Les vaccins des muqueuses s'administrent facilement et favorisent une immunité humorale et cellulaire au niveau des muqueuses. Ainsi, ils offrent une protection optimale contre les pathogènes envahissant par les muqueuses. Cependant, la mise sur le marché de nouveaux vaccins des muqueuses est entravée par le manque d'adjuvants des muqueuses efficaces et sans effets secondaires. La toxine cholérique (CT) est une entérotoxine à fort pouvoir adjuvant mais sa toxicité empêche son utilisation chez l'homme. En tant que modèle expérimental, elle a permis de comprendre l'importance de l'activité enzymatique et des récepteurs dans l'adjuvanticité. Notre travail se base sur l'observation que des doses sublétales de la toxine œdémateuse de Bacillus anthracis (EdTx) n'inhibent pas la réponse immune à des vaccins « nasaux » contenant CT comme adjuvant. Nous avons montré que les dérivés EdTx représentent une nouvelle classe d'adjuvants qui donnent des réponses systémiques et des muqueuses à des protéines vaccinales administrées par de multiples voies, notamment nasale. Contrairement à CT qui se fixe aux gangliosides, EdTx se fixe aux récepteurs des toxines de l'anthrax et ne cible pas les tissus du système nerveux central après administration nasale. Le facteur inné nerve growth factor intervient dans les réponses des muqueuses induites par CT mais n'affecte pas l'adjuvanticité d'EdTx in vivo. L'activité adjuvante d'EdTx implique aussi l'augmentation des fonctions de présentation de l'antigène. Enfin, nous avons montré qu'EdTx est un adjuvant efficace par les voies transcutanée et sublinguale, bien que les IgA des muqueuses ne soient induits qu'après immunisation sublinguale.

Le virus de la grippe infecte les muqueuses du tractus respiratoire. Un vaccin intranasal induit une réponse immunitaire proche de celle faisant suite à une infection naturelle en bloquant le virus directement sur le site de l'infection et permet une vaccination sans aiguille. Par ailleurs, les vaccins à base de pseudo-particules virales ou Virus-like Particles (VLP) produites sur cellules représentent une alternative intéressante au vaccin classique produit sur oeufs. Les VLP sont des particules non-réplicatives qui ressemblent au virus et qui peuvent être immunogènes même sans adjuvant, en particulier par voie intranasale. Au cours de ma thèse, une plateforme de production de VLP grippales composées d'hémagglutinine, de neuraminidase et de protéine de matrice M1 a été développée par transfection transitoire des cellules de mammifères. Des immunisations de souris BALB/c ont montré que les VLP de type A et B, purifiées et caractérisées, étaient immunogènes à de faibles doses par voie intramusculaire. L'administration par voie intranasale de VLP avec la sous-unité B de la toxine cholérique, comme adjuvant muqueux, a permis d'obtenir des taux d'anticorps sériques comparables à ceux obtenus par immunisation en intramusculaire mais également une forte réponse IgA au niveau des muqueuses. Par ailleurs, le rendement des VLP s'est révélé souche-dépendant et lié aux protéines HA et NA à la surface de la particule. Pour contourner ce problème, un vaccin quadrivalent composé de deux VLP bivalentes exprimant chacune deux HA et NA différentes à la surface a été produit montrant ainsi la flexibilité de cette plateforme / The influenza virus infects the mucous membranes of the respiratory tract. An intranasal vaccine induces an immune response close to the one induced by the natural infection by blocking the virus directly at the site of infection and allows needle-free vaccination. In addition, vaccines based on Virus-like Particles (VLP) produced in cells represent an interesting alternative to the traditional egg-based vaccine. VLPs are non-replicative particles that mimic the virus. Studies on influenza VLPs have shown protection by the intranasal route without adding an adjuvant. During my thesis, a platform for the production of influenza VLPs composed of the hemagglutinin, the neuraminidase and the M1 matrix proteins was developed by transient transfection of mammalian cells. Immunizations of BALB/c mice showed that the purified and characterized type A and B VLPs were immunogenic at low doses by the intramuscular route. The intranasal administration of VLPs with the B subunit of cholera toxin as a mucosal adjuvant resulted in serum antibody levels comparable to those obtained by intramuscular immunization but also a strong IgA response in the mucosal secretions. In addition, VLP yield was found to be strain-dependent and linked to the HA and NA proteins on the surface of the particle. To overcome this problem, a quadrivalent vaccine based on two bivalent VLPs each expressing two different HAs and NAs at the surface was produced, demonstrating the flexibility of this platform

L’avènement des multi-thérapies antirétrovirales a permis une réduction importante de la mortalité associée au VIH en induisant notamment la chute de la charge virale à moins de 50 copies/mL et une récupération progressive du nombre de lymphocytes T CD4+ (LT-CD4). Cependant, certains patients définis comme mauvais répondeurs immunologiques (MRI) ne parviennent pas à récupérer un taux de CD4 généralement considéré comme « protecteur » (>500cellules/µL). L’interleukine-7 (IL-7), cytokine essentielle à la thymopoïèse et à l’homéostasie lymphocytaire T, a été utilisée en étude clinique afin de restaurer et maintenir le taux de LT-CD4 chez les patients MRI. La première partie de mon travail de thèse visait à évaluer l’impact d’une telle thérapie sur le réservoir viral circulant. Dans l’essai clinique sur lequel nous avons travaillé (INSPIRE 3, Cytheris), des cycles d’administration d’IL-7 ont induit une augmentation significative du nombre de LT-CD4 et CD8 circulants, avec une expansion majoritaire des populations naïves et centrales mémoires. Nous avons montré qu’un cycle d’injections d’IL-7 induisait une augmentation significative de la quantité de cellules infectées circulantes 28 jours et 3 mois post-injection. Cependant, malgré l’accroissement de la fréquence de LT-CD4 infectés 28 jours post-injection, nous avons observé une diminution significative de la charge virale ADN par million de LT-CD4 chez la majorité des patients 3 mois après l’initiation de la thérapie, suggérant une élimination partielle de cellules infectées. Suite au second cycle d’injections, nous n’avons pas observé d’évolution de la quantité de cellules infectées circulantes ni de la fréquence de LT-CD4 infectés, suggérant un impact différent des 2 cycles d’injections sur la dynamique du réservoir viral périphérique. Enfin, certains patients ayant développé des anticorps neutralisants anti-IL-7 (Nab) suite au second cycle d’injections d’IL-7, nous avons cherché à identifier des facteurs prédictifs de l’apparition de ces anticorps ainsi que leurs conséquences physiologiques in vivo. Le seul paramètre caractérisant ces patients est l’amplitude de la reconstitution T-CD4 au cours du premier cycle d’injections d’IL-7. Il semble donc qu’une meilleure réponse à l’IL-7 ait pour conséquence de faciliter le développement de la réponse immune contre cette cytokine. Cependant, ces anticorps ne sont détectables que de façon transitoire chez les patients. De plus, nous avons observé une diminution significative, mais transitoire, de la prolifération des thymocytes chez les patients présentant des Nab, démontrant un impact fonctionnel de ces anticorps sur l’activité biologique de l’IL-7 endogène. L’injection systémique d’IL-7 induit la migration des cellules circulantes vers différents compartiments tissulaires lymphoïdes et non lymphoïdes. Dans une seconde partie de mon travail de thèse, j’ai étudié le pouvoir adjuvant de cette cytokine administrée localement par pulvérisation à la surface de la muqueuse vaginale. Dans le modèle macaque rhésus, nous avons mis en évidence une augmentation de la production d’un large spectre de chimiokines dans le chorion et l’épithélium vaginal des animaux 48 heures après l’administration vaginale d’IL-7. Cette surexpression de chimiokines s’accompagne d’une migration massive de LT-CD4, CD8, macrophages, cellules dendritiques et cellules NK dans cette muqueuse, suggérant l’augmentation de la vigilance immunologique. L’effet adjuvant de cette cytokine a été confirmé par l’analyse de la réponse humorale muqueuse de macaques vaccinés par pulvérisation vaginale d’antigènes 48h après l’administration du spray d’IL-7. Dans les lavages cervicovaginaux (CVL) des animaux traités à l’IL-7, nous avons mis en évidence des réponses spécifiques de type IgA et IgG plus rapides, plus fortes et plus durables que chez les animaux contrôles, démontrant la capacité de l’IL-7 à préparer la muqueuse vaginale à répondre à une stimulation antigénique locale. / Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART) has led to significant reduction of HIV-associated mortality by maintaining an undetectable viral load and inducing progressive CD4-T cell restoration. However, some patients, defined as poor immunological responders (PIR), fail to restore their CD4 counts to 500cells/µL during treatment, a threshold considered as the protective against AIDS related or non AIDS related malignancies, opportunistic infections and cardiovascular events. Interleukin-7 (IL-7), an essential cytokine for thymopoïesis and T cell homeostasis has been used in clinical trials aimed at restoring and maintaining CD4 counts in PIR patients. The first part of my thesis project aimed at assessing the impact of IL-7 therapy on circulating HIV reservoir. In the clinical study we worked on (INSPIRE 3, Cytheris), cycles of IL-7 injections led to a significant increase of the number of circulating CD4 and CD8 T-cells, with a predominance of naïve and central memory T cell expansion. We have shown that one cycle of IL-7 injections induced a significant increase in the number of circulating infected cells 28 days and 3 months post-injections. However, despite a significant increase in the frequency of infected CD4 T-cells 28 days post-injections, we observed a significant decrease of HIV-DNA load in CD4 T-cells in the majority of patients 3 months after the therapy initiation. These data suggest a partial elimination of HIV infected cells. After the second cycle of IL-7 injections, we did not observed any change in the number or frequency of circulating infected cells, suggesting a differential impact of the two IL-7 injection cycles on the dynamics of circulating HIV-reservoir. Finally, considering that some patients developed anti-IL-7 neutralizing antibodies (Nab) after the second cycle of IL-7 injections, we looked for predictive factors of this immunogenicity and analyzed its physiological consequences in vivo. The only parameter that distinguished Nab and non-Nab patients was the extent of CD4 T-cell reconstitution during the first cycle of therapy. This suggests that a better response to IL-7 also facilitates the development of auto-antibodies to the cytokine. However, these antibodies were only transiently detectable after the second cycle of therapy. Moreover, the appearance of Nab was associated with a significant but transient decrease of thymocyte proliferation, suggesting a functional impact of these antibodies on the endogenous IL-7 function. Systemic injection of IL-7 induces circulating T cells homing from the blood into lymphoid and non-lymphoid tissues. In the second part of my thesis project, I evaluated whether this cytokine could be used as an adjuvant when sprayed on the vaginal mucosa. Ten micrograms of IL-7 directly sprayed in the vaginal tract of rhesus monkeys induced, 48h after administration, the production of a large pattern of chemokines in the vaginal chorion and epithelium. This chemokine expression was accompanied by massive homing of CD4 and CD8-T cells, macrophages, dendritic cells and NK cells in the vaginal mucosa, suggesting an increased immunological vigilance. Finally, the adjuvant potential of this cytokine was confirmed by analyzing local humoral immune response after vaginal administration of antigens 48h following IL-7 spray. In cervicovaginal washes (CVL) of treated animals, we observed a faster, stronger and longer-lasting specific IgA and IgG response than in control animals, highlighting the capacity of IL-7 to prepare the vaginal mucosa response to local antigen stimulation.

Ce travail avait deux objectifs: 1) définir des groupes de patients (pts) susceptibles de bénéficier d’un conseil génétique par l’identification de facteurs prédictifs de l’existence d’une mutation du gène CDKN2A, un des gènes majeurs de prédisposition au mélanome, dans les familles ne comportant que deux cas (Fam_2 cas). 2) la caractérisation épidémiologique et clinique d’entités particulières du mélanome dans l’objectif secondaire de contribuer à l’identification de gènes de prédisposition à ces entités. Les 2 entités étudiées étaient le mélanome cutané (MC) associé au cancer du rein (CR) et les mélanomes muqueux de la sphère ano-génitale (MMAG).Les populations d’étude sont une collection de 293 pts atteints de MC recrutés de façon consécutive sans connaissance à priori de l'histoire familiale et la collection française MELARISK qui comprend ≥ 3000 sujets prélevés appartenant à des familles à cas multiples de mélanomes ou ayant un MC survenant dans un contexte particulier (association à un autre cancer, topographie rare, survenue avant l’âge de 20 ans, MC multiples sporadiques). Nous avons étudié l'effet de 3 facteurs prédictifs potentiels sur la présence d’une mutation de CDKN2A dans une famille en fonction du nombre de pts atteints dans une famille (2 pts versus ≥3 pts). L’étude a été menée dans 483 familles françaises comprenant 387 Fam_2 cas, et 96 familles avec ≥3 pts atteints de mélanome (Fam_3+ cas). Les facteurs étudiés dans la famille un à un puis conjointement étaient : l’âge médian <50 ans au diagnostic de MC, la survenue de ≥1 cas de MC primitifs multiples (MPM) et la survenue de ≥1 cas de cancer du pancréas (CPCP). La fréquence des mutations était plus élevée dans les Fam_3+ cas (32%) que dans les Fam_2 cas (13%). Alors qu’un âge jeune au diagnostic et la survenue de ≥ 1 MPM étaient associés à la présence de mutations de CDKN2A dans les Fam_2 cas, un âge jeune au diagnostic ainsi que la présence de ≥1 cas de CP était associé significativement aux mutations de CDKN2A dans les Fam_3+ cas. L’étude a montré que les caractéristiques cliniques associées aux mutations de CDKN2A varient, en France, pays de faible incidence de mélanome, en fonction du degré d’agrégation familiale. L’identification de facteurs prédictifs de mutations de CDKN2A dans les Fam_2 cas a contribué à définir des sous-groupes de familles (âge jeune au diagnostic, survenue de MPM) dans lesquels la fréquence des mutations de CDKN2A est supérieure à 20% et auxquels il est légitime de proposer un test génétique. L’analyse des deux séries de pts MM+CR et MMAG a permis d’identifier, en les comparant à la série de MC recrutés de manière consécutive, leurs caractéristiques cliniques et histologiques. Dans ces deux séries, nos résultats ont mis en évidence un contexte de prédisposition héréditaire en partie indépendant de CDKN2A. L’étude de l’association MC et CR chez un même patient a eu deux conséquences pratiques: pour les cliniciens ces résultats suggèrent l’intérêt d’un examen dermatologique en cas de CR et l’intérêt de l’échographie abdominale dans le bilan initial d’un MC pour le dépistage du CR; pour la recherche en génétique, cette série a contribué à l’identification d’une mutation germinale dans le gène MITF qui augmente le risque de développer un MC, un CR ou l’association des deux cancers et qui a des propriétés biologiques intéressantes. L’étude des MMAG a montré que ces mélanomes pouvaient être associés à des MC chez un même malade et/ou survenir dans un contexte familial de mélanome. Le corollaire clinique de ces résultats est que l’examen dermatologique de dépistage ou de surveillance doit être à la fois cutané et muqueux dans un contexte familial de mélanome et qu’en cas de MMAG un examen dermatologique des apparentés doit être proposé comme c’est la règle dans les MC. L’absence de mutation de CDKN2A dans ces localisations muqueuses incite à entreprendre des études génétiques pour identifier les gènes impliqués. / This thesis had two main objectives: 1) To define groups of patients which may benefit from genetic counseling by identifying predictors of mutations of the CDKN2A gene, a major gene predisposing to cutaneous melanoma (CM) in families with only two cases. 2) Epidemiological and clinical characterization of specific entities of melanoma with the secondary objective of contributing to the identification of susceptibility genes for these entities. Coexistence of CM with renal cell carcinoma and mucosal anogenital melanomas were studied.The study populations are a collection of 293 melanoma patients that were ascertained systematically and the French collection MELARISK which is a collection including over 3000 subjects drawn from families with multiple cases of melanoma or melanoma occurring in a particular context (association with another cancer, rare locations, occurrence before the age of 20, multiple sporadic melanomas).We investigated association of three clinical features with the presence of a CDKN2A mutation in a family by extent of CM family clustering (2 versus ≥3 CM patients among first-degree relatives in a family).The study was conducted in 483 French families including 387 families with two melanoma patients, and 96 families with three or more patients with melanoma. The factors examined individually and in a joint analysis in a family were: median age at diagnosis <50 years, ≥1 patient in a family with multiple primary melanomas (MPM) or with pancreatic cancer. The frequency of CDKN2A mutations was higher in F3+ families (32%) than in F2 families (13%). While early age at melanoma diagnosis and occurrence of MPM in ≥1 patient were significantly associated with the risk of a CDKN2A mutation in F2 families, early age at melanoma diagnosis and occurrence of pancreatic cancer in a family were significantly associated with CDKN2A mutations in F3+ families. Thus this study showed that clinical features associated with CDKN2A mutations vary, in France, a country of low incidence of melanoma, according to the degree of familial clustering. Identifying predictors of CDKN2A mutations in families with two melanoma cases has helped to define subgroups of families (early age at CM diagnosis, and/or ≥1 MPM patient) in which the frequency of CDKN2A mutations is above 20% such that these subgroups of F2 families should be offered genetic testing.The analysis of two series of patients, either patients with melanoma coexisting with renal cell carcinoma or patients with anogenital mucosal melanoma identified their clinical and histological features by comparing them to a series of melanomas that were ascertained systematically. In both series, our results suggested a genetic predisposition at least partly independent of CDKN2A. The study of the c renal cell carcinoma; coexistence of CM and renal cancer in the same patient had two practical consequences for clinicians: it suggests the interest of a dermatologic screening visit in patients with renal cell carcinoma and that abdominal ultrasonography or computed tomography scanning performed at the initial workup and during the follow-up of patients with CM may be of value for the early detection of renal cancer. Regarding genetic research, this series has contributed to the identification of a germline mutation in the MITF gene that increases the risk of developing melanoma, renal cancer or both cancers and has interesting biological properties. The study of anogenital melanoma has shown that these melanomas could be associated with cutaneous melanoma in the same patient and it has also shown a high frequency of family history of melanoma associating mucosal and CM suggesting a shared genetic predisposition. Consequently dermatological screening or monitoring must include examination of both skin and mucosa in families with multiple cases of CM; and in case of a mucosal melanoma, a dermatological examination should be offered to relatives. The genetic mechanism has to be identified