Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Maria Carolina Scatolin do Rio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:38:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_GleidsonSilva_D.pdf: 5340667 bytes, checksum: a5eb7198bd79e4c57ea6ac55d5742b85 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo hemibiotrofico Moniliophthora perniciosa, e uma das principais doenças que acometem o cacaueiro (Theobroma cacao L.). Durante a fase biotrófica, o patôgeno coloniza o espaço intercelular e estimula a formação de ramos hipertróficos denominados vassoura verde. No estagio avançado da doença, o fungo passa a colonizar também o interior das células e observa-se a morte do tecido originando a vassoura seca. A semelhança destes sintomas aos observados em outras fitopatologias sugere um desequilíbrio hormonal em resposta a infecção. Neste contexto, este trabalho apresenta um estudo integrado dos genes relacionados a diferentes hormônios vegetais e uma caracterização dos genes relacionados às citocininas. A possível participação dos hormônios no estabelecimento e na progressão da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro e discutida. Dados de RNA-seq foram gerados durante as diferentes fases da interação. Em seguida, genes diferencialmente expressos foram classificados de acordo com a terminologia do Gene Ontology. Além disso, a capacidade de biossíntese de citocininas pelo fungo M. perniciosa foi avaliada através do teste de complementação utilizando a levedura TM128 sln1?. Em paralelo, foi realizada uma caracterização detalhada dos genes que constituem o mecanismo de percepção de citocininas em cacau, sistema denominado two-component. Genes relacionados às respostas hormonais e de defesa foram os mais representados entre o grupo de diferencialmente expressos. Durante a fase assintomática, e observada a indução de genes relacionados a auxinas e etileno. Por outro lado, no estagio avançado, foram identificados genes relacionados à degradação de citocininas e as respostas de defesa mediadas por acido salicílico e jasmonato/etileno. Paralelamente, foi identificado no M. perniciosa um gene para a síntese de citocininas, entretanto, a funcionalidade deste não foi confirmada. Em T. cacau, a arquitetura do sistema two-component e similar a encontrada em Arabidopsis sp., porem, nenhuma alteração significativa na expressão dos genes que constituem este sistema foi identificada. Por essa razão, não foi possível estabelecer uma relação clara entre as citocininas e os sintomas da Vassoura-de-bruxa. Contudo, o padrão de expressão de genes relacionados à homeostase de auxinas, sugere uma regulação negativa das respostas de defesa contra patogenos biotroficos durante fase inicial da doença / Abstract: The Witches' Broom disease, caused by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, is the major disease affecting cacao (Theobroma cacao L.). During its biotrophic phase, the pathogen colonizes the intercellular space and stimulates the formation of hypertrophic branches called green broom. In the advanced stage of the disease, the fungus starts also to colonize the interior of the cells and it is noted the death of tissue originating the dry broom. The similarity of these symptoms to those observed in other plant diseases suggests a hormonal imbalance in response to the infection. In this context, this work presents an integrated study of plant hormone-related genes and a characterization of cytokinin-related genes. The possible participation of these genes in the establishment and progression of Witches' Broom in cacao is discussed. RNA-seq data regarding different phases of the interaction were generated. After this, differentially expressed genes were classified according to Gene Ontology terminology. Furthermore, the ability of cytokinin biosynthesis by M. perniciosa was assessed by a complementation test using the yeast TM128 sln1?. In parallel, we performed a detailed characterization of genes that constitute the mechanism of perception of cytokinins in cacao, the two-component system. For these, the gene expression values have been accessed through the previously generated RNA-seq data. Defense and hormone-related genes were the most represented among the differentially expressed genes. During asymptomatic phase, we observe the induction of auxin and ethylene-related genes. During the symptomatic stage, genes related to the degradation of cytokinins and defense responses mediated by salicylic acid and jasmonate/ethylene was identified. Simultaneously, a putative gene for the synthesis of cytokinins was identified in M. perniciosa genome; however, the participation of this gene in cytokinin synthesis was not confirmed. In T. cocoa, the architecture of two-component system is similar to that one found in Arabidopsis sp.; however, no significant change in the expression of genes that constitute this system was identified. For this reason, it was not possible to establish a clear relationship between cytokinins and the symptoms of the Witches' Broom disease. Moreover, the expression pattern of homeostasis auxin-related genes suggests a negative regulation of defense responses against biotrophic pathogens during the initial stage of the disease / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A vassoura-de-bruxa consiste numa importante enfermidade do cacaueiro (Theobroma cacao), causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa e caracterizada pelos sintomas de inchamento e indução de brotações laterais nos ramos infectados. O mecanismo de resistência do cacaueiro a M. perniciosa ainda é desconhecido e o longo ciclo de vida da espécie dificulta o seu estudo. Isolados do biótipo-S do patógeno infectam o tomateiro (Solanum lycopersicum), cuja cultivar miniatura \'Micro-Tom\' (MT) consiste num potencial modelo genético para o estudo da interação. A avaliação desse modelo foi iniciada com a caracterização sintomatológica de MT à inoculações com isolados de M. perniciosa do biótipo-S. Os sintomas avaliados nas plantas infectadas foram engrossamento do caule e desenvolvimento de \'vassouras laterais\'. Na caracterização histopatológica da interação MT e M. perniciosa por microscopia eletrônica de varredura foi observada a germinação preferencial de basidiósporos na base dos tricomas com pontos de penetração através de ferimentos e diretamente pela epiderme. Foi observado por microscopia óptica, aumento no volume celular de plantas infectadas e, a microscopia eletrônica de transmissão detectou a colonização da região intercelular pelo fungo com formação de matriz extracelular envolvendo a hifa. A contribuição dos hormônios vegetais na patogênese foi avaliada por meio de mutantes e plantas transgênicas no background \'Micro-Tom\' com alterações nas vias de biossíntese ou percepção hormonal. As classes hormonais e genótipos avaliados foram brassinosteróide (curl3), auxina (diagiotropica), etileno (epinastic e Never ripe), ácido abscísico (notabilis) giberelina (procera), ácido jasmônico (jasmonic acid insensitive 1e prosistemina), citocinina (CKX2) e ácido salicílico (NahG). Os genótipos que se mostraram mais susceptíveis a infecção por M. perniciosa avaliado por taxa de infecção de plantas, quando comparados ao MT foram epinastic, notabilis, procera e jasmonic acid insensitive 1, sendo que os restantes foram menos susceptíveis, sugerindo que possivelmente a redução da susceptibilidade à M. perniciosa relaciona-se ao aumento nos níveis de jasmonato (JA), em contraponto com o ácido salicílico (AS), que quando em níveis elevados parece aumentar o número de plantas sintomáticas. A infecção cruzada por isolados do biótipo-C foi caracterizada em MT, mutantes hormonais e transgênicos, contudo não foi possível observar sintomas em nenhum genótipo. A interação entre M. perniciosa do biótipo-S e -C e MT foi avaliada por expressão de genes envolvidos na resposta de defesa da planta por RT-qPCR. Após a inoculação com o biótipo-S, o maior número desses genes apresentou acúmulo de transcritos 48 h após a inoculação, seguido do momento a 120 h. Em contrapartida, nas inoculações com o biótipo-C, a indução dos genes deu-se no período de 48 h, porém a resposta atingiu os maiores níveis de expressão 72 h após a inoculação. Mutantes hormonais (jasmonic acid insensitive 1 e curl3) e plantas transgênicas (prosistemina e NahG) também foram avaliados para expressão de genes ligados a resposta de defesa das plantas por RT-qPCR. Os dois genótipos transgênicos que se mostraram menos susceptíveis, demonstraram a expressão de um inibidor de proteinase sinalizado pela via de JA, corroborando a hipótese que a redução no número de plantas com infecção por M. perniciosa esteja ligada a ativação da via do ácido jasmônico / Witches\' broom disease is a major disease of cacao (Theobroma cacao), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, characterized by symptoms, such as tissue swelling and induction of lateral buds in infected branches. Cacao resistance mechanisms against M. perniciosa remain unknown, and the long lifecycle of such species impairs the study of the interaction. Moniliophthora perniciosa S-biotype- isolates infect tomato (Solanum lycopersicum), and the miniature cultivar \'Micro-Tom\' (MT) is a potential genetic model for the study of plant and pathogen interaction. Evaluation of this model started with the characterization of symptoms in MT plants inoculated with S-biotype isolates. Symptoms evaluated were stem swelling and the development of lateral broom. Through histological characterization of the interaction by scanning electron microscopy, it was possible to observe the preferential germination of basidiospores in the base of trichomes, with penetration points through wounds or directly through the epidermis. Increase in cellular volume in infected tissues was observed by light microscopy, and the colonization of the intercellular region by the fungus was detected through transmission electron microscopy, with the formation of an extracellular matrix involving the hypha. The contribution of plant hormones during pathogenesis was evaluated through the use of mutants and transgenic plants on the \'Micro-Tom\' background with alterations in hormonal biosynthetic pathways or perception/signaling. The hormonal classes and genotypes evaluated were for brassinosteroids (curl3), auxin (diageotropica), ethylene (epinastic and Never ripe), abiscisic acid (notabilis); gibberellin (procera); jasmonic acid (jasmonic acid insensitive 1e prosistemina); cytokinins (CKX2) and silicic acid (NahG). The genotypes epinastic, notabilis, procera e jasmonic acid insensitive 1 behaved as being more susceptible to M. perniciosa infection when compared to MT, while the remaining mutants were less susceptible, suggesting that the reduction in susceptibility to M. perniciosa might be related to the increase in jasmonate levels (JA), in the opposite to the levels of salicylate, which seems to increase together with the increase of symptomatic plants. Cross infection with biotype-C isolates was characterized in MT, hormonal mutants and transgenic plants, however typical symptoms of the disease were not observed in any of the genotypes inoculated. Genes involved in plant response and defense were evaluated for expression levels by RT-qPCR in the interaction between M. perniciosa S-and C-biotype with MT . After inoculation with S-biotype, the largest number of genes were up-regulated 48 h after inoculation, followed by a peak at the 120 h sampling. On the other hand, for C-biotype inoculation, gene induction started 48 h after inoculation, but the largest number of transcripts was detected after 72 hours. Hormonal mutants (jasmonic acid insensitive 1 and curl3) and transgenic plants (prosistemina and NahG) were also assessed for expression levels of genes related to plant response and defense. Both transgenic genotypes which behaved less susceptible to the disease showed up-regulation of a proteinase inhibitor typically signaled by JA pathway, corroborating the hypothesis that the reduction of the number of plants infected by M. perniciosa may be related to the jasmonic acid pathway

A vassoura-de-bruxa consiste numa importante enfermidade do cacaueiro (Theobroma cacao), causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa e caracterizada pelos sintomas de inchamento e indução de brotações laterais nos ramos infectados. O mecanismo de resistência do cacaueiro a M. perniciosa ainda é desconhecido e o longo ciclo de vida da espécie dificulta o seu estudo. Isolados do biótipo-S do patógeno infectam o tomateiro (Solanum lycopersicum), cuja cultivar miniatura \'Micro-Tom\' (MT) consiste num potencial modelo genético para o estudo da interação. A avaliação desse modelo foi iniciada com a caracterização sintomatológica de MT à inoculações com isolados de M. perniciosa do biótipo-S. Os sintomas avaliados nas plantas infectadas foram engrossamento do caule e desenvolvimento de \'vassouras laterais\'. Na caracterização histopatológica da interação MT e M. perniciosa por microscopia eletrônica de varredura foi observada a germinação preferencial de basidiósporos na base dos tricomas com pontos de penetração através de ferimentos e diretamente pela epiderme. Foi observado por microscopia óptica, aumento no volume celular de plantas infectadas e, a microscopia eletrônica de transmissão detectou a colonização da região intercelular pelo fungo com formação de matriz extracelular envolvendo a hifa. A contribuição dos hormônios vegetais na patogênese foi avaliada por meio de mutantes e plantas transgênicas no background \'Micro-Tom\' com alterações nas vias de biossíntese ou percepção hormonal. As classes hormonais e genótipos avaliados foram brassinosteróide (curl3), auxina (diagiotropica), etileno (epinastic e Never ripe), ácido abscísico (notabilis) giberelina (procera), ácido jasmônico (jasmonic acid insensitive 1e prosistemina), citocinina (CKX2) e ácido salicílico (NahG). Os genótipos que se mostraram mais susceptíveis a infecção por M. perniciosa avaliado por taxa de infecção de plantas, quando comparados ao MT foram epinastic, notabilis, procera e jasmonic acid insensitive 1, sendo que os restantes foram menos susceptíveis, sugerindo que possivelmente a redução da susceptibilidade à M. perniciosa relaciona-se ao aumento nos níveis de jasmonato (JA), em contraponto com o ácido salicílico (AS), que quando em níveis elevados parece aumentar o número de plantas sintomáticas. A infecção cruzada por isolados do biótipo-C foi caracterizada em MT, mutantes hormonais e transgênicos, contudo não foi possível observar sintomas em nenhum genótipo. A interação entre M. perniciosa do biótipo-S e -C e MT foi avaliada por expressão de genes envolvidos na resposta de defesa da planta por RT-qPCR. Após a inoculação com o biótipo-S, o maior número desses genes apresentou acúmulo de transcritos 48 h após a inoculação, seguido do momento a 120 h. Em contrapartida, nas inoculações com o biótipo-C, a indução dos genes deu-se no período de 48 h, porém a resposta atingiu os maiores níveis de expressão 72 h após a inoculação. Mutantes hormonais (jasmonic acid insensitive 1 e curl3) e plantas transgênicas (prosistemina e NahG) também foram avaliados para expressão de genes ligados a resposta de defesa das plantas por RT-qPCR. Os dois genótipos transgênicos que se mostraram menos susceptíveis, demonstraram a expressão de um inibidor de proteinase sinalizado pela via de JA, corroborando a hipótese que a redução no número de plantas com infecção por M. perniciosa esteja ligada a ativação da via do ácido jasmônico / Witches\' broom disease is a major disease of cacao (Theobroma cacao), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, characterized by symptoms, such as tissue swelling and induction of lateral buds in infected branches. Cacao resistance mechanisms against M. perniciosa remain unknown, and the long lifecycle of such species impairs the study of the interaction. Moniliophthora perniciosa S-biotype- isolates infect tomato (Solanum lycopersicum), and the miniature cultivar \'Micro-Tom\' (MT) is a potential genetic model for the study of plant and pathogen interaction. Evaluation of this model started with the characterization of symptoms in MT plants inoculated with S-biotype isolates. Symptoms evaluated were stem swelling and the development of lateral broom. Through histological characterization of the interaction by scanning electron microscopy, it was possible to observe the preferential germination of basidiospores in the base of trichomes, with penetration points through wounds or directly through the epidermis. Increase in cellular volume in infected tissues was observed by light microscopy, and the colonization of the intercellular region by the fungus was detected through transmission electron microscopy, with the formation of an extracellular matrix involving the hypha. The contribution of plant hormones during pathogenesis was evaluated through the use of mutants and transgenic plants on the \'Micro-Tom\' background with alterations in hormonal biosynthetic pathways or perception/signaling. The hormonal classes and genotypes evaluated were for brassinosteroids (curl3), auxin (diageotropica), ethylene (epinastic and Never ripe), abiscisic acid (notabilis); gibberellin (procera); jasmonic acid (jasmonic acid insensitive 1e prosistemina); cytokinins (CKX2) and silicic acid (NahG). The genotypes epinastic, notabilis, procera e jasmonic acid insensitive 1 behaved as being more susceptible to M. perniciosa infection when compared to MT, while the remaining mutants were less susceptible, suggesting that the reduction in susceptibility to M. perniciosa might be related to the increase in jasmonate levels (JA), in the opposite to the levels of salicylate, which seems to increase together with the increase of symptomatic plants. Cross infection with biotype-C isolates was characterized in MT, hormonal mutants and transgenic plants, however typical symptoms of the disease were not observed in any of the genotypes inoculated. Genes involved in plant response and defense were evaluated for expression levels by RT-qPCR in the interaction between M. perniciosa S-and C-biotype with MT . After inoculation with S-biotype, the largest number of genes were up-regulated 48 h after inoculation, followed by a peak at the 120 h sampling. On the other hand, for C-biotype inoculation, gene induction started 48 h after inoculation, but the largest number of transcripts was detected after 72 hours. Hormonal mutants (jasmonic acid insensitive 1 and curl3) and transgenic plants (prosistemina and NahG) were also assessed for expression levels of genes related to plant response and defense. Both transgenic genotypes which behaved less susceptible to the disease showed up-regulation of a proteinase inhibitor typically signaled by JA pathway, corroborating the hypothesis that the reduction of the number of plants infected by M. perniciosa may be related to the jasmonic acid pathway

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2015-07-27T21:18:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertac?o Jos? Jorge Silva Junior.pdf: 3038189 bytes, checksum: be43dcbd4f764e08ab18fd95a388e950 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-27T21:18:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertac?o Jos? Jorge Silva Junior.pdf: 3038189 bytes, checksum: be43dcbd4f764e08ab18fd95a388e950 (MD5) Previous issue date: 2014-07-31 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Pests are responsible for high losses in cocoa production in Brazil and other countries, among them the witches' broom (WB) is one of the most important and destructive to the cocoa, even causing losses of up to 95% of production. This plague has spread very easily in the state of Bahia due to environmental conditions that provided the spread of WB, caused by the fungus Moniliophthora pernicious. Several chemical compounds have been tested in order to prevent or eradicate WB, however it has not showed good results, so the present study aimed to perform in silico assays were obtained in order to identify inhibitors of UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UNAcP) of M. perniciosa. For achieve this goal, computational methods have been employed in the search for new inhibitors for UNAcP where different stages of research and evaluation were performed. The initial stage of virtual screening consisted of the choice of the scoring function, thus the following scoring functions were evaluated: Broyden Fletcher Goldfarb Shanno (BFGS) present in AutoDock VINA 1.1.2; Grid and Grid Score Score+Hawkins GB/SA both present in DOCK 6.5 and calculate the consensus score. The results were analyzed by calculating Enrichment Factor (EF) analysis of the ROC curve and its respective Area under an ROC curve (AUC). The Grid Score presented EF(5)=7.85. The ROC curve analysis allowed us to observe that the Grid Score function can identify almost 40% of active molecules with less than 10% of the database (false positive and active molecules), AUC analysis demonstrated that the Grid Score has greater accuracy (AUC=0.87). Thus, these results showed what the Grid Score was the best scoring function for this system. A database composed of molecules derived from natural sources was also used. The top ten results of virtual screening of the DOCK6.5 underwent online platform ChemGPS-NP, for the calculation of chemical descriptors. Thus, the molecules were re-categorized, based on the values of the Grid Score DOCK6.5 and chemical descriptors ChemGPS-NP. The results indicate the ZINC68592326 molecule his the best score and the analysis indicates that this has hydrophobic interactions with Ala380, Gln113, Gly112, Gly381, Ser168, Arg383, Pro221 and hydrogen bond interaction (3.32?) with Asn224. The virtual screening database of molecules derived from natural products research allowed with a universe of structures with very different characteristics. It was possible to obtain molecules with great structural diversity between the top ranking, however, also found very similar to the reference molecules. The use of chemometric methods is considered very useful and allows a systematic and consistent choice of structures, mainly by taking into account chemical descriptors and molecular characteristics, allowing for a more detailed evaluation. / Pragas s?o respons?veis por elevadas perdas na produ??o de cacau no Brasil e no mundo, dentre elas a vassoura-de-bruxa (VB) ? uma das mais importantes e destrutivas para o cacaueiro, chegando a causar perdas de at? 95% da produ??o. Essa praga disseminou-se muito facilmente no estado da Bahia devido a condi??es ambientais que proporcionaram a propaga??o da VB, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa. Diversos compostos qu?micos v?m sendo testados com o objetivo de prevenir ou erradicar a VB, por?m n?o foram obtidos bons resultados, portanto, o presente trabalho teve como principal objetivo realizar ensaios in silico, a fim de identificar inibidores da UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UNAcP) do M. perniciosa. Para tanto, foram empregados m?todos computacionais na busca de novos inibidores para a UNAcP, onde foram realizadas diferentes etapas de busca e avalia??o. A etapa inicial da triagem virtual consistiu na escolha da fun??o de pontua??o, assim, foram avaliadas as seguintes fun??es de pontua??o: Broyden?Fletcher?Goldfarb?Shanno (BFGS) presente no AUTODOCK VINA 1.1.2; Grid Score e Grid Score+Hawkins GB/SA ambos presentes no DOCK 6.5 e o c?lculo do escore de consenso. Os resultados foram analisados atrav?s do c?lculo de Fator de Enriquecimento (FE), analise da curva ROC e sua respectiva ?rea Sobre a Curva (AUC). O Grid Score apresentou FE(5)=7,85. A an?lise da curva ROC permitiu observar que a fun??o Grid Score consegue identificar quase 40% das mol?culas ativas com menos de 10% do banco de dados (mol?culas ativas e falso positivos), a an?lise da AUC demonstrou que o Grid Score tem maior exatid?o (AUC=0,87). Assim os resultados da avalia??o apontaram o Grid Score como melhor fun??o de pontua??o para esse sistema. Foi utilizado um banco de dados composto por mol?culas oriundas de fontes naturais. Os dez melhores resultados da triagem virtual feita no DOCK6.5 foram submetidos ? plataforma on line ChemGPS-NP, para o c?lculo dos descritores qu?micos. Assim, as mol?culas foram recategorizadas, baseando-se nos valores do Grid Score do DOCK6.5 e descritores qu?micos do ChemGPS-NP. Os resultados apontaram a mol?cula ZINC68592326 com a melhor pontua??o, a an?lise das intera??es intermoleculares indica que est? mol?cula apresenta intera??es hidrof?bicas com os res?duos Ala380, Gln113, Gli112, Gli381, Ser168, Arg383, Pro221 e liga??o de hidrog?nio do tipo aceptora com dist?ncia de 3,32? com o res?duo Asn224. A triagem virtual em banco de dados de mol?culas oriundas de produtos naturais permitiu a investiga??o com um universo de estruturas com caracter?sticas muito diversas. Foi poss?vel obter mol?culas com grande diversidade estrutural entre os primeiros do ranking, por?m, foram encontradas tamb?m mol?culas muito similares ?s mol?culas de refer?ncia. A utiliza??o de m?todos quimiom?tricos, ? considerada muito ?til e permitem uma escolha sistem?tica e consistente das estruturas, principalmente por levar em considera??o, descritores qu?micos e caracter?sticas moleculares, permitindo uma avalia??o mais criteriosa.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 482532 bytes, checksum: 1c1dce279e9ef945c0bd479992a99516 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The hemibiothrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witche's broom disease in cocoa (Theobroma cacao), presents different transposable elements in its genome. A transposable element of Class II belonging to the super-family PIF/Harbinger, named Boto, had been partially characterized in previous studies. The element Boto, as well as other elements PIF/Harbinger, presents two ORFs (ORF 1 and ORF 2). OFR 2 codifies the transposase while ORF 1 codifies one protein which function is unknown. The aim of this work was to prove the Boto element activity and characterize the ORF 1. For assure the activity of the transposable element Boto in the genome of M pernicious was carried out the evaluation of the integration profile in isolates resultants of sexual cycle. Three of such isolates showed variation in the copy number of transposable element Boto, proving Boto activity. Furthermore, PCR reactions were carried out for detection of insertion sites of this element in different isolates. Among the 28 isolates used in this experiment, 14 showed amplification products with expected size. The products of amplification of two isolates, randomly chosen, were cloned and sequenced. The analysis of the obtained sequences showed that in both isolated sequenced the element Boto did not transpose for the insertion site analyzed in the M. perniciosa genome. It proves the activity of this element in the genome of M. perciciosa, because, in the isolated used as reference for this study, the Boto element was inserted in that position. In the in silico analysis of the ORF 1 sequence, the presence of two possible introns was verified, one containing 55 pb and another 48 pb. This sequence codifies a protein of 422 amino acids residues. To demonstrate the presence of the two introns, experiments of RT-PCR were carried out using two oligonucleotides groups. Amplified products obtained, when cDNA was used as template of PCR reaction, were cloned and sequenced, being confirmed the position and the size of the two predicted introns. Analysis of RT-PCR also showed that this ORF is expressed even in normal conditions of cultivation of the fungi, what is important for activity of this element, since other studies showed that the expression of this ORF is fundamental to the transposition of elements PIF/Harbinger. The results of this work showed that Boto is active in the M. perniciosa genome and it can have an important role as generating agent of genetic variability in this phytopathogen. It is worth to emphasize that this is the first description of an element of the superfamily PIF/Harbinger that presents two introns in ORF 1. / O basidiomiceto hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao) apresenta diferentes elementos transponíveis em seu genoma. Um elemento transponível da Classe II pertencente à superfamília PIF/Harbinger, denominado Boto, foi parcialmente caracterizado em estudos anteriores. O elemento Boto, assim como os demais elementos PIF/Harbinger, apresenta duas ORFs (Open Reading Frame), uma que codifica a transposase e outra, denominada ORF 1, cuja seqüência de aminoácidos deduzida representa uma proteína de função é desconhecida. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de comprovar a atividade de Boto e caracterizar a ORF 1. Para a confirmação da atividade do elemento transponível Boto no genoma de M. perniciosa realizou-se a avaliação do perfil de integração em isolados resultantes do ciclo sexual, isto é, obtidos a partir da germinação de basidiósporos. Três isolados apresentaram variação no número de cópias, demonstrando a atividade de Boto. Foi realizado PCR para detecção dos sítios de inserção deste elemento em diferentes isolados. Dentre os 28 isolados utilizados no experimento, 14 apresentaram produtos de amplificação com o tamanho esperado. Os produtos de amplificação de dois isolados, escolhidos aleatoriamente, foram clonados e seqüenciados. Na análise das seqüências obtidas, verificou-se que, em ambos os isolados sequenciados, o elemento Boto provavelmente não sofreu transposição para os sítios analisados no genoma de M. perniciosa. Isto comprova a atividade deste elemento, pois, no isolado usado como referência para este estudo, o elemento Boto estava inserido naquela posição. Na análise da seqüência da ORF 1, verificou-se a presença de dois possíveis íntrons, um contendo 55 pb e outro de 48 pb. Esta seqüência codifica uma proteína de 422 resíduos de aminoácidos. Para comprovar a presença dos íntrons, experimentos de RT-PCR foram realizados com a utilização de dois conjuntos de oligonucleotídeos. Os amplificados obtidos, quando cDNA foi utilizado como molde da reação de PCR, foram clonados e sequenciados, sendo confirmada a posição e o tamanho dos dois íntrons preditos. Análise de RT-PCR mostrou que esta ORF é expressa mesmo em condições normais de cultivo do fungo, o que é importante para atividade deste elemento, visto que outros estudos mostram que a expressão desta ORF é fundamental à transposição de elementos PIF/Harbinger. Os resultados deste trabalho mostram que Boto é ativo no genoma de M. perniciosa e pode ter um importante papel como agente gerador de variabilidade genética neste fitopatógeno. Vale ressaltar que esta é a primeira descrição de um elemento da superfamília PIF/Harbinger que apresenta dois íntrons na ORF 1.

Orientador: Gonçalo A. Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T02:44:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiburcio_RicardoAugusto_D.pdf: 13957444 bytes, checksum: 5d1ae127f2574323a433b1478aeb3efe (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora é um fungo basidiomiceto hemibiotrófico causador da vassoura de bruxa no cacau (Theobroma cacao L.). Esta doença é caracterizada pela produção de ramos hiperplásicos e hipertróficos e frutas partenogênicos durante a fase biotrófica, seguido por necrose dos tecidos infectados durante a fase necrotrófica. Esta é a principal doença da produção de cacau na América do Sul e no Caribe, tendo causado uma diminuição de mais de 65% na produção no sul da Bahia, a principal região produtora do país. Vários genes relacionados à patogenicidade foram encontrados em M. perniciosa como parte do Projeto Genoma da Vassoura de Bruxa. No entanto, os padrões de evolução destes genes, que poderiam ajudar a compreender a evolução da fitopatogenicidade dessa espécie, ainda não foram estudados. Também não foram estudados as mudanças ocorridas no genoma desta espécie durante a sua evolução. Estas mudanças são particularmente relevantes uma vez que a maioria das espécies estreitamente relacionadas com M. perniciosa não é fitopatogênica. Desta forma a compreensão da evolução deste modo de vida na espécie poderia ajudar a entender a evolução de fungos fitopatógenos em geral. Este trabalho tem como objetivo ampliar o conhecimento sobre o surgimento da patogenicidade em M. perniciosa analisando a evolução dos genes potencialmente relacionados a ela, aumentando assim o conhecimento sobre a vassoura de bruxa e ajudando na busca por uma maneira de controlar a doença. Para isso, foram estudados os padrões de evolução de diversos genes ligados ao processo de necrose característica da vassoura de bruxa e genes candidatos a terem sido obtidas por transferência horizontal de genes (HGT). Os resultados indicam que a evolução da patogenicidade em M. perniciosa envolveu tanto à aquisição de novos genes quanto a utilização para novas funções de outros já presentes nos ancestrais saprotróficos. Em particular, a busca de genes horizontalmente transferidos encontrou dois genes potencialmente envolvidos na doença que ainda não tinham sido estudados, sugerindo que a análise evolutiva a nível genômico é um instrumento relevante para a escolha de genes candidatos para análises em bancada. / Abstract: Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora is a hemibiotrophic basidiomycete fungus that causes witches' broom disease in cocoa (Theobroma cacao L.). This disease is characterized by the production of hyperplasic and hypertrophic stems and parthenogenetic fruits during biotrophic life-phasee, followed by necrosis of infected tissues during necrotrophic life-phase. This is the main disease affecting the cocoa production in South America and the Caribbean, causing a decrease of more than 65% in the production in southern Bahia, the main producing region. Several genes related to pathogenicity were found in M. perniciosa as part of the Witches' Broom Genome Project. However the patterns of evolution of these genes, that could help to understand the evolution of plant pathogenicity in this species, were not yet studied. Also the changes occurred in this species at a genomic level during its evolution were not studied. These changes are particularly relevant since the majority of species closely related to M. perniciosa is not phytopathogenic and so the understanding of this evolution would help to understand the evolution of plant pathogens in general. This work attempts to increase the knowledge about the emergence of pathogenicity in M. perniciosa studding the evolution of genes potentially related to it, therefore increasing the knowledge about the witches' broom and helping in the search for a way to control the disease. To do that, it were studied the evolutionary patterns of several genes related with the necrosis process characteristic of witches' broom and genes candidate to have been obtained by horizontal gene transfer (HGT). These later were detected by a genome level screening. The results indicate that the evolution of plant pathogenicity in M. perniciosa involved both the acquisition of new genes and the use of genes already present in the saprotrophic ancestral in new functions. In particular, the search for horizontally transferred genes found two genes potentially involved in the disease which were not yet studied, suggesting that the evolutionary analysis at the genomic level is a relevant tool to the choice of genes candidate to laboratory analysis. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Odalys Garcia Cabrera / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ambrosio_AlinneBatista_D.pdf: 4013772 bytes, checksum: 30fca05155be94194f624c02d6697d87 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O cacaueiro (Theobroma cacao L., Sterculiaceae), planta nativa da região amazônica, é aprincipal espécie dentre as 22 do gênero que é comercialmente explorada para aprodução de sementes, as quais tem grande importância econômica principalmente porser usado na produção de chocolate.Por conta disso, a produção das sementes sempre foiuma grande preocupação para as regiões produtoras, e o fator que causa o maior declínioda produção de cacau é o aparecimento de doenças. No Brasil, o cacaueiro apresentacomo principais doenças causadoras de perdas na produção a vassoura-de-bruxa e o maldo-facão. A vassoura-de-bruxa é causa pelo fungo Moniliophthora perniciosa e tem comosintomas característicos a hiperplasia e hipertrofia das células que dão lugar a tecidosanômalos chamados de vassoura. O mal-do-facão, causado pelo fungo Ceratocystiscacaofunesta, é uma doença assintomática, sendo detectada somente com a morte daplanta. As duas doenças foram estudadas neste trabalho atravez de ferramentas dagenômica na tentativa de identificação de mecanismos de interação patógenohospedeiro.Em Ceratocystis cacaofunesta foi feita uma análise global da mitocôndriaintegrando dados de genômica, transcritômica e proteômica. Foi gerado o primeiroinventário de proteinas mitocondriais de um fitopatógeno, sendo preditas um total de1.124 proteinas, das quais 304 foram identificadas experimentalmente. Dentre asproteinas listadas no inventário, 117 tem função desconhecida e 7 parecem ser específicasdeste fungo.Análises dos dados do genoma de M. perniciosa sugerem que o fungo poderiaestar produzindo giberelina, o que explica muito dos eventos que acontecem durante ainteração M. perniciosa-cacaueiro durante a fase biotrófica do fungo. Este trabalho demonstrou a importância desse hormônio na progressão da doença, assim como aalteração do metabolismo de giberelina na planta durante a interação. Os dados obtidosneste trabalho geraram conhecimento para desenvolvimento de estrátégias de controledas duas doenças, além de direcionar estudos com outros fitopatógenos / Abstract: Cacao tree (Theobroma cacao L., Sterculeaceae) is a native plant from Amazon region andthe main species commercially exploited for seed production among the 22 of the genus.This plant has a great economic importance because of its use in the production ofchocolate. Due to this, producing regions always has been concern to seed production,and diseases are the most important factors of decline in cocoa production. In Brazil,cacao witches' broom and ceratocystis wilt are major diseases causing production losses.The witches' broom is caused by the fungus Moniliophthora perniciosa and thecharacteristic hyperplasia and hypertrophy symptoms of cells gives rise to anomaloustissue called broom. Meanwhile, the ceratocystis wilt caused by Ceratocystis cacaofunestais an asymptomatic disease; it is detected only with the death of the plant. Both diseaseswere studied using genomic tools in an attempt to identify mechanisms of host-pathogeninteraction. In Ceratocystis cacaofunesta, a mitochondrial global analysis integrating datafrom genomics, transcriptomics and proteomics was made. This work generated the firstinventory of mitochondrial proteins of a plant pathogenic fungus, in which 1,124 proteinswere predicted and 304 were identified experimentally. Among the proteins listed in theinventory, 117 have unknown function and 7 appear to be specific to this fungus. Dataanalysis of the genome of M. perniciosa suggests that the fungus could be producinggibberellin, it may explain much of the events that happen during the interaction M.perniciosa-cacao in biotrophic phase of the fungus. Therefore, this work showed theimportance of this hormone in disease progression, as well as altered metabolism ofgibberellin in the plant during the interaction. The data obtained in this work generatedknowledge to develop strategies to control these two diseases, and can drive studies withother pathogens / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O fungo fitopatogênico hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, causador da doença Vassoura-de-Bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao), é um dos maiores responsáveis pela contribuição do declínio da produção brasileira de cacau e constitui um problema fitopatológico em todas as regiões cacauicultoras. O gênero Solanum, do qual faz parte o tomate, berinjela, batata entre outros, é bem conhecido na literatura por conterem compostos que exibem atividade biológica tais como antifúngica, antiviral, moluscida, anticancerígena entre outras. O presente trabalho explorou o potencial de extrato bruto de folhas de Solanum lycopersicum como agente inibidor no controle de crescimento e desenvolvimento de três biotipos de M. perniciosa (cacau, solanácea e liana). Através de ensaios biológicos e métodos cromatográficos foi identificado o metabólito secundário -tomatina como responsável pela atividade antifúngica. Este glicoalcalóide, que apresentou potente atividade antifúngica em ensaios in vitro, foi utilizado como agente de controle no desenvolvimento do fungo e manifestação dos sintomas em plantas in vivo, onde foi verificado uma redução significativa no número de plantas com sintomas. / The hemibiotrophic phytopathogenic fungi Moniliophthora perniciosa, agent of witches broom disease of cocoa (Theobroma cacao) is one of the major responsible for the Brazilian cocoa production decay and it is a phytopathological problem in every cocoa yield area. Solanum genera, from each belongs tomatoes, eggplants, potatoes, among others, is well known as producer of biological activity such as antifungal, antiviral, anti mollus, anticancer, etc. This study explored the potential of crude extract leaves from Solanum lycopersicum as an inhibitor agent for the control of growing and development of three M. perniciosa biotypes. By the use of biological assays and chromatography, -tomatine, a secondary metabolite was identified as responsible for antifungal activity. This glycoalcaloid presented great antifungal activity on in vitro assays and it was used on the control and development of witches broom symptoms in vivo, where a significant reduction of symptomatic plants could be observed.

O fungo fitopatogênico hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, causador da doença Vassoura-de-Bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao), é um dos maiores responsáveis pela contribuição do declínio da produção brasileira de cacau e constitui um problema fitopatológico em todas as regiões cacauicultoras. O gênero Solanum, do qual faz parte o tomate, berinjela, batata entre outros, é bem conhecido na literatura por conterem compostos que exibem atividade biológica tais como antifúngica, antiviral, moluscida, anticancerígena entre outras. O presente trabalho explorou o potencial de extrato bruto de folhas de Solanum lycopersicum como agente inibidor no controle de crescimento e desenvolvimento de três biotipos de M. perniciosa (cacau, solanácea e liana). Através de ensaios biológicos e métodos cromatográficos foi identificado o metabólito secundário -tomatina como responsável pela atividade antifúngica. Este glicoalcalóide, que apresentou potente atividade antifúngica em ensaios in vitro, foi utilizado como agente de controle no desenvolvimento do fungo e manifestação dos sintomas em plantas in vivo, onde foi verificado uma redução significativa no número de plantas com sintomas. / The hemibiotrophic phytopathogenic fungi Moniliophthora perniciosa, agent of witches broom disease of cocoa (Theobroma cacao) is one of the major responsible for the Brazilian cocoa production decay and it is a phytopathological problem in every cocoa yield area. Solanum genera, from each belongs tomatoes, eggplants, potatoes, among others, is well known as producer of biological activity such as antifungal, antiviral, anti mollus, anticancer, etc. This study explored the potential of crude extract leaves from Solanum lycopersicum as an inhibitor agent for the control of growing and development of three M. perniciosa biotypes. By the use of biological assays and chromatography, -tomatine, a secondary metabolite was identified as responsible for antifungal activity. This glycoalcaloid presented great antifungal activity on in vitro assays and it was used on the control and development of witches broom symptoms in vivo, where a significant reduction of symptomatic plants could be observed.

Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Júlio Cézar de Mattos Cascardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AnaCristinaCaribedos_D.pdf: 6201793 bytes, checksum: ec32c93bb2e8f1111e029a6a82d77abd (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O fungo Moniliophthora perniciosa, agente causal da doença "vassoura-de-bruxa" (VB) do cacaueiro (Theobroma cacao L.) é responsável pela diminuição da produção de cacau no Brasil e em outras regiões da América do Sul e Central. Esse decréscimo está diretamente associado a graves problemas sociais e ambientais, particularmente nas regiões amazônica e Sul da Bahia. A interação cacau-M. perniciosa envolve mecanismos genéticos complexos e pouco estudados em nível molecular. Portanto, este trabalho objetivou estabelecer uma metodologia de silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) em M. perniciosa, visando análises funcionais de genes relacionados à sua patogenicidade. RNAi é uma eficiente ferramenta para reprimir a expressão gênica experimentalmente, portanto, uma alternativa tecnológica muito promissora. Devido ao fato de RNAi ser um mecanismo pós-transcricional que promove o silenciamento de genes com alta especificidade e de modo sistêmico é considerado uma ferramenta versátil para o estudo de fungos filamentosos heterocarióticos. O trabalho foi conduzido em três etapas integradas: 1) estabelecimento e avaliação das condições adequadas para eletroporação e regeneração de protoplastos de M. perniciosa, como método alternativo para a transfecção de DNA e de dsRNAs nos experimentos de transformação e de silenciamento do fungo, respectivamente; 2) produção de uma linhagem transgênica de M. perniciosa que expresse o gene heterólogo gfp e o estabelecimento da metodologia de silenciamento por RNAi, usando o gene gfp como modelo; 3) silenciamento mediado por dsRNAs de dois genes endógenos de M. perniciosa, vinculados a detoxificação de ROS e a produção de corpos de frutificação. Os parâmetros que promoveram a maior freqüência de regeneração dos protoplastos eletroporados foram a aplicação de um pulso de 1.5 kV. Em relação à transformação de M. perniciosa, o gene repórter gfp foi estavelmente introduzido no genoma do fungo e posteriormente silenciado por transfecção de gfpdsRNA sintetizado in vitro, comprovando a operacionalidade do mecanismo de RNAi em M. perniciosa. Em adição, os genes endógenos MpPRX1 e MpHYD que codificam para peroxiredoxina e hidrofobina, respectivamente, foram silenciados, usando dsRNAs específicos e apresentaram níveis reduzidos de mRNAs que variaram de 18% a 98% quando comparados aos controles. O silenciamento dos genes gfp e MpPRX1 foi corroborado pela redução da fluorescência de GFP e da atividade da peroxidase, bem como da sobrevivência do micélio submetido a H2O2, respectivamente. O silenciamento de gfp e de MpPRX1 persistiu por aproximadamente quatro meses, indicando silenciamento sistêmico. O estabelecimento da técnica de silenciamento gênico por RNAi em M. perniciosa abre novos caminhos para explorar funcionalmente o genoma deste fitopatógeno, bem como o desenvolvimento de mecanismos que bloqueiem ou diminuam a ação deste / Abstract: The fungus Moniliophthora perniciosa, causal agent of cacao (Theobroma cacao L.) witches' broom (WB) disease, is responsible for the decrease in cacao production in Brazil and other regions of South and Central America. This decrease is directly associated to severe social and ecological problems, particularly in the Amazon and Southern Bahia regions. The cacao-M. perniciosa interaction involves complex genetic mechanisms little studied at the molecular level. Therefore, this study aimed to establish a methodology of gene silencing by RNA interference (RNAi) in M. perniciosa, aiming functional analyses of genes related to his pathogenicity. RNAi is a powerful tool to experimentally suppress or regulate gene expression, therefore, a very promising technological alternative. Because RNAi is a post-transcriptional event that promotes gene silencing with high specificity and in a systemic way, it is considered a versatile tool for the study of heterokaryotic fungi. The work was conducted in three integrated steps: 1) establishment and evaluation of appropriate conditions for electroporation and regeneration of M. perniciosa protoplasts, as an alternative method for transfection of transgenic DNA and dsRNAs in transformation and fungus silencing experiments, respectively; 2) production of a transgenic strain of M. perniciosa that expresses the heterologous gene gfp and the establishment of methodology for silencing by RNAi, using the gfp gene as a model; 3) silencing mediated by dsRNAs of two endogenous M. perniciosa genes linked to detoxification of ROS and the production of fruiting bodies. The parameters that promoted the highest frequency of regeneration of electroporated protoplasts were the application of one pulse of 1.5 kV. Regarding M. perniciosa transformation, the gfp reporter gene was stably inserted into the genome of the fungus and subsequently silenced by transfection of gfpdsRNA synthesized in vitro, demonstrating the operationality of the RNAi mechanism in M. perniciosa. In addition, the endogenous genes MpPRX1 and MpHYD, coding for peroxiredoxin and hydrophobin, respectively, were silenced using specific dsRNAs showing reduced levels of mRNAs ranging from 18% to 98% when compared to controls. Silencing of gfp and MpPRX1 was validated by experiments that showed correlation between reduced levels of GFP fluorescence and peroxidase activity, as well as survival of mycelium subjected to H2O2, respectively. The silencing of gfp and MpPRX1 persisted for approximately four months, indicating systemic silencing. The establishment of the gene silencing technique by RNAi in M. perniciosa opens new paths to functionally explore the genome of this pathogen and the development of mechanisms that block or decrease his action / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular