MELO, Priscila Bezerra dos Santos. Indução à embriogênese somática e identificação de marcadores ISSR em antúrio. 2016. 98 f. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-09T18:32:24Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_pbsmelo.pdf: 1915586 bytes, checksum: ca8ba64498bc085612866056110e7aef (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-11T17:14:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_pbsmelo.pdf: 1915586 bytes, checksum: ca8ba64498bc085612866056110e7aef (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-11T17:14:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_pbsmelo.pdf: 1915586 bytes, checksum: ca8ba64498bc085612866056110e7aef (MD5) Previous issue date: 2016 / Anthurium is an important ornamental species for floriculture's agribusiness. Thus, it is very important to ensure the success of its cultivation. The use of biotechnology allows the development of effective techniques for in vitro propagation. One of these techniques is the somatic embryogenesis. However, beyond these efforts, another technique that can effectively contribute to the success of Anthurium cultivation, is the characterization of anthurium's cultivars, by means of molecular markers. Therefore, the study was divided into two experiments. Experiment 1: The objective was to establish an induction protocol for somatic embryogenesis for the anthurium's cultivars Jureia and Luau, using nodal segments as explants. It was studied the effect of the interaction among the factors cultivar, growth regulator type and concentration on oxidation (%) and formation of embryogenic calli (%). The scanning electron microscopy (SEM) was used to identify whether the structures formed from the explants showed embryogenic characteristics. The evaluations about oxidation showed that Jureia is the most sensitive cultivar, and that the medium added with NAA is more prone to oxidation. As for the formation of embryogenic calli, it was found that Luau has more embryogenic potential and it was established the following protocol for induction of somatic embryogenesis for the two studied cultivars: nodal segments must be maintained for 75 days, in the dark, in the medium ESA (Pierik 1976 modified) supplemented with 7.5 mM of NAA. Experiment 2: The objective was the selection of ISSR markers for molecular characterization of anthurium's cultivars Sublime, Luau, Jureia and Maré, using leaf samples of in vitro established plants, from indirect organogenesis, and samples of embryogenic calli. The DNA extraction was made, showing a genetic material of good quality. The PCR of the 18 ISSR markers was made and the reaction products were visualized by electrophoresis. The revealed fragments in the agarose gel were transformed into binary data [1- presence of band; 0 - absence of band], allowing the classification of the samples in terms of genetic distance in a dendrogram. It was found that all the ISSR used showed polymorphism, being effective to characterization of the anthurium's samples studied. Cultivar-specific markers were identified. It was found that Sublime is the cultivar genetically most stable and Maré the most unstable. These results provide new perspectives for the in vitro propagation, and are useful for breeding and protection of the studied anthurium's cultivars. / O antúrio é uma importante espécie ornamental para o agronegócio da floricultura. Assim, é importante garantir o sucesso de seu cultivo. O uso da biotecnologia permite o desenvolvimento de técnicas eficientes de propagação in vitro. Uma dessas técnicas é a embriogênese somática. Porém, além destes esforços, uma das técnicas que pode contribuir efetivamente para o sucesso do cultivo do antúrio é a caracterização das cultivares da espécie, por meio de marcadores moleculares. Assim, o estudo foi dividido em dois experimentos. Experimento 1: Objetivou-se estabelecer um protocolo de indução à embriogênese somática para as cultivares de antúrio Jureia e Luau, utilizando como explantes segmentos nodais. Estudou-se o efeito da interação entre os fatores cultivar, tipo e concentração do regulador de crescimento sobre a oxidação (%) e formação de calos embriogênicos (%). Utilizou-se microscopia eletrônica de varredura (MEV) para identificar se as estruturas formadas a partir dos explantes apresentavam características embriogênicas. Constatou-se que a cultivar Jureia é mais sensível e o meio adicionado de ANA mais propenso à oxidação. Quanto à formação de calos embriogênicos, constatou-se que a cultivar Luau tem maior potencial embriogênico e estabeleceu-se o seguinte protocolo de indução à embriogênese somática, para as duas cultivares estudadas: segmentos nodais devem permanecer 75 dias, no escuro, em meio ESA (Pierik 1976, modificado) suplementado com 7,5 μM de ANA. Experimento 2: Objetivou-se a seleção de marcadores ISSR para caracterização molecular das cultivares de antúrio Sublime, Luau, Jureia e Maré, a partir de amostras de folhas oriundas de plantas estabelecidas in vitro, obtidas de organogênese indireta, e de amostras de calos embriogênicos. Foi realizada a extração de DNA das amostras coletadas, revelando DNA de boa qualidade. Foi feita a PCR de18 marcadores ISSR e os produtos da reação foram visualizados por eletroforese. Os fragmentos revelados no gel de agarose foram transformados em dados binários [1– presença de banda; 0 – ausência de banda], possibilitando agrupar as amostras em termos de distância genética em um dendrograma. Constatou-se que os marcadores ISSR utilizados apresentaram polimorfismo, sendo eficientes para caracterizar as amostras de antúrio estudadas. Foram identificados marcadores cultivar-específicos. Sublime revelou-se como a cultivar geneticamente mais estável, e Maré, como a mais instável. Estes resultados proporcionam novas perspectivas para a propagação in vitro, bem como são úteis para o melhoramento genético e proteção da identidade genética das cultivares de antúrio estudadas.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-10T13:08:15Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 734479 bytes, checksum: dcd87645d1e8d78a8a5ad22880dd5630 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T13:08:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 734479 bytes, checksum: dcd87645d1e8d78a8a5ad22880dd5630 (MD5) Previous issue date: 2002-06-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Há muito tempo que as características relacionadas à coloração do fruto e sua qualidade nutricional têm sido consideradas desejáveis para manipulação em citros. Entretanto, a produção de novas cultivares dessas plantas tem sido limitada pelos vários obstáculos que impedem o seu melhoramento genético. A biotecnologia, por meio das técnicas de cultura de tecidos e transformação genética de plantas, surge como uma opção viável para contornar esse problema. Os objetivos do presente estudo foram isolar e caracterizar alguns genes envolvidos na rota biossintética de carotenóides de Citrus paradisi (Macf.) e desenvolver metodologias de regeneração in vitro e transformação genética para manipulação dessa rota biossintética em citros, visando alterar o conteúdo de provitamina A, a coloração do fruto e o porte das plantas. Utilizando-se a técnica de RT-PCR, as seqüências de cDNAs dos genes da sintase do fitoeno (AF152892), desaturase do fitoeno (AF364515), desaturase do ζ-caroteno (AF372617), ciclase-β do licopeno (AF152246) e ciclase-ε do licopeno (AF486650) foram isoladas de C. paradisi. Em geral, essas seqüências apresentaram elevada homologia aos genes correspondentes em tomate, com identidade de 72-83% em nível de aminoácidos. Dois ou mais transcritos diferentes foram identificados para três dos cinco genes caracterizados nesse estudo. Em cada caso, um ou mais transcritos foram considerados aberrantes, em que a produção de polipeptídeos não-funcionais foi predita. Estudos de expressão gênica revelaram que a maioria dos genes isolados é transcricionalmente regulada durante o desenvolvimento do fruto. No entanto, a diferenciação da coloração do fruto entre as cultivares de C. paradisi pode ser causada por mutações na seqüência aberta de leitura e não por regulação transcricional diferencial, sendo a desaturase do fitoeno e/ou ciclase-ε do licopeno os genes candidatos pelas diferenças observadas. Na avaliação da morfogênese in vitro de tecidos derivados de epicótilos de limão ‘Cravo’ (C. limonia Osb.), pomelo ‘Foster’ (C. paradisi Macf.) e laranja ‘Pêra’ [C. sinensis (L.) Osb.], verificou-se diferentes respostas às condições de cultivo in vitro em função da cultivar, da região do epicótilo utilizada como fonte de explantes, da composição do meio de cultura e das condições de incubação. Um sistema eficiente de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens foi desenvolvido para C. paradisi, examinando-se os efeitos de seis fatores na eficiência de transformação. A pré- cultura dos explantes e a composição do meio de co-cultivo foram os fatores que mais influenciaram a eficiência de transformação. O protocolo otimizado foi empregado na produção de plantas transgênicas contendo os genes da sintase do fitoeno, desaturase do fitoeno ou ciclase-β do licopeno sob expressão constitutiva. / Fruit color and its nutritional value have been considered desirable for manipulation in citrus for a long time. However, citrus breeding has been limited due to several factors that hinder its genetic improvement. Plant biotechnology appears to be a viable option for the improvement of citrus species by means of the plant tissue culture and genetic transformation techniques. The objectives of this study were to isolate and characterize some genes involved in the carotenoid biosynthetic pathway of Citrus paradisi (Macf.) and to develop protocols of in vitro regeneration and genetic transformation for manipulation of this pathway in citrus, aiming to change the provitamin A content, fruit color, and plant height. By using the RT-PCR technique, the cDNA sequences of the genes phytoene synthase (AF152892), phytoene desaturase (AF364515), ζ-carotene desaturase (AF372617), lycopene β-cyclase (AF152246), and lycopene ε-cyclase (AF486650) were isolated from C. paradisi. In general, they were highly homologous to the corresponding tomato genes at the amino acid level, with identity ranging from 72-83%. Two or more different transcripts were identifyed for three of the five genes characterized in this study. In each case, one or more of the transcripts were aberrant, so that the production of a nonfunctional protein would be predicted. The expression analysis of the isolated carotenoid biosynthetic genes indicated complex expression patterns during fruit development. However, the fruit color differentiation between the grapefruit cultivars may be caused by frame-shift mutation and not by differential transcriptional regulation, with phytoene desaturase and/or lycopene ε-cyclase being the candidate genes for fruit color differences. The in vitro responses of epicotyl explants from ‘Cravo’ rangpur lime (Citrus limonia Osb.), ‘Foster’ grapefruit (C. paradisi Macf.), and ‘Pêra’ sweet-orange [C. sinensis (L.) Osb.] varyed according to cultivar, region of the epicotyl used as source of explant, culture medium composition, and incubation conditions. An improved protocol for Agrobacterium-mediated transformation of epicotyl explants from ‘Duncan’ grapefruit was developed by examining the effects of six different factors on the efficiency of transformation and combining the best treatments for each factor. The preculturing of the explants and the composition of the cocultivation medium were the factors that most influenced transformation efficiency. The optimized protocol was successfully employed in the production of transgenic grapefruit plants containing the carotenoid biosynthetic genes phytoene synthase, phytoene desaturase, or lycopene β-cyclase under constitutive expression. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-27T17:22:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 72319 bytes, checksum: 8ea16ab7752471ab01d10c647ee35e08 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-27T17:22:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 72319 bytes, checksum: 8ea16ab7752471ab01d10c647ee35e08 (MD5) Previous issue date: 2001-03-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Foram estudados alguns fatores que influenciam a organogênese, bem como a regeneração in vitro desta espécie, visando fornecer subsídios à transformação genética. Analisando-se o efeito de concentrações de BAP na indução de multibrotações em segmentos caulinares nodais de O. selloi cultivados in vitro, evidenciou-se que quanto maior a concentração de BAP, tanto menor foi o comprimento dos brotos, porém maior o número de brotos. Menores concentrações de BAP relacionam-se a maiores pesos de matéria seca dos brotos. Estudando-se o efeito de concentrações de sacarose e sais no cultivo in vitro de segmentos caulinares nodais de O. selloi constatou-se que a concentração de 100 % de sais do meio MS combinada com a concentração 2 % de sacarose foi a melhor na propagação in vitro de O. selloi, em razão de se ter obtido brotos mais longos e com raízes grandes, resultando em maior peso do material vegetal. Observando-se o efeito de concentrações de ANA e BAP e da posição dos explantes na indução de organogênese in vitro em segmentos caulinares internodais de O. selloi verificou-se que o primeiro, o segundo e o terceiro segmentos caulinares internodais apresentaram, em meio de cultivo -1 -1 complementado com 1,00 mg L de ANA e 0,25 mg L de BAP, freqüência de calogênese de 60,00%, 50,00% e 60,00%, respectivamente. O primeiro, o segundo e o terceiro segmento caulinar internodal apresentaram, respectivamente, freqüência de organogênese de 93,33%, 73,33% e 73,33%, média de órgãos produzidos de 2,80, 1,80 e 1,80 e eficiência de organogênese de 2,60, 1,32 e 1,32 em meio de cultivo suplementado com 0,10 mg L -1 de ANA e 1,00 mg L -1 de BAP. Verificando-se o efeito de concentrações de ANA na indução do enraizamento em brotos de O. selloi, obtidos a partir de segmentos caulinares internodais cultivados in vitro, evidenciou-se que tanto o número de raízes quanto o comprimento de raízes foram crescentes à medida que elevou-se a concentração de ANA de 0,0 a 1,0 mg L -1 . Avaliando-se o efeito de agentes gelificantes na indução de organogênese em segmentos caulinares internodais de O. selloi cultivados in vitro, averigou-se que o primeiro segmento caulinar internodal comportou-se melhor na indução de brotos comparado ao segundo segmento caulinar internodal e combinado ao Phytagel - “Sigma” foi superior ao associado com Agar - “Merck”. O uso de higromicina com timentin foi mais eficiente que o de canamicina com timentin para a seleção de regenerantes, pois para inibir a organogênese usou-se 10 mg L -1 de higromicina com 300 mg L -1 de timentin e 100 mg L -1 de canamicina com 300 mg L -1 timentin. A freqüência de regeneração de brotos em meio seletivo contendo higromicina e timentin foi de 0,5%, enquanto que a de canamicina e timentin foi de 1,0%. Conclui-se que não foi possível obter plantas transgênicas, pois a transformação genética não foi mostrada pelo teste Gus, nem confirmada por PCR. / Some factors that influence the organogenesis have been studied, as well as the regeneration in vitro of this species, with the aim of providing a basis for genetic transformation. By analysing the effect of BAP concentrations in the induction of multishooting in nodal stem segments of O. selloi cultivated in vitro, it has become clear that the higher the BAP concentration, the shorter the shoots were, though they were in a larger number. A lower concentration of BAP is related to a higher amount of dry matter in the shoots. By studying the effect of sucrose and salt concentrations in the cultivation in vitro of nodal stem segments of O. selloi, it has been observed that the concentration of 100% of salt in a MS medium combined to a concentration of 2% of sucrose was the best one for the in vitro propagation of O. selloi , since the shoots obtained were longer and deeper-rooted, resulting in a larger amount of vegetal matter. By observing the effect of NAA and BAP concentrations and the position of explants in the induction of the organogenesis in vitro of the internodal stem segments of O. selloi, it has been verified that the first, second and third internodal stem segments presented a calogenesis frequency of 60,00 %, 50,00% and 60,00% respectively in a medium of cultivation supplemented with 1,00 mg L -1 and 0,25 mg L -1 of NAA of BAP. The first, the second and the third internodal stem segments presented organogenesis frequency of 93,33%, 73,33% and 73,33%, respectively, an average of organs produced of 2,80, 1,80 and 1,80 and organogenesis efficacy of 2,60, 1,32 and 1,32 in a medium of cultivation supplemented with 0,10 mg L -1 of NAA and 1,00 mg L -1 of BAP. By analysing the effect of NAA concentrations in the induction of rooting in O. selloi shoots, obtained from internodal stem segments cultivated in vitro, it has become clear that both the number of roots and their length grew as the concentration of NAA was increased from 0,0 to 1,0 mg L -1 . By evaluating the effect of gelling agents in the induction of organogenesis in internodal stem segments of O. selloi cultivated in vitro, it has been verified that the first internodal stem segment reacted best in the induction of shoots as compared to the second internodal stem segment, and, combined to Phytagel - “Sigma”, it was better than that associated to Agar - “Merck”. The use of hygromycin combined with timetin was more effective than the use of kanamycin combined with timetin for the selection of the regenerants, since it was used 10 mg L -1 of hygromycin combined to 300 mg L -1 of timetin and 100 mg L -1 of kanamycin combined with 300 mg L -1 of timetin. The frequency of the regeneration of the shoots in a selective medium containing hygromycin and timetin was of 0,5%, whereas that of kanamycin and timetin was of 1,0%. The conclusion was that it is not possible to obtain transgenetic plants, since the genetic transformation has not been shown by the GUS test, neither confirmed by PCR.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-13T16:31:11Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2066785 bytes, checksum: c877aba62b5527dd4e90b04a429a3be9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-13T16:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2066785 bytes, checksum: c877aba62b5527dd4e90b04a429a3be9 (MD5) Previous issue date: 2004-03-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O presente trabalho objetivou estudar alguns aspectos relacionados à histologia e histoquímica da embriogênese somática em Carica papaya L. ‘Improved Sunrise Solo Line 72/12’. Embriões zigóticos imaturos resgatados a partir de frutos imaturos com 80 a 90 dias após a antese foram cultivados em meio MS meia-força, suplementado com 6% de sacarose, 100 mg L -1 de mio- inositol, 400 mg L -1 de L-glutamina, 2 mg L -1 de ácido diclorofenoxiacético e solidificado com 2,8 g L -1 de Phytagel ® . Para os estudos anatômicos, amostras de calos embriogênicos foram analisadas em microscópio óptico e submetidas à microscopia eletrônica de varredura. Para análise histoquímica foram utilizadas amostras de material fresco ou incluídas em historesina. A análise histológica de amostras, coletadas em vários períodos de cultivo, mostrou que a reação calogênica induzida teve início nas células do meristema fundamental, próximas aos cordões procambiais e embriogênese somática direta ocorrendo a partir das células protodérmicas e subepidérmicas, ao vigésimo dia de cultivo, especialmente na região meristemática do domo apical do embrião zigótico. As células embriogênicas foram caracterizadas por apresentarem núcleos volumosos, nucléolos proeminentes e citoplasma denso com poucos grãos de amido. Aos 45 dias de cultivo, visualizou-se a formação de inúmeros complexos proembriogênicos, com variável número de células, isolados das demais por paredes espessas, típicos de um processo de embriogênese somática indireta. Grande quantidade de grãos de amido foi visualizada nos estádios iniciais da calogênese, especialmente nas células periféricas. A reação positiva ao teste com Sudan detectou uma grande quantidade de lipídeos, evidenciando sua importância como material de reserva. Proteínas em forma de grânulos foram evidenciadas pelo teste XP (Xylidine Ponceau), especialmente nos cotilédones intactos dos embriões zigóticos cultivados. Os efeitos do precursor do etileno 1-aminociclopropano-1- carboxílico (ACC) e dois inibidores – aminoetoxivinilglicina (AVG) e tiossulfato de prata (STS) durante o processo de indução da embriogênese somática foram analisados. Neste experimento o meio indutor foi suplementado com essas substâncias, nas concentrações de 3, 10 e 30 ìM. A presença do ACC não inibiu a formação de calos e a aquisição de competência embriogênica. Contudo, nos maiores níveis testados, observou-se redução no número de embriões somáticos diferenciados por explante. Em presença de AVG na concentração de 3 ìM verificou-se resultados semelhantes ao tratamento controle em relação a formação de calos embriogênicos. Contudo nos níveis de 10 e 30 μM foram observados altos índices de explantes não responsivos, sugerindo possível toxidez desses níveis. Nos tratamentos com STS observou-se intensa proliferação de calos, porém com pouca diferenciação embriogênica. Em outro experimento, verificou-se os efeitos de pulsos de 2,4-D sobre a morfogênese in vitro em mamoeiro, tendo como objetivo inicial determinar o período de exposição necessário para aquisição de competência embriogênica. Foram testadas altas concentrações (10 e 100 mg L -1 ) em tempos reduzidos de 0, 1, 6, 12, 24, 36, 48, 72 horas e a exposição contínua. Em seguida, os explantes foram transferidos para o meio MS, destituído de reguladores de crescimento. Para cada concentração e períodos de exposição foram observadas respostas morfogênicas diferenciadas como rizogênese, calogênese e embriogênese somática. Melhores respostas embriogênicas foram observadas na concentração de 10 mg L -1 durante 72 horas e na concentração de 100 mg L -1 no pulso de 48 horas. / The present study was conducted to evaluate some aspects related to histological and histochemical aspects of somatic embryogenesis of C. papaya ‘Improved Sunrise Solo line 72/12’. Immature zygotic embryos derived from harvested fruits after 80-90d after anthesis were cultured onto a semi-solid half- strength MS-based medium supplemented with 6% sucrose, 100 mg L -1 myo- inositol, 400 mg L -1 L-glutamine, 2,4-D (2.0 mg L -1 ), and solidified with 2.8 g L -1 Phytagel, at pH 5.7 ± 0.1. For anatomical studies embryogenic calli samples were characterized under photonic and scanning electron microscopy. Histochemical analyses were carried out using both fresh and hystoresin embedded samples. Histological analyses carried out throughout several cultural periods, revealed that callusing responses initiated from fundamental meristem-derived cells, close to procambial strands, whereas direct somatic embryogenesis occurred from peripheric, protodermic and sub-epidermic cells, at 20 th d of culture, mainly from apical dome of the zygotic embryo. Embryogenic cells presented typical meristematic characteristics large nuclei, prominent vacuoles, densely cytoplasmic, and few starch grains. At 45 d of culture, several proembryogenic complexes with variable number of cells were visualized, isolated by thick cell-walls, typical of indirect somatic embryogenesis process. Large amounts of starch grains were detected at initial stages of callusing processes, especially in the periphery. Positive reactions with Sudan detected large amount of lipids, evidencing its importance as storage material. Protein granules were also evidenced by Xylidine Ponceau mainly in intact cotyledon of zygotic embryos. The effect of the ethylene precursor 1-aminocyclopropane-1-carboxylic (ACC) and two inhibitors – aminoethoxyvinylglyine (AVG) and silver thiosulfate (STS) during the induction process of somatic embryogenesis were analyzed. In this experiment the inductor medium was supplemented with these substances, in the concentrations of 3, 10 and 30 ìM. The presence of ACC did not inhibit the callusing responses and the acquisition of embryogenic competence. However, at higher tested levels, there was a significant decrease in number of somatic embryos per explant. In the presence of AVG in the concentration of 3 μM, similar results were verified as compared to the control treatment regarding to the formation of embryogenic calli. Therefore, in the levels of 10 and 30 ìM it was observed high percentage of explants without responses, suggesting possible toxicity in these levels. In the treatment with STS it was observed a high proliferation of callus although with few embryogenic differentiation. Another experiment it verified the effects of pulses of 2,4-D upon in vitro morphogenesis in papaya, having as initial goal determine the period of the exposition demanded for acquisition of embryogenic competence. The concentrations de 2,4-D (10 and 100 mg L -1 ) combined with pulsing times 0, 1, 6, 12, 24, 36, 48, 72 hours and the continuous exposition was evaluated. Following, the explants were transferred to the medium MS without growing regulators. For each concentration and exposition period it was observed morphogenic response differing as rhizogenesis, calogenesis and somatic embryogenesis. Better embryogenic response were observed in the concentration of 10 mg L -1 during 72 hours and in the concentration of 100 mg L -1 in the pulse of 48 hours. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-02T18:36:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1203574 bytes, checksum: 27a8ee88c37be77020eb4764ddc31451 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-02T18:36:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1203574 bytes, checksum: 27a8ee88c37be77020eb4764ddc31451 (MD5) Previous issue date: 2005-03-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Foram conduzidos experimentos de cultura de tecidos utilizando um genótipo híbrido de Eucalyptus grandis vs. E. smithii e sementes de um cruzamento controlado de E. grandis. Foram isoladas uma levedura e uma bactéria que têm dificultado a cultura in vitro e transformação genética do genótipo híbrido, sendo a bactéria identificada como Herbaspirillum huttiense (Leifson) Ding e Yokota. Dentre 34 antibióticos testados in vitro para o controle do crescimento de H. huttiense, 12 induziram halos de inibição. Sulfadiazina, estreptomicina, canamicina e penicilina foram selecionados para determinação da concentração inibitória mínima. Sulfadiazina, estreptomicina e canamicina induziram halos de inibição entre as concentrações de 256 e 512 mg L -1 , contudo, apresentaram apenas atividade bacteriostática. Penicilina não apresentou efeito bactericida ou bacteriostático em concentrações até 1024 mg L -1 . Cefotaxima, carbenicilina e timentin foram avaliados quanto ao seu efeito sobre a morfogênese in vitro de explantes de Eucalyptus grandis. Foi observado que carbenicilina e timentin, em concentrações até 600 mg L -1 , favoreceram a freqüência de explantes regenerando calos (50-70%) e a redução da necrose. Cefotaxima beneficiou a calogênese até 300 mg L -1 , concentração a partir da qual promoveu aumento dos calos necrosados (>60%). Explantes cotiledonares e de hipocótilos de E. grandis foram submetidos a altas concentrações de diferentes reguladores de crescimento (ABSA, AIA, AIB, ANA, 2,4-D, TDZ, ZEA, BAP e KIN) e a combinações de 10, 50 e 100 mg L -1 de 2,4-D e períodos de exposição de 6, 12, 24 e 48 horas. Plântulas intactas apresentaram resultados superiores (~7 raízes/explante) quanto à rizogênese adventícia comparadas a hipocótilos e cotilédones isolados (<1,5 raízes/explante). ABSA, AIA, AIB, ANA e 2,4-D aumentaram (>10 raízes/explante), enquanto TDZ, ZEA, BAP e KIN inibiram (<1 raízes/explante) de maneira significativa a indução de raízes adventícias. O alongamento de epicótilos também foi inibido por TDZ, KIN, 2,4-D, BAP e ABSA, enquanto o mesmo não ocorreu com AIA, AIB, ANA e ZEA. Foi observada uma maior eficiência de ABSA na indução do enraizamento, mesmo quando comparada à AIB. Houve um decréscimo no alongamento de epicótilos e no número médio de raízes por explante, e um aumento da necrose de explantes, com o aumento da exposição e da concentração de 2,4-D. Nos estudos com marcadores moleculares, foi determinado o perfil de 84 genótipos com base em marcadores RAPD. Foi gerado um total de 501 bandas, dos quais 450 (89,82%) foram polimórficas e 51 (10,18%) monomórficas. A análise de bootstrap com duzentas repetições para cada número de marcadores mostrou que um número de marcadores maior que 393 resultou em valores de estresse menores que 5%, menores que 5 para soma de quadrados e maiores que 0,95 para correlação. Comparando os índices de diversidade genética entre e dentro das sub- populações de E. grandis e E. urophylla, a maior parte da variabilidade foi encontrada dentro das sub-populações. Exceto para o índice de Shannon, os outros índices de variabilidade aumentaram quando os marcadores monomórficos foram retirados das análises. A análise de agrupamento baseada em marcadores RAPD demonstrou associação com a classificação taxonômica. / Tissue culture experiments were conducted with a Eucalyptus grandis vs. E. smithii hybrid genotype and E. grandis controlled cross seeds. One yeast and one bacterium, which have difficulted in vitro tissue culture and genetic transformation of the hybrid genotype, were isolated and the latter identified as Herbaspirillum huttiense (Leifson) Ding e Yokota. Among 34 antibiotics tested, only 12 inhibited bacterial growth. Sulfadiazine, streptomycin, kanamycin and penicillin were selected for determining the minimal inhibitory concentration. Sulfadiazine, streptomycin, and kanamycin presented inhibition halo at 256 and 512 mg L -1 , yet all three were bacteriostatic. Penicillin did not display bactericidal effect at the concentrations up to 1024 mg L -1 . Cefotaxime, carbenicillin and timentin effects on the in vitro morphogenesis of Eucalyptus grandis seedling explants were evaluated. It was observed that carbenicillin and timentin, up to 600 mg L -1 , favored the frequency of explants regenerating callus (50-70%) and decreased necrosis. Cefotaxime supported callogenesis up to 300 mg L -1 from which displayed an increasing frequency of necrosed explants and callus (>60%). E. grandis hypocotyl and cotyledon explants were submitted to high concentrations of different growth regulators (BSAA, IAA, IBA, NAA, 2,4- xiiD, TDZ, ZEA, BAP and KIN), and to combinations of 10, 50 and 100 mg L -1 2,4-D and 6, 12, 24 and 48 hours pre-treatment periods. Intact plantlets displayed superior adventitious rhizogenesis (~7 roots/explant) compared to isolated hypocotyl and cotyledon explants (<1.5 roots/explant). BSAA, IAA, IBA, NAA and 2,4-D enhanced (>10 roots/explant) whereas TDZ, ZEA, BAP and KIN significantly inhibited (<1 roots/explant) adventitious rhizogenesis. Epicotyl elongation was also significantly inhibited by TDZ, KIN, 2,4-D, BAP and BSAA, while IAA, IBA, NAA and ZEA did not. BSAA displayed a significantly higher effect on adventitious root induction, even compared to IBA. Epicotyl elongation and average number of roots per explant declined, whereas explant necrosis augmented, with higher 2,4-D exposures and concentrations. In the molecular marker studies, the profiles of 84 Eucalyptus genotypes based on RAPD markers were determined. A total of 501 bands was generated, from which 450 (89.82%) were polymorphic and 51 (10.18%) monomorphic. Two hundred bootstrap analysis revealed that a number higher than 393 markers provided values below 5% for stress, lower than 5 for sum of squares and higher than 0.95 for correlation statistics. Comparing the genetic diversity indexes between and within the E. grandis and E. urophylla sub-populations, most of the variability was found in the sub-populations. Except for the Shannon index, other variability indexes increased as monomorphic markers were withdrawn from the analysis. Nevertheless, clustering analysis based on RAPD markers demonstrated association with taxonomic classification.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-11T18:41:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1971113 bytes, checksum: a93e969c20000a7877c0708ec8d049cb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-11T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1971113 bytes, checksum: a93e969c20000a7877c0708ec8d049cb (MD5) Previous issue date: 2003-03-06 / Psychotria ipecacuanha (Rubiaceae) é uma espécie medicinal conhecida como poaia ou ipeca, cujo uso está relacionado à presença dos alcalóides encontrados em suas raízes, sendo os principais emetina, cefalina e psicotrina, que são freqüentemente utilizados no combate da hepatite e disenteria amebiana. Os objetivos do trabalho foram: estabelecer um protocolo para a germinação in vitro de sementes; caracterizar a reprodução vegetativa e os aspectos morfogênicos na produção de gemas adventícias; e regenerar plantas a partir de hipocótilo de P. ipecacuanha. Fragmentos radiculares foram cultivados em meio hidropônico, em solução de Hoagland e em água destilada, com presença ou ausência de 2 mg L -1 de 6-benzilaminopurina. Verificou-se nestes tratamentos que a maior produção de gemas ocorreu em solução de Hoagland. A adição de BAP ao meio (2 mg L -1 ) resultou no decréscimo do número de gemas. In vivo, a produção de gemas adventícias na raiz está associada com injúrias mecânicas e perda parcial da parte aérea. Na análise anatômica do caule de P. ipecacuanha destaca-se um felogênio originando a partir de células epidérmicas e subepidérmicas. As raízes adventícias não apresentam medula e se originam na porção dos entre-nós caulinares prostados ao solo. As gemas adventícias radiculares, formam-se a partir dos meristemóides resultantes da divisão, em vários planos, das células do felogênio. As gemas radiculares em P. ipecacuanha foram classificadas como reparativas e desenvolveram-se assincronicamente. Uma alta taxa de germinação (84,17 %) foi obtida pelo cultivo in vitro de sementes de P. ipecacuanha, com ausência de tegumento, em meio de MS na metade da concentração de sais (MS 1⁄2) com ausência de reguladores de crescimento. A obtenção desses valores pode ser atribuída à remoção da barreira para a embebição representada pelo tegumento, ao potencial osmótico do meio de cultura e as condições ambientais adequadas . As plântulas obtidas foram submetidas a tratamentos com ácido giberélico (GA 3 ) em dois estádios de desenvolvimento. A concentração de 3 mg L -1 GA 3 não influenciou efetivamente o crescimento das plântulas. Hipocótilos com polaridade invertida e segmentos de hipocótilos foram inoculados em meio MS, suplementado com concentrações de BAP (0, 1, 2 e 3 mg L -1 ). A utilização de concentrações mais baixas do regulador induziu maior produção de brotos adventícios. A organogênese nos hipocótilos ocorreu de forma direta. Os brotos adventícios produzidos em hipocótilos com polaridade invertida apresentaram-se mais vigorosos, quando diferenciados fora do meio de cultivo. A indução da rizogênese nas brotações foi eficiente nas concentrações de 1,5 e 3,0 mg L -1 de AIB. / Psychotria ipecacuanha (Rubiaceae) is a medicinal species known as poaia or ipeca, which use is related with alkaloids found in its roots, mainly emetin, cephaelin and psychotrin, and frequently used in the treatment of hepatitis and amoebiasis. The species undergoes slow growth and low seed germination, which rendered the vegetative reproduction the main propagation strategy. The goals of this work were: to characterize P. ipecacuanha vegetative reproduction and morphogenic aspects of adventitious bud production; analyze in vitro seed germination and to regenerate plants from hypocotyl explants. Root segments were cultured in Hoagland solution, in which higher number of adventitious buds was observed. The addition of 2 mg L -1 BAP to this solution resulted in a decrease in the number of buds. In vivo, adventitious bud production in the root system is associated with mechanical injuries and to the partial loss of the aerial part. On stem anatomical analysis, attention is drawn to a phellogen originated from epidermical and sub-epidermical cells in the region of adventitious roots emission. The adventitious roots did not display pith and were localized in the stem internodes prostrated in the soil surface. The root adventitious buds formation began with the division in several planes of the phellogen cells, resulting in the meristemoids formation. The buds in the P. ipecacuanha roots are classified as reparative and arise assynchronically. A high germination index (84.17%) was obtained by culturing seeds without the tegument on half- strength MS medium and no growth regulator added. Seedlings were submitted to giberellic acid (GA 3 ) treatment in two developmental stages. GA 3 3 mg L - did not influence the seedling growth. Subsequently, hypocotyls with inverted polarity were transferred to MS medium, supplemented with different BAP concentrations (0, 1, 2 and 3 mg L -1 ). The use of lower concentrations of this regulator led to higher production of adventitious shoots. Direct organogenesis was observed in the hypocotyl explants. This was validated by anatomical analysis, which also permitted the description of the main morphogenic events in the adventitious shoot ontogenesis in P. ipecacuanha hypocotyls. The shoots, from inverted polarity hypocotyl, were more vigorous when they were differentiated out the culture medium. Nevertheless, higher production of adventitious shoots was observed in the hypocotyl segments than in the inverted polarity hypocotyls. Additionally, rooting induction was efficient at 1.5 and 3.0 mg L -1 IBA. / Dissertação importada do Alexandria