MLPA e array) para a elucidação etiológica de pacientes sindrômicos encaminhados para a unidade de genética. A casuística deste trabalho foi composta pela análise dos resultados das técnicas de FISH e/ou MLPA e array, utilizadas no diagnóstico de 78 pacientes com MC/ADNPM. Na técnica de FISH, empregada na análise genômica de 22 pacientes, foram utilizadas sondas locus específicas para as regiões das principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas de cromossomos específicos. Por meio desta metodologia, foram identificados ~18,2% dos pacientes com diferentes alterações. Já a técnica de MLPA, utilizada no diagnóstico dos 78 pacientes, por meio dos kits para as principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas, detectou ~34,6% de pacientes com diversas alterações. A técnica de array, realizada em todos os pacientes utilizando diferentes plataformas (Agilent, Affymetrix ou Illumina) apresentou uma taxa de ~42,3% de detecção de pacientes com pelo menos uma alteração patogênica e ~38,5% de pacientes com alterações benignas ou de significado clínico incerto. Ao avaliar as três técnicas concomitantemente foi verificada uma taxa de ~93,6% de concordância, apesar dos resultados não serem iguais em todos os casos e da técnica de MLPA não detectar ~66,2% das alterações em relação ao array. Os resultados obtidos corroboraram com dados da literatura, mas no geral a taxa de detecção foi superior às taxas descritas, o em que em parte pode ser devido ao critério de seleção dos pacientes, sugerindo fortemente que a hipótese clínica adequada é crucial para o sucesso da detecção de alteração. Embora o array seja a ferramenta mais eficiente para o diagnóstico de pacientes com malformações, seu uso como primeiro teste diagnóstico nem sempre é o mais apropriado devido ao seu custo elevado ou sua limitação em detectar inversões e translocações balanceadas. Portanto todas as técnicas estudadas têm suas vantagens e desvantagens, e poderão ser aplicadas em conjunto para que o diagnóstico molecular seja concluído. Dessa forma, são necessárias uma interação clínico-laboratorial e uma equipe técnica multiprofissional especializada para o direcionamento do diagnóstico molecular mais eficaz em relação ao custo-benefício / The human genome is composed of several types of structural variations, such as copy number variation (CNVs) which, although very small, can generate several specific clinical abnormalities, such as congenital malformations and developmental delay (CM/DD). To detect these changes there are different cytogenomics techniques, among them, FISH (Fluorescent in situ Hybridization) and MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) that can investigate a limited number of genomic regions for example the most common microdeletion/microduplications syndromes and subtelomeric regions. Other methods such as classical karyotyping and array provide a complete DNA analysis in a single reaction, increasing the detection rate of complex imbalances. Acquire an unequivocal diagnosis is critical to understand the nature of the disease, providing answers about the prognosis, risks of recurrence and directing the patients to specific therapy, which can minimize the cost of these diseases and even allow the inclusion of these individuals in society. The objective of this project was to compare the diagnostic ability of these technologies (FISH, MLPA and array) for the etiologic diagnosis of syndromic patients referred to the clinical unit of genetics. The casuistry was composed by the results of analysis of 78 patients with CM/DD using FISH and/or MLPA and array. The FISH technique was utilized in genomic analysis for 22 patients and locus specific probes were used for regions of the microdeletion/microduplication syndromes and the subtelomeric regions of specific chromosomes. By this methodology ~18.2% of the patients were identified with different genomic changes. The MLPA technique was used in the diagnosis of 78 patients, with microdeletion/microduplication syndrome and subtelomeric regions, and detected ~34.6% of patients with several changes. The array technique was performed in all patients using different platforms (Agilent, Illumina or Affymetrix) and shows a rate of ~42.3% of detection at least one pathogenic change and ~38.5% of patients with benign or uncertain clinical significance changes. In assessment of the three techniques concomitantly was observed a rate of ~93.6% of concordance, although the results are not the same in all cases and the MLPA technique to detect ~ 66.2% of the changes in relation to the array. The results obtained corroborated with literature data, but the overall detection rate was higher than the rates described in the literature, due in part to the criteria selection of patients. Our results strongly suggesting that appropriate clinical hypothesis is crucial for successful change detection. Although the array is the most efficient tool for the diagnosis of patients with abnormalities, using this test as a first diagnostic approach is not always the most suitable tool because of the high cost or the limitation to detect inversions and balanced translocations. Therefore, all techniques studied have their advantages and disadvantages, and could be applied together for the completed molecular diagnosis. Thus, a clinical laboratory interaction and multidisciplinary skilled technicians is required for targeting the most effective molecular diagnosis in relation to cost-benefit

O genoma humano é composto por diversos tipos de variações estruturais, como por exemplo, as variações no número de cópias (CNVs), que, mesmo sendo muito pequenas, podem gerar diversas alterações clínicas específicas, como as malformações congênitas e o atraso do desenvolvimento neuropsicomotor (MC/ADNPM). Para a detecção destas alterações existem diferentes técnicas citogenômicas dentre elas a FISH (Fluorescent in situ Hibridization) e a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), que investigam um número limitado de regiões do genoma, como as regiões envolvidas nas síndromes de microdeleções/microduplicações mais comuns e as regiões subteloméricas. Outros métodos como a cariotipagem clássica e o array genômico possibilitam uma análise completa do DNA em uma única reação, aumentando a taxa de detecção de desequilíbrios complexos. Alcançar um diagnóstico inequívoco é fundamental para entender a natureza da doença, fornecendo respostas sobre o prognóstico, sobre os riscos de recorrência e direcionando o paciente à terapia específica, o que pode minimizar o custo financeiro dessas doenças e até mesmo possibilitar a inclusão desses indivíduos na sociedade. O projeto teve como objetivo comparar a capacidade diagnóstica destas tecnologias (FISH, MLPA e array) para a elucidação etiológica de pacientes sindrômicos encaminhados para a unidade de genética. A casuística deste trabalho foi composta pela análise dos resultados das técnicas de FISH e/ou MLPA e array, utilizadas no diagnóstico de 78 pacientes com MC/ADNPM. Na técnica de FISH, empregada na análise genômica de 22 pacientes, foram utilizadas sondas locus específicas para as regiões das principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas de cromossomos específicos. Por meio desta metodologia, foram identificados ~18,2% dos pacientes com diferentes alterações. Já a técnica de MLPA, utilizada no diagnóstico dos 78 pacientes, por meio dos kits para as principais síndromes de microdeleção/microduplicação e para as regiões subteloméricas, detectou ~34,6% de pacientes com diversas alterações. A técnica de array, realizada em todos os pacientes utilizando diferentes plataformas (Agilent, Affymetrix ou Illumina) apresentou uma taxa de ~42,3% de detecção de pacientes com pelo menos uma alteração patogênica e ~38,5% de pacientes com alterações benignas ou de significado clínico incerto. Ao avaliar as três técnicas concomitantemente foi verificada uma taxa de ~93,6% de concordância, apesar dos resultados não serem iguais em todos os casos e da técnica de MLPA não detectar ~66,2% das alterações em relação ao array. Os resultados obtidos corroboraram com dados da literatura, mas no geral a taxa de detecção foi superior às taxas descritas, o em que em parte pode ser devido ao critério de seleção dos pacientes, sugerindo fortemente que a hipótese clínica adequada é crucial para o sucesso da detecção de alteração. Embora o array seja a ferramenta mais eficiente para o diagnóstico de pacientes com malformações, seu uso como primeiro teste diagnóstico nem sempre é o mais apropriado devido ao seu custo elevado ou sua limitação em detectar inversões e translocações balanceadas. Portanto todas as técnicas estudadas têm suas vantagens e desvantagens, e poderão ser aplicadas em conjunto para que o diagnóstico molecular seja concluído. Dessa forma, são necessárias uma interação clínico-laboratorial e uma equipe técnica multiprofissional especializada para o direcionamento do diagnóstico molecular mais eficaz em relação ao custo-benefício / The human genome is composed of several types of structural variations, such as copy number variation (CNVs) which, although very small, can generate several specific clinical abnormalities, such as congenital malformations and developmental delay (CM/DD). To detect these changes there are different cytogenomics techniques, among them, FISH (Fluorescent in situ Hybridization) and MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) that can investigate a limited number of genomic regions for example the most common microdeletion/microduplications syndromes and subtelomeric regions. Other methods such as classical karyotyping and array provide a complete DNA analysis in a single reaction, increasing the detection rate of complex imbalances. Acquire an unequivocal diagnosis is critical to understand the nature of the disease, providing answers about the prognosis, risks of recurrence and directing the patients to specific therapy, which can minimize the cost of these diseases and even allow the inclusion of these individuals in society. The objective of this project was to compare the diagnostic ability of these technologies (FISH, MLPA and array) for the etiologic diagnosis of syndromic patients referred to the clinical unit of genetics. The casuistry was composed by the results of analysis of 78 patients with CM/DD using FISH and/or MLPA and array. The FISH technique was utilized in genomic analysis for 22 patients and locus specific probes were used for regions of the microdeletion/microduplication syndromes and the subtelomeric regions of specific chromosomes. By this methodology ~18.2% of the patients were identified with different genomic changes. The MLPA technique was used in the diagnosis of 78 patients, with microdeletion/microduplication syndrome and subtelomeric regions, and detected ~34.6% of patients with several changes. The array technique was performed in all patients using different platforms (Agilent, Illumina or Affymetrix) and shows a rate of ~42.3% of detection at least one pathogenic change and ~38.5% of patients with benign or uncertain clinical significance changes. In assessment of the three techniques concomitantly was observed a rate of ~93.6% of concordance, although the results are not the same in all cases and the MLPA technique to detect ~ 66.2% of the changes in relation to the array. The results obtained corroborated with literature data, but the overall detection rate was higher than the rates described in the literature, due in part to the criteria selection of patients. Our results strongly suggesting that appropriate clinical hypothesis is crucial for successful change detection. Although the array is the most efficient tool for the diagnosis of patients with abnormalities, using this test as a first diagnostic approach is not always the most suitable tool because of the high cost or the limitation to detect inversions and balanced translocations. Therefore, all techniques studied have their advantages and disadvantages, and could be applied together for the completed molecular diagnosis. Thus, a clinical laboratory interaction and multidisciplinary skilled technicians is required for targeting the most effective molecular diagnosis in relation to cost-benefit