Dans le domaine des machines moléculaires, la recherche d'un système produisant un mouvement orienté fait l'objet d'intenses recherches. Des résultats ont déjà été obtenus en ce sens mais n'exploitant pas le mouvement brownien comme le font les systèmes trouvés dans la nature comme la myosine. Nous proposons donc la synthèse d'une roue à rochet avec pour but de mimer ce phénomène, si besoin avec une activation de faible énergie. La première partie de ce travail a consisté en la conception par modélisation de l'équivalent synthétique d'une roue à rochet, basiquement constituée d'une roue crantée et d'un cliquet en vue d'étudier si une telle molécule pourrait produire une rotation orientée. Ce système est constitué d'un motif bishomoinositol fonctionnalisé en tant que roue et d'un cycloadduit de l'anthracène comme cliquet, liés par des bras espaceurs. La synthèse d'un système modèle dans lequel un motif bicyclo[2.2.2]octane joue le rôle de roue simplifiée a été menée afin de valider les différentes stratégies de synthèse. A cette occasion, une méthode alternative de la synthèse du diacide bicyclo[2.2.2]octanoïque a été mise au point ainsi qu'une méthodologie d'estérification compatible avec cet acide ainsi que le diacide 9,10-anthracènedioïque. Nous sommes ainsi parvenus à obtenir le produit de macrolactonisation, avec de possibles application comme roue de nanovéhicules. La synthèse du modèle a été l'occasion de pointer certaines impossibilités synthétiques au niveau des espaceurs (éthers, amides, triazoles, tétrazoles, alcènes) dans le système original. Un nouveau travail de modélisation a permis d'aboutir à une cible accessible synthétiquement conservant le comportement de roue à rochet. Dans cette optique, la synthèse du bishomoinositol fonctionnalisé par des acides en tête de pont a été entreprise par une première voie incluant ces groupements au départ de la synthèse, une seconde voie introduisant ces groupements en fin de séquence. / In the field of molecular machines, systems producing an oriented motion have been intensely looked for. Results, obtained toward this goal, do not exploit Brownian motion whereas it happens in natural systems such as myosin. Hereby we propose the synthesis of a molecular ratchet aiming to mimic this phenomenon or to be able to act as a molecular motor through low energy activation. The first part of this work consisted in the design by modelisation of a synthetic equivalent of a ratchet, basically consisting of a toothed wheel and a pawl. This study aim at determining if such a molecule could produce an oriented motion by simple Brownian motion. This system is consisting of a functionalized bishomoinositol moiety as the wheel and a cycloadduct of anthracene as the pawl, linked by spacers allowing the adjustment of the energy barriers. The synthesis of a model where a bicyclo[2.2.2]octane moiety plays the role of a simplified wheel has been conducted in order to validate various synthetic strategies. This gave the opportunity to develop an alternative method of the synthesis of the bicyclo[2.2.2]octanedicarboxylic diacid as well as an esterification methodology compatible with the bulkiness or low solubility of both partners. The macrolactonization product could be obtained and opens some possible applications as nanovehicle wheels. The synthesis of the model was the occasion to highlight synthetic limitations concerning the spacers (ethers) in the original system. A new series of targets taking into account the synthetic restrictions while keeping the ratchet behavior were designed. The discovery of another synthetic difficulties (amides, triazoles, tetrazoles and alkenes) yielded a single refined target. Toward this goal, the synthesis of the bishomoinositol functionalized in the bridgehead position was engaged in a first pathway including these functions at the beginning of the synthesis, the second way introducing them on the bishomoinositol at the end of the sequence.

Comment les cellules eucaryotes remodèlent constamment leur espace intracellulaire est l'un des phénomènes auto-organisés les plus étonnants dans la nature. Pour ce faire, ces cellules exploitent la diffusion brownienne des macromolécules et cargos sur de petites échelles d’espace combinée avec des phénomènes de transport actif le long des filaments du cytosquelette entraînées par des protéines motrices.Malgré l'effort important de la communauté physico-mathématique sur ces problématiques biologiques, il est encore très difficile de rationaliser le mouvement des organites (et en général de la matière) à l'intérieur de la cellule.Dans cette thèse, nous abordons ce problème en généralisant l'analyse théorique d'un modèle physico-mathématique paradigmatique du transport hors-équilibre de protéines motrices (appelé TASEP) afin d'étudier l'impact d'un volume fini et d’une concentration finie de moteurs sur leur distribution dans le cytosol et le long du cytosquelette. En particulier, cela nécessite d'inventer une nouvelle méthodologie afin de résoudre ce problème où le mouvement de diffusion des moteurs dans le cytoplasme est couplé avec le transport collectif et dirigé de ces mêmes moteurs le long d'un ou plusieurs filaments du cytosquelette. De nouveaux phénomènes et régimes intéressants apparaissent par rapport aux études récentes apparus dans la littérature. En outre, la méthodologie développée ici, permet une analyse rapide et efficace des comportements de ces systèmes complexes pour lesquels la simulation numérique peut être longue en temps.La thèse est organisée comme suit. Le premier chapitre est consacré à l’introduction au sujet et à la définition des notions biologiques et physiques nécessaires pour le travail de recherche présenté ensuite.Le deuxième chapitre aborde une solution approchée pour le cas de transport réalisé sur un seul filament cytosquelettique plongé dans le cytosol, où le volume fini et la concentration finie de moteurs modifient qualitativement et quantitativement les diagrammes de phase décrivant la densité moyenne et le flux de moteurs le long du filament. Nous discutons ensuite les conditions physiques pour lesquels cette solution approchée n’est plus valable. Pour surmonter cette difficulté, dans le chapitre trois, nous décrivons une nouvelle méthode, inspirée par la « méthode des images » pour calculer les solutions de l'équation de Poisson en électrostatique, qui permet pour la première fois (à notre connaissance) de calculer analytiquement la distribution de moteurs qui diffusent en volume, c.à.d. le cytosol, sans aucune hypothèse d’approximation. En particulier, le procédé peut être facilement généralisé à tout type de distribution ou réseau de filaments et à plusieurs mécanismes de transport collectif le long des filaments. Cela permet d’explorer ainsi des régimes et des phénomènes nouveaux qui peuvent difficilement être étudiées par des simulations stochastiques en raison de la complexité des processus et de l'extension spatiale du système. Le chapitre quatre se concentre sur cette méthodologie innovante de calcul. Le chapitre cinq discute d’une variété de problèmes ouverts ainsi que d’ouvertures liées au thème étudié. Nous terminons cette thèse avec des conclusions générales se concentrant sur les implications physiques, biophysiques et biologiques de l’étude effectué.Les nombreux résultats obtenus ont un impact sur notre compréhension générale des processus de transport complexe, collectif et non-linéaire dans des phénomènes et situations où les moteurs peuvent se déplacer parmi des espaces avec des différentes dimensions physiques, avec des implications intéressantes pour la biologie, la mécanique statistique des systèmes hors-équilibre thermodynamique, de la théorie physico-mathématique du trafic et de la logistique. / How cells constantly remodel their intracellular space is one of the most astonishing self-organized phenomena in Nature. In order to do that, eukaryotic cells exploit the Brownian diffusion of macromolecules or organelles on small scales combined with active transport phenomena along cytoskeletal filament driven by motor proteins. Despite the important effort in the physico-mathematical community working on these biological issues, it is still very difficult to rationalize the motion of organelles (and in general of matter) inside the cell. In this thesis, we approach this problem by generalizing the theoretical analysis of a paradigmatic physico-mathematical model of non-equilibrium transport of motor proteins (called TASEP) to study the impact that a finite volume and a finite concentration of transporters have on their distribution in the cytosol and along the cytoskeleton. In particular, this requires inventing a new methodology in order to solve the problem where diffusive motion or transporters in the cytoplasm is coupled with directed collective transport along one or many cytoskeletal filaments. New interesting phenomena and regimes appear with respect to recent studies in literature. Moreover, the methodology developed so far, allow a fast and efficient investigation of complex systems behaviors for which numerical simulation can result very time consuming.The thesis is organized as follows. The first chapter is dedicated to an introduction on the topic and to the definition of biological and physical notions necessary for the research work presented. The second chapter tackles an approximate solution for the case of directed transport on a single cytoskeletal filament embedded in the cytosol, where the finite volume and the finite concentration of particles modify qualitatively and quantitatively the phase diagrams describing the average density and flux of transporters along the filament. We then discuss the physical conditions for which this approximated solution is no more valid. In order to overcome this difficulty, in chapter three we describe a novel method, inspired by the “images-method” to compute solutions of the Poisson equation in electrostatics, which allows for the first time (at our knowledge) to compute analytically the distribution of transporters in volume, i.e. the cytosol, without any approximated assumption. Importantly, the method can be easily generalized to any kind distribution or network of filaments and to other mechanisms of collective transport along the filaments. This makes possible to explore stationary regimes and new phenomena that can be hardly studied by stochastic simulations due to the complexity of the processes and the spatial extension of the system. Chapter four focuses on the innovative methodology of computation. Chapter five discusses miscellanea of problems and openings related to the topic studied. We end this thesis with general conclusions focusing on physical, biophysical and biological implications.The various results obtained have an impact on our general understanding on complex, collective and non-linear transport processes in situations and phenomena where transporters can move in spaces with different physical dimensions with interesting implications for biology, non-equilibrium statistical mechanics and the physico-mathematical theory of traffic and logistics.

The RNA polymerase T7 is utilized as a component of motor complexes in DNA nanotechnology due to its high promotor specificity, the lack of external transcription factors and its very high processivity, but there is no experience of its application on small double stranded DNA circles. Circular templates from 210 to 126 bp in circumference sharing a common promotor termination motif were synthesized and transcription was monitored at end point on gel and in real time with a 2’ O methyl RNA molecular beacon. The RNAP T7 was found to be able to utilize circular dsDNA templates down to 126 bp with moderate impact on transcription rate for saturated systems and rolling circle transcription products were evident with denaturizing PAGE gel electrophoresis for templates down to 167 bp.

Le trafic intracellulaire consiste en la formation et le transport de vésicules ou tubules qui acheminent des composants protéiques et lipidiques entre les différents organites ou avec la membrane plasmique. L’élaboration de ces tubulo-vésicules est initiée par le remodelage local d’une membrane, tout d’abord en générant une courbure puis un bourgeon qui, s’allongeant, forme la tubulo-vésicule. Enfin, la rupture de la membrane, ou scission, libère le transporteur nouvellement formé. Ces étapes repose sur un sculptage profond de la membrane. Ceci requière des forces générées par des moteurs moléculaires, lesquels s’associent aux cytosquelettes comme les microtubules ou les filaments d’actine. Afin de mieux comprendre comment le cytosquelette et leurs moteurs façonnent ces transporteurs, nous avons examiné le rôle de l’actine et de la myosine VI dans la formation de tubules membranaires aux mélanosomes. Les mélanosomes sont des organites apparentés aux lysosomes, générés dans les mélanocytes de la peau et de la choroïde de l’œil, et qui sont le lieu de synthèse et de stockage d’un pigment, la mélanine. Dans l’épiderme, ces compartiments spécialisés évoluent par différentes étapes de maturation qui aboutissent à leurs transferts aux cellules voisines, les kératinocytes. Les mélanosomes sont des organites dynamiques qui reçoivent et recyclent constamment des composants membranaires, comme la SNARE VAMP7. Nous résultats montrent que la myosine VI et son adapteur optineurine se localisent à un sous-domaine spécifique de la membrane des mélanosomes, ou elles contrôlent la scission de tubules. En effet, l’activité motrice de la myosine VI et le réseau d’actine branchée, dépendant des complexes Arp2/3 et WASH, permettent la constriction des membranes du tubule et son détachement du mélanosome. Un défaut de scission de ces tubes engendre des mélanosomes plus pigmentés, enrichis en cargos et au pH plus acide. L’altération de l’homéostasie du mélanosome affecte sa fonction, comme sa capacité à être sécrété et transféré aux kératinocytes. Nos résultats démontrent que la myosine VI en coopération avec le cytosquelette d’actine permet la constriction et fission de membranes aux mélanosomes. Les intermédiaires de transport ainsi formés recyclent des protéines cargos pour leur possible réutilisation, et participent ainsi au maintien de l’homéostasie et de la fonction de ces organites. / Intracellular transport among organelles and the plasma membrane occurs through the formation and transport of vesicular and tubular membrane carriers. The formation of these carriers requires first the bending of membrane and the generation of a bud, followed by its elongation to form the tubule-vesicle. Lastly, the carrier is released from the membrane source by the scission of the membrane. Importantly, all these different steps need an accurate orchestration to properly deform the membrane. The actions exerted by molecular motors onto microtubule and actin cytoskeletons provide forces onto membrane that contribute to its remodeling during the biogenesis of carrier. Actin filaments (F-actin) and myosins are thought to participate in the initiation and the fission of carriers. However, the role of actin machinery during carrier biogenesis remains elusive. We thus decided to address the role of F-actin and the actin-based motor myosin VI in the formation of tubular intermediates at melanosome. Melanosomes are lysosome-related organelles of skin melanocytes and eye pigment cells that function in the synthesis and storage of the melanin pigment. Melanosomes originate from endosomes and progressively mature into fully pigmented compartments, which fate is to be secreted and transferred to neighboring keratinocytes. Melanosomes are dynamic organelles that constantly receive, but also recycle proteins such as the SNARE VAMP7 through the formation and release of tubular intermediates. Our work reveals that myosin VI, together with Arp2/3- and WASH-mediated branched actin localize at specific melanosomal subdomains where they promote the constriction and scission of tubular intermediates. This fission event allows the export of components such as VAMP7 from melanosomes and promotes their maturation and subsequent transfer to keratinocytes. Altogether, our results uncover a new role for myosin VI and F-actin in the constriction and scission of membrane tubules at melanosome that is required for organelle homeostasis and function.

Les travaux présentés dans cette thèse peuvent être divisés en deux parties. Dans une première partie, nous avons étudié le processus de photoisomérisation dans plusieurs systèmes. Une analyse de structure électronique accompagnée d’un calcul préliminaire de dynamique semi-classique ont été appliqué à un modèle minimal du rétinal afin d’extraire les degrés de libertés les plus importants lors de l’isomérisation. Cela dans le but de construire des surfaces d’énergie potentielle diabatiques pour effectuer une étude de dynamique quantique. Une approche de type dynamique semi-classique a été appliquée à un modèle de moteur moléculaire dans le but d’étudier l’origine de l’uni-directionalité de sa rotation. Finalement, une étude de structure électronique d’un complexe de Rhénium contenant un ligand de type rétinal a été effectué pour étudier l’influence du métal sur la spectroscopie du ligand rétinal. Dans une deuxième partie nous nous sommes intéressés à l’étude des croisements intersystème dans un complexe de Rhénium. Afin de pouvoir apporter une explication à un comportement contrintuitif de ce complexe, nous avons développé un Hamiltonien modèle capable de tenir compte des couplages vibroniques interétats et spin-orbit. Cet Hamiltonien a été testé sur ce-dit système, et nous a permis, grâce à une étude de structure électronique de proposer un mécanisme de relaxation différent de celui proposé expérimentalement. / This thesis can be divided in two parts.In the first one, we have studied the photoisomerization process in several systems. An electronic structure analysis mixed with a preliminary semi-classical dynamics investigation has been applied to a minimal model of the retinal chromophore in order to select the most important degrees of freedom involved in the process. The goal of this is to build diabatic potential energy surfaces in order to conduct quantum dynamics simulations. A semi-classical approach has also been applied to a molecular motor model to study the origin of the unidirectionality of its rotary motion. Finally, an electronic structure of a rhenium complex with a retinal-like ligand has been performed to study the effect of the coordination to a metallic atom on the spectroscopy of the retinal ligand. In the second part, we have investigated the intersystem crossings in a rhenium complex. In order to bring an explanation to an experimentally observed conterintuitive behavior of this complex, we have developed a model Hamiltonian that includes both interstate vibronic coupling and spin-orbit coupling. This Hamiltonian has been tested on the said complex and, in complement to an electronic structure study, allowed us to formulate a decay mechanism different from the one proposed based on experiments.

F₁-ATPase, the sector of ATP synthase where the synthesis of cellular ATP occurs, is a rotary molecular motor in its own right. Driven by ATP hydrolysis, direct observation of the rotation of the central axis within single molecules of F₁ is possible. Operating at close to 100% efficiency, F₁ from thermophilic Bacillus has been shown to produce ~40pN˙nm of torque during rotation. This thesis details the groundwork required for the direct measurement of the torque produced by F₁ using a rotary angle clamp, an optical trapping system specifically designed for application to rotary molecular motors. Proof-of-concept experiments will be presented thereby demonstrating the ability to directly manipulate single F₁ molecules from Escherichia coli and yeast mitochondria (Saccharomyces cerevisiae), along with activation of F₁ out of its inhibited state by the application of external torque. Despite in-depth knowledge of the rotary mechanism of F₁ from thermophilic Bacillus, the rotation of F₁ from Escherichia coli is relatively poorly understood. A detailed mechanical characterization of E.coli F₁ will be presented here, with particular attention to the ground states within the catalytic cycle, notably the ATP-binding state, the catalytic state and the inhibited state. The fundamental mechanism of E.coli F₁ appears to depart little from that of F₁ from thermophilic Bacillus, although, at room temperature, chemical processes occur faster within the E.coli enzyme, in line with considerations regarding the physiological conditions of the different species. Also presented here is the verification of the rotary nature of yeast mitochondrial F₁. The torque produced by F₁ from thermophilic Bacillus, E.coli and yeast mitochondria is the same, within experimental error, despite their diverse evolutionary and environmental origins.