La peau l’un des plus grands organes du corps humain avec une superficie moyenne de 1,5m2 à 2m2 est à l’interface avec le monde extérieur et régule les échanges entre les deux milieux. Avec ses nombreuses invaginations et des apports nutritifs constants cet écosystème favorise la colonisation par des microorganismes. Les études taxonomiques basées sur le séquençage du gène rrs après amplification PCR à partir de l’ADN extrait ont permis de découvrir la diversité des différentes populations microbiennes qui colonisent la peau humaine dont peu sont cultivables in vitro. A côté des espèces communes à tous les individus une certaine spécificité individuelle a été trouvée de même qu’il a été montré que la surface du corps humain se différencie en régions avec des spécificités physico-chimiques propres pour lesquelles des correspondances taxonomiques du microbiote ont été détectées. Ce travail de thèse, réalisé dans le cadre d’un contrat CIFRE avec la société LibraGen a eu pour but d’aborder le volet fonctionnel du microbiote cutané grâce à l’application de l’approche séquençage haut débit de l’ADN metagénomique bactérien extrait de la peau humaine. Cet objectif a nécessité le développement d’une méthode de prélèvement‐extraction de l’ADN afin de remédier aux contraintes spécifiques de l’écosystème étudié, une faible densité microbienne et la putative présence de contamination par l’ADN humain. Les données de séquence obtenues nous ont permis de caractériser le potentiel fonctionnel du microbiote cutané des différents sites cutanés et, par comparaisons inter-environnementales de déterminer les fonctions spécifiquement rencontrées dans ce microbiote lié à l’homme. Les applications de ces travaux sont importantes comme par exemple la démonstration d’un effet sur le microbiote d’une application quotidienne d’onctions qui modifie tant la diversité taxonomique que le potentiel fonctionnel du microbiote cutané. / Skin is one of the largest human organs, with an average surface of 1.8 m2. At the interface between the human body and its external environment, skin is continually exposed to chemical and biological aggression and provides efficient protection of the human body. Its appearance is a good indicator of internal health, as skin reacts very rapidly to any change. Historically, skin microbiology was limited to the study of microorganisms isolated from skin pathologies, including those that provoke the pathological state and those that result from the pathology. However, the presence of skin microorganisms extends far beyond these pathological aspects, as non-pathological bacteria are detected everywhere on the skin, with up to 107 bacterial cells by cm2 in some areas. Skin is not a sterile human organ, but acts as an ecological niche for commensal microor- ganisms whose presence participates in protection against pathogens by preventing their colonization. Skin microbiology had been studied long before consid- ering the commensal skin bacteria, the majority of which could not be cultivated in vitro and the role of which was neglected until these new approaches, based on amplification and sequencing of DNA directly extracted from skin, were applied. Metagenomics revolutionized the study of microbiology in numerous environments where most bacteria are difficult to isolate. The first result of this approach was a more accurate estimation of microbial diversity, which had been underestimated by traditional approaches. However, interest in metagenomics exceeds a simple inventory of bacteria by providing information on their activity, function and interrelationship with other organisms.Our objective in this work realized in a CIFRE collaboration with Libragen company, was to study the functional profiles of the human skin microbiome with the application of metagenomic tools. This approach required first developing a method for the sampling and the dna extraction in order to overcome the constraints specific to this microbiome. Then, the sequencing data allowed characterizing the functional potential of the skin microorganisms in comparison to other environmental metagenome, and to find specificities of their local adaptations among three different skin sites. Applications of this work can be very important and one application tried in this thesis was the demonstration of the effect of several cutaneous cosmetic applications that modified the microflora at the taxonomic level and at the functional potential level.

Le mélanome cutané métastatique était un cancer au pronostic particulièrement péjoratif, jusqu’au développement récent de 2 classes pharmacologiques: l’immunothérapie, pour tous les mélanomes, et les thérapies ciblées, principalement pour les mélanomes porteurs de la mutation BRAF (50% des mélanomes cutanés). Mais l’apparition de résistance, et l’absence de thérapies ciblées sur les mélanomes non mutés BRAF, incitent à rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre travail portait sur l’étude in vitro de la phosphodiestérase de type 4 (PDE4), une enzyme régulant la voie de l’AMPc, principale voie de différenciation mélanocytaire. L’objectif était d’évaluer le rôle de PDE4 dans le mélanome, et l’effet de son inhibition par des molécules pharmacologiques déjà disponibles sur le marché.Dans une première partie, nous avons étudié le rôle de PDE4 dans les cellules de mélanomes mutés sur BRAF. Nous avons montré que l’isoforme PDE4D5 est surexprimée dans le mélanome, et régule l’invasion cellulaire par un mécanisme faisant intervenir la focal adhesion kinase, FAK. Dans les tumeurs nous avons observé une association entre le niveau d’expression de PDE4D5 et le degré d’invasion du mélanome.Dans une seconde partie, nous avons étudié l’effet de l’inhibition de PDE4 sur la prolifération cellulaire. Nous avons montré que la croissance des cellules de mélanome muté BRAF cultivées sous forme de mélanosphères, enrichies en cellules initiatrices de tumeurs, est réduite en présence d’inhibiteurs de PDE4. De plus les lignées BRAF muté résistantes aux inhibiteurs de BRAF gardent une sensibilité aux inhibiteurs de PDE4. Ces résultats, et ceux de l’équipe établis dans le mélanome muté sur RAS, corroborent l’hypothèse que PDE4 pourrait être une cible thérapeutique d’intérêt dans le traitement du mélanome métastatique / Metastatic melanoma was associated with a pejorative prognosis, until the recent development of 2 pharmacological classes: immunotherapy for all types of melanomas and targeted therapies, mainly for melanomas carrying the BRAF mutation (50% of skin melanomas). However, the emergence of resistance, and the absence of targeted therapies to treat non-mutated BRAF melanomas, prompt further research to study new therapeutic targets.Our work focused on the in vitro study of phosphodiesterase type 4 (PDE4), an enzyme regulating the cAMP pathway, the main pathway controlling melanocyte differentiation. The objective was to evaluate the role of PDE4 in melanoma and the effect of its inhibition by already available pharmacological molecules.First, we studied the role of PDE4 in BRAF mutated melanoma cells. We found that the PDE4D5 isoform is overexpressed in melanoma cells, and regulates cell invasion through a mechanism involving a focal adhesion kinase (FAK). We observed in tumor samples an association between the level of expression of PDE4D5 and the degree of invasion by melanoma cells.Second, we studied the effect of PDE4 inhibition on cell proliferation. We found that the proliferation of BRAF mutated melanoma cells grown as melanospheres, enriched with tumor-initiating cells, is reduced in the presence of PDE4 inhibitors. In addition, mutated BRAF strains resistant to BRAF inhibitors remain sensitive to PDE4 inhibitors. These results corroborate the hypothesis that PDE4 could be a potential target in the treatment of metastatic melanoma

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Au sein de notre organisme, l'équilibre entre les systèmes oxydants et antioxydants est étroitement contrôlé pour le maintien des fonctions biologiques vitales. Le stress oxydatif, défini comme un déséquilibre de la balance oxydative en faveur de l’oxydation, conduit à l’apparition de dégâts cellulaires associés au développement et à l’aggravation de très nombreuses pathologies ainsi qu’au vieillissement, notamment cutané. De nombreuses études visent à montrer les bénéfices d’une supplémentation en antioxydants dans la prévention des dommages liés au stress oxydatif. Dans ce sens, nos travaux ont porté sur l’identification de nouvelles sources naturelles d’antioxydants, valorisables comme ingrédients actifs dans des formulations nutraceutiques. Pour cela, nous avons sélectionné et extrait trente matières premières végétales et étudié les propriétés antioxydantes des extraits végétaux obtenus. Quatre extraits prometteurs ont été sélectionnés et caractérisés chimiquement afin d’identifier les composés phénoliques responsables de leurs propriétés antioxydantes. La contribution individuelle de ces composés phénoliques au potentiel antioxydant global des extraits a été estimée. Nous avons également étudié l’efficacité des extraits antioxydants sélectionnés sur le vieillissement cutané in vitro, par une étude globale de transcriptomique sur microarray, et confirmé les propriétés antioxydantes de ces extraits sur fibroblastes dermiques humains. / Within our body, the balance between oxidants and antioxidant systems is tightly controlled to maintain vital biological functions. Oxidative stress, defined as an imbalance of the oxidative balance in favor of oxidation, leading to the onset of cellular damage associated with the development and exacerbation of many diseases and with aging, including skin aging. Many studies aim to demonstrate the benefits of antioxidant supplementation in the prevention of damage related to oxidative stress. In that way, our work focused on identifying new sources of natural antioxidants, to value as active ingredients in nutraceutical formulations. For this, we selected and extracted thirty plant raw materials and studied the antioxidant properties of extracts obtained. Four promising extracts were selected and chemically characterized to identify the phenolic compounds responsible for their antioxidant properties. The individual contribution of these phenolic compounds to total antioxidant potential of extracts was estimated. We also studied the effectiveness of the selected antioxidants extracts on skin aging in vitro, by a transcriptomic study on microarray, and confirmed the antioxidant properties of these extracts on human dermal fibroblasts.

La dermatite atopique (DA) est une maladie inflammatoire et prurigineuse de la peau, très fréquente chez les enfants et dont la prévalence augmente dans les pays industrialisés. La physiopathologie complexe de cette maladie met en jeu un défaut de la barrière cutanée et/ou des défauts génétiques résultant en une hypersensibilité aux allergènes de l'environnement tels que ceux issus d'acariens. Récemment, des études sur les interactions entre le système immunitaire et les bactéries commensales et pathogènes de la peau ont révélé leur importance dans cette maladie. Pour étudier le rôle du microbiote cutané dans la réponse T CD4+, des cohortes de jeunes enfants, atteints de DA et sensibilisés aux allergènes d'acariens (Der p) ou non DA (population contrôle), ont été recrutées. L'analyse du microbiote (MALDI-TOF) et du profil transcriptomique cutanés, ainsi que la quantification des T CD4+ anti-Derp (ELISpot) ont montré que la présence de S. aureus sur la peau inflammatoire des sujets AD était associée à des taux élevés d'IgE, des transcrits caractéristiques d'une orientation Th2/Th22 et à une réponse périphérique Th2. Des cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDC) de donneurs sains produisent respectivement de l'IFN-gamma et de l'IL-10 en présence de sécrétomes issus de souches de S. aureus et S. epidermidis provenant de patients. La prolifération de lymphocytes T CD4+ stimulés avec des moDC allogéniques traitées avec le sécrétome de S. aureus est atténuée par le traitement simultané des moDC avec le sécrétome de S. epidermidis. Les sécrétomes de S. aureus sont capables d'inhiber directement l'activité suppressive de lymphocytes T régulateurs en l'absence de cellule présentatrice d'antigène. L'ensemble de nos résultats nous permet de penser que S. aureus est un facteur pro-inflammatoire de la DA en exacerbant la prolifération de lymphocytes Th2 résidents et en inhibant la fonction des lymphocytes T régulateurs. Favoriser les effets anti-inflammatoires des bactéries commensales telles que S. epidermidis liés à l'induction d'une sécrétion d'IL-10 par les cellules dendritiques de la peau pourrait bénéficier aux patients atteints de DA. / Atopic dermatitis (AD) is an inflammatory and pruritic skin disease frequently affecting children. Its prevalence is increasing in industrialized countries. Its complex pathophysiology involves a skin barrier dysfunction and/or genetic abnormalities leading to sensitivity to environmental allergens such as house dust mites. Interactions between the immune system and skin bacteria, pathogens and commensals, appeared to be important in the disease. To study the influence of skin microbiota in the CD4+ T cell response, we designed a cohort of young AD children sensitized to house dust mite allergens (Der p) and their counterparts (controls). Analysis of skin microbiota (MALDI-TOF), transcripts profiling and quantification of anti-Der p CD4+ T cells showed that the presence of S. aureus on inflamed skin of AD subjects was associated with high IgE levels, Th2/Th22 transcripts and peripheral Th2 anti-Der p response. Monocyte-derived dendritic cells (moDC) were exposed to secretomes produced by S. aureus and S. epidermidis strains isolated from patients and released IFN-gamma and IL-10 respectively. Proliferation of CD4+ T cells induced by allogeneic moDC exposed to S. aureus secretome was blunted by concurrent exposure of moDC to S. epidermidis secretome. Regulatory T cells (Treg) lost their activity against conventional CD4+ T cells under the direct effect of S. aureus secretome. Overall, these results allow us to think that S. aureus is an important factor of the AD inflammation by inducing Th2 activation and silencing resident Treg. Commensals such as S. epidermidis could be used to counteract these effects by inducing IL-10 production by skin DC.

Le vieillissement de la peau et l'exposition cumulative aux UVs au sein d'une vie affecte un certain nombre d'acteurs de la matrice extracellulaire, majoritairement le collagène, l'élastine, les glycanes et les biomolécules qui leurs sont associés (métalloprotéinases et leurs inhibiteurs, hyaluronidases, etc...) qui peuvent être modifiés en terme de concentration, de structure et/ou de répartition. L'organisation hydrique est également perturbée lors de ce phénomène et l'ensemble de ces modifications aboutit à une perte de fonction de la matrice et à l'apparition de manifestations cliniques du vieillissement. L'objectif de ce travail de thèse effectuée en partenariat avec le Centre de Recherche sur la peau (Pierre Fabre Dermo-Cosmétique) est d'analyser les modifications du derme et de l'organisation hydrique au sein de la matrice, avec l'âge et sous l'effet des UVs, de façon à mieux comprendre les altérations de la peau dans ces conditions. Compte tenu des différentes échelles à explorer - de l'Angstrom au micron -, la combinaison d'un ensemble de techniques est nécessaire pour disposer de lois de comportement de dynamique macromoléculaire qui permettent l'interprétation des résultats. Nous avons tout d'abord validé l'utilisation de la spectroscopie infra-rouge (IRTF), de l'analyse calorimétrique diatherme (ACD) et de la technique des courants thermostimulés (CTS) pour analyser des biopsies cutanées humaines. Ces techniques se sont révélées adaptées pour sonder le derme sur une large gamme d'échelle, et pour apporter des informations pertinentes sur les principales macromolécules du derme et sur son organisation hydrique. Nous avons ensuite suivi l'évolution des réponses thermiques, diélectriques et vibrationnelles du derme au cours du vieillissement chronologique et du photo-vieillissement via une étude clinique portant sur des sujets de deux groupes d'âge (20-30 ans et supérieur à 60 ans). Ce travail a permis d'extraire des marqueurs du vieillissement intrinsèque et extrinsèque. L'évolution de ces réponses a aussi été suivie dans une étude ex vivo portant sur les effets de l'exposition du derme aux UVs, afin de contribuer à la compréhension des différents mécanismes mis en jeu lors du vieillissement chronologique et du photo-vieillissement. / Skin aging and cumulative exposure to UVs within a lifetime affects a number of actors in the extracellular matrix such as collagen, elastin, glycans and associated biomolecules (metalloproteinases and their inhibitors, hyaluronidases, etc). The concentration, structure and / or distribution, and the hydric organization are modified by this phenomenon. All these modifications result in a loss of function of the matrix and the clinical manifestations of aging. The aim of this thesis, carried out in collaboration with the Skin Research Center of Pierre Fabre Dermo-Cosmétique, is to analyze the changes in the dermis and the hydric organization within the matrix with age and under the effect of UVs to help the knowledge of skin alteration under these conditions. Given the different scales to be explored - from Angstrom to the micron - a combination of different techniques is necessary to reach the macromolecular dynamics via behavior laws. Firstly, we validated the use of infrared spectroscopy (FTIR), differential scanning calorimetry (DSC) and thermostimulated Currents (TSC) techniques to analyze human cutaneous biopsies. These techniques were proven to be suitable to scan the dermis over a wide range of scales and to provide relevant information on the main macromolecules of the dermis and the different water structures. Then we studied the evolution of thermal, dielectric and vibrational signatures of the dermis during chronological aging and photo-aging via a clinical study involving subjects from two age groups (20-30 years and over 60 years). Markers of intrinsic and extrinsic aging have been extracted from this work. The evolution of these signatures was also studied in an ex vivo study on the effects of UV exposure of dermis, leading to a better understanding of the different mechanisms involved in chronological aging and photo-aging.

Le mélanome cutané est le cancer de la peau le plus agressif. Il représente moins de 5% des cancers de la peau mais sa forme métastatique est responsable de 60 à 80% des décès. La médiane de survie des patients atteints d’un mélanome métastatique n’est que de 6 à 9 mois avec les chimiothérapies classiques ou ciblées. L’immunothérapie a été un grand progrès thérapeutique, néanmoins la prise en charge du mélanome métastatique souffre encore de trois points négatifs, tous les patients ne répondent pas aux différents traitements, l’efficacité des chimiothérapies ciblées est limitée par l’apparition rapide de résistances, les cliniciens manquent de marqueurs prédictifs de l’évolution dès les stades précoces pour la prise en charge. Dans ce contexte, notre groupe s’intéresse à la méthylation de l’ADN associées à l’agressivité du mélanome. La méthylation est catalysée par les méthyltransférases de l’ADN (DNMTs). Lorsque celle-ci est présente au niveau d’îlots CpGs localisés dans les promoteurs des gènes, elle empêche la machinerie transcriptionnelle de se mettre en place et inhibe l’expression du gène correspondant. Le profil de méthylation globale de l’ADN étant altéré dans le cancer, elle a donc un rôle fonctionnel dans le processus tumoral mais peut aussi être utilisée en tant que biomarqueur, chaque cancer ayant un profil de méthylation différent. De plus, au sein d’un même cancer, ce profil évolue avec la progression de la tumeur. Au cours de cette thèse, j’ai identifié des modifications du profil de méthylation de l’ADN associées à l’agressivité du mélanome et j'ai sélectionné 9 loci hyperméthylés candidats biomarqueurs. J’ai d’abord comparé les profils de méthylation au niveau du génome entier de lignées cellulaires de mélanome correspondant à des stades d’agressivité différents. À partir de ces informations, des loci candidats ont été choisis par une analyse de la répartition de ces loci hyperméthylés sur le génome couplée à une analyse bioinformatique des fonctions et interactions des gènes associés. Ensuite, leur statut de méthylation a été validé par une technique différente (collaboration avec le Dr. J. Tost, CNG, Evry). Une fois leur hyperméthylation confirmée, j’ai entrepris l’analyse de la méthylation de l’ADN au niveau de ces gènes dans des échantillons de tumeurs primaires issues de patients montrant des survies différentes (Collaboration : L. Lamant, N. Meyer, IUCT, Toulouse, France; L. Lanfrancone IFOM, Milan, Italie). Notre étude confirme le statut hyperméthylé des gènes retenus dans les échantillons métastatiques par rapport aux échantillons de tumeurs primaires. De plus il apparaît un lien entre le niveau de méthylation de la tumeur primaire et le délai d’apparition de métastases ainsi que la survie globale des patients. Parmi les loci sélectionnés, j’ai déterminé si le statut hyperméthylé de ces loci est corrélé à leur sous- expression dans le but d’étudier leur rôle dans l’agressivité du mélanome, et si ces loci peuvent être déméthylés et ré-exprimés par un inhibiteur de DNMTs. Cela a amené à l’identification d’un gène et d'un miR peu décrits dans la littérature, dont les expressions sont corrélées au statut de méthylation et modulées par un traitement déméthylant l'ADN. J’ai entrepris de comprendre leur rôle dans l’agressivité du mélanome et évaluer leur intérêt potentiel en tant que cibles anti-tumorales. Pour cela, j’ai utilisé des tests fonctionnels pour étudier les conséquences de la surexpression dans la lignée métastatique ou de l’inhibition dans la lignée primaire. Les résultats suggèrent une régulation épigénétique fine de ce miR et de ce gène pendant la progression du mélanome, retrouvée indépendamment par notre analyse des tumeurs de patients de la banque TCGA. / Cutaneous melanoma is the most aggressive skin cancer and represents less than 5% of skin cancers but its metastatic form is responsible for 60-80% of the deaths. The median survival for patients with metastatic melanoma is only 6 to 9 months with conventional chemotherapy or targeted therapy. Despite recent therapeutic advances with the immune-therapies, the treatment of metastatic melanoma still suffers from three negatives drawbacks: 1) All patients do not respond to the different treatments. 2) The effectiveness of the targeted chemotherapy is limited by the rapid emergence of resistance. 3) Predictive biomarkers of the evolution of the disease are lacking for the clinicians. In this context, we studied the epigenetic regulations associated with the aggressiveness of melanoma, particularly in DNA methylation. DNA methylation is catalyzed by DNA methyltransferases (DNMTs). When CpGs islands are methylated and located in the promoters of genes, expression of the corresponding gene is inhibited. Commonly, DNA methylation profile is altered in cancer and plays a role in tumorigenesis and tumor maintenance. In addition, the alterations of the DNA methylation profile can be used as biomarkers for prognostic and diagnostic. Here, I identified changes in the DNA methylation profile associated with the aggressiveness of melanoma and selected 9 candidates loci that are hypermethylated in the most aggressive forms of melanoma. First, I compared the methylation patterns genome-wide (450K BeadChip methylation) of melanoma cell lines bearing different aggressiveness. The loci biomarker candidates were selected by combining an analysis of the distribution of these hypermethylated loci on the genome and a bioinformatic analysis of the functions and interactions of the associated genes. Their methylation status was validated by a different technique in collaboration with Dr. J. Tost, CNG, Evry. Once confirmed their hypermethylation, I started to analyze the DNA methylation of the selected genes in the pairs of cell lines of different aggressiveness, such as the primary tumor compared to the metastasis from the same patient, and in patients samples of primary tumors (Collaboration L. Lamant, N. Meyer, iUCT, Toulouse, France; L. Lanfrancone IFOM, Milan, Italy). A total of twenty samples were analyzed. Our study confirms the status of selected hypermethylated genes in metastatic samples compared to primary tumors. Moreover there is a link between the level of methylation of the primary tumor and the overall survival. A patent is being filed in and new samples are collected in order to extend the patient cohort to validate the biomarkers in prognosis of the evolution of the disease. Among the selected loci, I determined whether their hypermethylated status is correlated with their under-expression. For this, I measured their level of expression in a couple of cell lines WM115 / WM266-4 by RT-PCR and RT-qPCR. Then, I chose the loci for which I observed a correlation between methylation and expression. In addition, I studied whether these loci can be demethylated and re-expressed by a DNMTs inhibitor. This led to the identification of a microRNA and gene not fully described in the literature, of which the expression is correlated to DNA methylation status and are reactivated upon treatment with demethylating agents. I explored the role of the microRNA and the gene in the aggressive features of the metastatic melanoma suggesting a tumor suppressive function. These data were further comforted by the data analysis of patient samples.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

En oncologie, l’anatomopathologie est le « gold standard » pour le diagnostic et l’évaluationpronostique de lésions tumorales à l’échelle tissulaire. Depuis peu, les spectroscopiesvibrationnelles, notamment IR, représentent des axes de développement prometteurs pour cettespécialité en ouvrant la voie à l’histologie spectrale. Bien que « la preuve de concept » de cettedémarche soit maintenant réalisée, il reste encore de nombreux points à traiter avant un transfertvers la clinique. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à deux d’entre eux, impliqués dans lavitesse d’obtention, la qualité et le contenu informatif des images spectrales ; à savoir ledéparaffinage numérique des coupes tissulaires et la construction automatique et non supervisée deces images par biométrie floue. Afin de s’affranchir du déparaffinage chimique, nous avons montréque comparativement à l’ICA-NCLS, la méthode de prétraitement des spectres IR par EMSCs’avère la plus adaptée à l’élimination de la signature spectrale de la paraffine. Cette étape permetdonc l’utilisation directe de coupes tissulaires conventionnelles en histologie spectrale et rendpossible des études rétrospectives. La construction d’images spectrales capables de révéler les zonestumorales et les différentes structures tissulaires nécessite des méthodes performantes declassification des données IR. Basé sur la classification floue (FCM, Fuzzy C-Means), nous avonsmis au point un algorithme permettant d’optimiser le nombre de classes K et le paramètre de flou mde façon automatique et simultanée. L’algorithme a été testé au niveau de différents types decancers cutanés comme des carcinomes basocellulaires (BCC), spinocellulaires (SCC), maladies deBowen et mélanomes et comparé aux classifications « dures », comme le K-means (KM) etl’analyse par classification hiérarchique (ACH). Les images FCM révèlent une forte hétérogénéitéintra-tumorale pour les BCC, SCC et mélanomes et permettent de mieux caractériserl’interconnectivité entre les structures tissulaires saines et tumorales. De plus, pour certainestumeurs infiltrantes comme les SCC, un front d’invasion tumoral est mis en évidence ainsi que sesconnexions avec le tissu environnant. En conclusion, l’ensemble de ces résultats souligne le fortpotentiel de l’association microspectroscopie IR/biométrie floue pour la caractérisation de lésionstumorales / In oncology, anatomical pathology is the "gold standard" for diagnosis and prognostic evaluation of tumor lesions on a tissue scale. Since recently, vibrational spectroscopies, especially IR spectroscopy, represent promising guidelines of development for this specialty paving the way for spectral histology. Although "proof of concept" of this approach is now done, there are still many issues before its transfer into the clinic. In this study we focused on two important issues, namely digital dewaxing of the paraffin-embedded tissue sections, and automatic and unsupervised construction of spectral images by fuzzy biometric methods, which are rapid and provide high quality content spectral information.In order to overcome the chemical dewaxing, we have shown that compared to the ICA-NCLS, the IR spectra preprocessing method by EMSC is better for the elimination of paraffin spectral signature. This step thus allows the direct use of conventional tissue sections in spectral histology and enables retrospective studies. The construction of spectral images which reveal tumor areas and the different tissue structures requires efficient methods of IR data clustering. Based on the fuzzy clustering (FCM, Fuzzy C-Means), we developed an algorithm permitting to automatically and simultaneously optimize the number of clusters K and the fuzzy parameter m. This algorithm was applied to different types of skin cancers such as basal cell carcinomas (BCC), squamous cell carcinomas (SCC), Bowen's diseases and melanomas and compared with the "hard" clustering methods as K-means (KM) and Analysis by Hierarchical Clustering (AHC). The FCM images reveal strong intratumoral heterogeneity for BCC, SCC and melanomas and allow better characterization of the interconnectivity between the tumor and healthy tissue structures. In addition, for some invasive tumors such as SCC, a tumor invasive front is highlighted as well as its connections with the surrounding tissue. In conclusion, all these results highlight the potential of the IR microspectroscopy/fuzzy biometric methods association for characterization of tumor lesions.

En cancérologie cervico-faciale, la couverture d’éléments nobles ou de pertes de substance profondes fait souvent appel à l’utilisation de lambeaux locaux, locorégionaux ou libres. La réalisation de lambeaux autologues nécessite de sacrifier une structure indemne au profit de la structure lésée. Lorsque la réalisation d’un lambeau n’est pas envisageable, l’utilisation de substitut dermique peut être une alternative.L’ingénierie tissulaire permet de cultiver presque tous les types cellulaires (cellules différenciées, cellules souches) seuls ou en association (pe peau totale reconstruite) avec des matrices telles que le collagène pour obtenir des cultures tridimensionnelles. Utilisées in vivo en tant que substrat dermique, les matrices de collagène vont servir de guide aux cellules de l’hôte qui vont la coloniser, synthétiser leur propre matrice extra-cellulaire et développer un réseau vasculaire.Les tissus reconstruits se comportent comme des greffes : leur nutrition se fait d’abord par imbibition à partir du site receveur, puis par recolonisation vasculaire à partir du lit de la greffe. L’épaisseur du tissu greffable est donc limitée.Une revue de la littérature sur la peau reconstruite par ingénierie tissulaire et des différentes stratégies de vascularisation d’un tissu reconstruit est présentée. Le but de notre travail était d’évaluer les capacités des substituts dermiques comme vecteur de cellules souches pour la régénération tissulaire in vivo et comme support au développement d’une neovascularisation à partir d’un vaisseau sanguin ouvrant la voie au lambeau microanastomosable reconstruit in vitro. / In head and neck cancer, coverage of noble elements or deep wounds often requires the use of local, locoregional or free flaps. Autologous flaps consist of transferring the patient’s own tissues, but require sacrifice of the healthy structure to replace the damaged structure. When performing a flap is not an option, the use of dermal substitute may be an alternative.Tissue engineering is a rapidly growing discipline comprising multiple fields of research. Almost all cell types can be cultured alone or in combination (e.g. reconstructed full-thickness skin) with matrices such as collagen to obtain three dimensional cultures. Collagen matrices, used in vivo as dermal substrates, are used to guide the growth of host cells (fibroblasts, endothelial cells, etc.) that colonize the matrix, synthesize their own extracellular matrix and develop a vascular network.Reconstructed tissues behave like tissue grafts: nutrition of these tissues is initially based on diffusion from the recipient site and then by vascular recolonization from the bed of the graft. The thickness of graftable tissue is therefore limited.A review of the literature on skin tissue engineering and current strategies to create vascularized tissue is presented. The aim of our study was to evaluate the capacity of dermal substitutes as a carrier of stem cells for tissue regeneration in vivo and as a support to the development of neovascularization from a blood vessel opening the way to flap suitable for microvascular transplantation reconstructed in vitro.