Le lymphome cutané primitif (LCP) CD30+ est une lymphoprolifération maligne de phénotype T. Son oncogenèse reste à ce jour inconnue. Le but de ma thèse est d'identifier des gènes exprimés spécifiquement dans les LCP CD30+ afin de comprendre les mécanismes d'oncogenèse et également d'identifier des marqueurs diagnostics ou thérapeutiques. Des banques d'ADNc soustraites sont réalisées par SSH « Suppressive Subtractive Hybridisation » entre des LCP CD30+ et des lymphocytes sanguins. Ces banques sont ensuite criblées par des techniques de Dot Blot avec des sondes radiomarquées spécifiques des échantillons étudiés. Les clones sélectionnés sont enfin validés par PCR en temps réel. Nous avons ainsi mis en évidence cinq gènes surexprimés dans les LCP CD30+ : THW, p120caténine, SPARC, PTTG1, CD30 et cinq gènes sousexprimés : humanine, CIN85, Bcl11B, CD30 L et CD30s. Il reste à vérifier si ces gènes sont responsables de l'oncogenèse ou s'ils sont uniquement des phénotypes des LCP CD30+.

Ce travail concerne l'étude des propriétés biologiques d'hydrogels physiques bicouches de chitosane, dont l'usage est destiné à la cicatrisation des brûlures du 3ème degré. L'étude bactériologique a révélé que les dispositifs présentaient des propriétés bactériostatiques voire bactéricides de grand intérêt pour l'application visée. L'étude à long terme de la cicatrisation en présence des hydrogels physiques bicouches de chitosane a montré que ces dispositifs permettent la reconstruction d'un tissu bien organisé, bien vascularisé et aux propriétés mécaniques et esthétiques similaires à celles d'un tissu sain. L'avantage thérapeutique du dispositif proposé est que le système hydrogel n'a pas à être remplacé au cours de la cicatrisation, contrairement aux pansements traditionnels qui nécessitent d'être changés régulièrement, impliquant risques d'infection, douleurs et altération du tissu en formation. Le tissu cutané a été étudié au cours de ce travail à différentes échelles et selon différentes approches complémentaires : une approche esthétique et clinique (photos, calques), mécanique (tests de traction), histologique et immuno-histologique, et enfin nanostructurale grâce à l'utilisation conjointe de la microscopie électronique et de la diffusion des rayons X aux petits angles. L'étude histologique détaillée des interactions biologiques entre le tissu hôte et le dispositif a permis de valider son caractère biocompatible, biorésorbable et colonisable, et d'envisager son utilisation en ingénierie tissulaire en tant que milieu à gradient de propriétés biologiques, favorable au développement de néo-tissu cutané.

La peau est un excellent modèle d’étude du vieillissement général. En plus de facteurs environnementaux, les facteurs génétiques jouent un rôle majeur dans le vieillissement cutané. Dans le cadre de ma thèse, j’ai eu accès à une cohorte exceptionnelle de 502 femmes caucasiennes très bien caractérisées sur le plan cutané, pour effectuer deux études d’association « génome-entier ». La première étude a montré le rôle joué par le système immunitaire, et en particulier le gène HLA‑C, dans la sévérité des lentigines du visage. La seconde a mis en évidence une association entre le gène H2AFY2 et la sévérité de l’affaissement de la paupière supérieure. La recherche de voies de signalisation biologiques associées à différents indicateurs du vieillissement cutané a souligné le rôle de la mélanogénèse et des mécanismes de réparation de l’ADN.Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension des mécanismes inhérents au vieillissement cutané et général. / The skin is an excellent model to study general ageing. In addition to environmental factors, genetic factors play a key role in skin ageing mechanisms. During my PhD, I have had access to a unique cohort of 502 Caucasian women very-well characterized regarding their facial features to perform two genome-wide association studies. The first one pointed to the role of the immune system, and especially the HLA‑C gene, in the severity of facial lentigines. The second one identified an association between the H2AFY2 gene and the severity of superior eyelid drooping. I also looked for associations between biological pathways and several skin ageing indicators which underlined the role of the melanogenesis and several mechanisms of DNA repair.Overall, these results lead to new insights in the understanding of the molecular mechanisms underlying skin and global ageing.

Les aquaporines (AQPs) sont des petites protéines formant des canaux hydriques àtravers les membranes cellulaires. Les AQPs 0, 1, 2 ,4 ,5 ,6 et 8 assurent le transport sélectif de l'eautandis que les AQPs 3, 7, 9 et 10 permettent également le passage du glycérol. Nous avons étudié leurexpression dans l'épiderme, la couche supérieure de notre peau supposée imperméable. Dans lesmélanocytes, des cellules dendritiques responsables de la pigmentation, seule l'AQP1 est exprimée.Nous avons montré que les kératinocytes, les cellules majoritaires de l'épiderme, expriment enprolifération les AQPs 3 et 10, alors que les kératinocytes différenciés expriment les AQPs 3 et 9. Lalocalisation de l'AQP3 a été précédemment rapportée à la membrane plasmique des kératinocytes, de lacouche basales à la couche épineuse. Nous avons localisé l'AQP9 dans les kératinocytes différenciés dela couche granuleuse au contenu riche en glycérol et réduit en eau. De fait nous pensons que l'AQP9 ysert de transporteur de glycérol. Enfin contrairement à d'autres auteurs, nous n'avons pu mettre enévidence de lien entre prolifération tumorale et expression des aquaporines.

Le carcinome basocellulaire (CBC) est un cancer cutané très fréquent représentant un problème de santé publique majeur. Il métastase rarement mais peut devenir très invasif localement s’il n’est pas pris en charge rapidement. Actuellement, le diagnostic de certitude du CBC est obtenu par examen anatomopathologique de coupes fines ; ce qui présente pour inconvénient d’être invasif et de donner une réponse différée. De plus, la chirurgie du CBC ne bénéficie pas d’outil permettant de définir en temps réel la largeur optimale des marges de sécurité ; celles-ci devant être minimales pour éviter les séquelles esthétiques mais suffisantes pour empêcher toute récidive. L’objectif de ces travaux de thèse est d’évaluer l’apport potentiel de la spectroscopie Raman dans la prise en charge du CBC. Cette technologie applicable in vivo grâce au développement de sondes adaptées, permet une exploration tissulaire à un niveau moléculaire relativement rapide. Au total, 32 patients ont été inclus dans cette étude. A partir des spectres enregistrés in vivo, un modèle de discrimination CBC / peau saine a été développé, à partir duquel les marges d’excision latérales ont pu être évaluées. Les marges profondes ont également été étudiées après enregistrement de spectres sur les pièces fraichement excisées. Des marqueurs Raman de discrimination ont été identifiés aux différentes échelles in vivo, ex vivo et in vitro; ils constituent des bio-indicateurs potentiels pour orienter la prise de décision chirurgicale. Enfin, la contribution des fonds spectraux, habituellement écartés des analyses Raman, a été considérée et leur intérêt dans le cadre de ce projet a été discuté. / Basal cell carcinoma (BCC) is the most common skin cancer and a major problem for healthcare services worldwide. BCC rarely metastasizes but can become highly damaging for surrounding tissue in case of late diagnosis. Actually, the gold standard for BCC diagnosis relies on histopathological assessment of thin sections, but it is an invasive method which provides a delayed response. Moreover, it will be helpful during surgery of BCC to assess in real-time the optimal size of the security margins, which has to be small enough to minimize aesthetic sequelae but sufficient to avoid recurrence. The aim of this work is to evaluate the potential contribution of Raman spectroscopy in the management of BCC. This technology can be applied in vivo thanks to the development of appropriate probes and allows a relatively rapid tissue exploration at a molecular level. A total of 32 patients were included in this study. From in vivo recorded spectra, a model of discrimination BCC / healthy skin was implemented, from which the width of excision margins was evaluated. Deep margins were also studied after recording spectra on freshly excised pieces. Discriminant Raman markers were identified at different levels in vivo, ex vivo and in vitro; they are potential bio-indicators to help the surgeon to define ideal excision margins. In addition, the contribution of spectral backgrounds, usually removed from Raman analysis, was considered and their interest in this project was discussed

La peau et son vieillissement sont un enjeu de santé publique. Les modèles expérimentaux disponibles pour l'étude du vieillissement cutané restent perfectibles. Dans ce contexte, nos objectifs étaient simultanément d'utiliser les modèles de peaux reconstruites (PR) développés dans notre laboratoire afin i) de mieux comprendre les mécanismes du vieillissement cutané, ii) de démontrer l'efficacité et le mécanisme d'action du sélénium comme « anti âge » et enfin iii) de les faire évoluer en utilisant le support poreux ou auto-assemblé avec des fibroblastes du même donneur prélevés à des âges différents. Ainsi, le modèle de PR cultivé sur une longue période a montré une surexpression du microARN miR30-a par RT qPCR dans les PR « âgées » avec une altération de la fonction barrière mesurée par la perte insensible en eau et une perturbation de la différenciation terminale (baisse d'expression de la loricrine et de l'involucrine). Avec le même modèle in vitro, nos résultats démontrent que la supplementation en sélénium retarde la sénescence des kératinocytes souches. Cette efficacité passe non pas par un effet antioxydant comme attendu mais par l'activation de leur adhésion à la lame basale, qui participe à les conserver souche et donc à préserver le renouvellement épidermique. Enfin, nous avons eu la chance exceptionnelle de préparer des PR avec des fibroblastes provenant d'un donneur unique prélevé à 36 et 72 ans. Les résultats immunohistologiques montrent que l'âge induit une augmentation de l'expression de l'élastine et de la fibrilline ainsi que leur co-expression. L'augmentation de LTBP1 et aSMA suggère que cette augmentation inattendue est due à une dérégulation de la voie TGF-ß et une différenciation des fibroblastes en myofibroblastes. En conclusion l'utilisation de différents modèles de PR a permis d'explorer les mécanismes conduisant au vieillissement cutané et de démontrer l'efficacité du sélénium comme anti âge / Skin and its aging is a public health issue. In vitro skin models available for the study aging remain perfectible. In this context, our objectives were simultaneously to use skin equivalent (SE) developed in our laboratory i) to better understand mechanisms of skin aging, ii) to demonstrate the effectiveness of selenium as “anti-aging” and finally iii) to improve SE using the porous or scaffold free model with fibroblasts from the same donor at different ages. Thus, the model of SE mimicking senescence showed an overexpression of microRNA miR30-a by RT qPCR in old SE with an alteration of the barrier function measured by the transepidermal water loss and a deficiency of epidermal terminal differentiation (decreased expression of loricrin and involucrin). With the same SE model, our results demonstrate that selenium supplementation delays the senescence of keratinocytes stem cells. This effectiveness does not involve antioxidant effect as expected but the activation of their adhesion to the basement membrane, which participates in preserving stemness and epidermal renewal. Finally, we had the opportunity to prepare SE with fibroblasts from a single donor at 36 and 72 years old. The histological results show that age induces an increase in the expression of elastin and fibrillin as well as their co-expression. The increase of LTBP1 and aSMA suggests that this unexpected increase is due to deregulation of the TGF-ß pathway and fibroblasts differentiation into myofibroblasts. In conclusion, the use of different models of SE helps us to explore some mechanisms leading to skin aging and to demonstrate the efficacy of selenium as “anti-aging”

Le film hydrolipidique est « l’ultime frontière entre l’organisme et l’environnement ». Ainsi, il offre à la peau une bonne protection et contribue largement à ses propriétés. Cependant, il peut être impliqué dans plusieurs perturbations cutanées. Le but de ce travail était d’obtenir un profil global de l’ensemble des lipides cutanés de surface, riche en informations structurales et capable de décrire l’organisation de ces molécules, permettant de suivre l’évolution physiologique du film hydrolipidique au niveau moléculaire. Plusieurs approches analytiques ont été développées et des outils statistiques et chimiométriques ont été utilisés pour exploiter les résultats.La caractérisation des lipides cutanés de surface (LCS) a été réalisée en chromatographie en phase gazeuse à haute température couplée à la spectrométrie de masse (HT-GC/MS). Le protocole analytique a été développé en conservant les structures lipidiques dans leur état intact. Plus de 200 composés ont été identifiés et répartis en 5 classes : acides gras libres, hydrocarbures, cires, stérols et glycérides. L’acide palmitique (C16:0) et l’acide sapiénique (C16:16) sont prépondérants et entrent dans la structure de très nombreux composés. Plusieurs approches quantitatives ont été mises en place : calcul des descripteurs chromatographiques, normalisation interne pour l’analyse par classe et exploitation chimiométrique des composés considérés individuellement.Trois problématiques ont été explorées par ces techniques et ont conduit aux résultats suivants :La répartition des LCS sur différentes zones corporelles se traduit par un ratio squalène/cholestérol plus élevé dans les zones riches en glandes sébacées que dans les zones pauvres. Ce descripteur est ainsi un bon critère d’évaluation de la balance sécrétion sébacée/desquamation. L’évolution des LCS en fonction de la localisation géographique et/ou la couleur de la peau a été étudiée en cherchant les variations de la composition par HT-GC/MS et de l’organisation par spectroscopie Raman. Une différence de composition a été mise en évidence entre les volontaires en fonction de la localisation géographique : le composé le plus impliqué est l’acide sapiénique (C16:1Δ6). Une différence de conformation (trans/gauche) au niveau des chaînes alkyles a été détectée.Enfin, l’adaptation de la barrière cutanée après la naissance a été déjà signalée mais sa traduction au plan moléculaire a pu être étudiée par le protocole analytique développé, chez les nourrissons dès les premiers jours après la naissance jusqu’à l’âge de 6 mois. Une diminution de la quantité globale de sécrétion sébacée a été observée, avec en parallèle, une augmentation sélective du cholestérol estérifié par des acides gras d’origine épidermique. Ceci indique un accroissement de la participation relative des lipides épidermiques dans le film hydrolipidique comme résultat d’une diminution de la sécrétion sébacée.Les approches analytiques développées dans ce travail de thèse permettent une caractérisation moléculaire fine des LCS en vue d’étudier l’évolution physiologique du film hydrolipidique. Les outils statistiques et chimiométriques ont permis une exploitation plus poussée des résultats pour extraire des informations inaccessibles par les approches classiques. Ce travail d’investigation offre de nombreuses perspectives, très prometteuses dans le domaine médical et dans le domaine cosmétique. / Skin hydrolipidic film is "the final frontier between the organism and the environment." Thus, it provides skin protection and contributes to its properties. However, it may be involved in several skin disturbances. The aim of this study was to obtain an overall profile of skin surface lipids (SSLs), rich in structural information and able to describe the organization of these molecules. This information allows monitoring the physiological evolution of hydrolipidic film at the molecular level. Several analytical approaches have been developed and chemometric and statistical tools were used to improve the interpretation of the results.SSL characterization was performed using high-temperature gas chromatography coupled with mass spectrometry (HT-GC/MS). The analytical protocol has been developed keeping the lipids in their intact structures. Over than 200 compounds were identified in the same run. These compounds have been classified in five lipid classes: free fatty acids, hydrocarbons, waxes, sterols and glycerides. The palmitic acid (C16:0) and sapienic acid (C16:16) are predominant and participate in the structure of many compounds. Several quantitative approaches have been implemented: calculation of chromatographic descriptors, normalization of the peak area for analysis by class and chemometric exploitation of individual compounds data.Three issues were explored by these techniques and lead to have the following results:The SSL distribution on different areas of the body, expressed as a squalene / cholesterol ratio, is higher in body areas rich in sebaceous glands than in poor areas. This descriptor is thus a good criterion for sebum secretion / desquamation balance measurement.The SSL evolution based on the geographical location and / or color of skin has been investigated by studying the variations in the composition and organization using HT-GC/MS and Raman spectroscopy. A difference in composition has been demonstrated between the volunteers according to geographical location: the most involved compound is the sapienic acid (C16: 1Δ6). A difference in conformation (trans / gauche) of at the alkyl chains was detected. Skin barrier adaptation after birth has already been reported. In this study, its evolution at the molecular level has been studied in infants from the first days after birth until the age of 6 months. A decrease in the total amount of sebaceous secretion was observed with, in parallel, an increase of cholesterol esterified with fatty acids of epidermal origin. This indicates an increase in the relative participation of epidermal lipids in the hydrolipidic film as the result of a decrease in sebaceous secretion. The analytical approaches developed in this thesis provide a detailed molecular characterization of SSLs in order to study the physiological evolution of the skin hydrolipidic film. Statistical and chemometric tools have allowed further exploitation of the results to extract information not accessible by conventional approaches. This investigative work offers many opportunities, promising in medicine and in cosmetics.

Le microbiote digestif humain joue un rôle essentiel et bénéfique pour son hôte mais il est également impliqué dans un nombre croissant de pathologies. Les connaissances sur la composition de cet écosystème ont récemment été révolutionnées grâce à l’utilisation de techniques moléculaires. Cependant, ces techniques comportent des limites importantes. C’est ainsi que le concept de « culturomique » a été introduit ; il consiste en la multiplication de milieux et conditions de culture et l’identification rapide de colonies bactériennes par spectrométrie de masse (MALDITOF) ou par amplification et séquençage du gène de l’ARN ribosomal 16S. Dans la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence une association entre la présence de Clostridium butyricum dans les selles et la survenue d’entérocolite ulcéro-nécrosante que ce soit par méthodes de pyroséquençage et culture ou par PCR quantitative en temps réel spécifique de C. butyricum; identifié après séquençage du génome complet de toutes nos souches de C. butyricum, la présence du gène de la β-hémolysine (toxine). Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons montré par cuturomique que les bactéries à Gram-négatif (BGN) étaient fréquemment disséminées au sein du microbiote cutané transitoire des patients hospitalisés en réanimation ; le réservoir serait essentiellement digestif. En conclusion, le microbiote digestif constitue un réservoir sousestimé de bactéries pathogènes. La microbiologie moderne incluant les nouvelles méthodes de culture permet d’étendre de manière considérable les connaissances sur la composition de cet écosystème et son implication en pathologie humaine. / He human gut microbiota plays an important and beneficial role in its host but it is also involved in a growing number of diseases. Knowledge of the composition of this ecosystem have recently been revolutionized by the use of molecular techniques. However, these techniques have significant limitations. Thus, the concept of "culturomics" has been introduced; it consists of the multiplication of culture conditions and the rapid identification of bacterial colonies by mass spectrometry (MALDI-TOF) or by PCR 16S RNA gene sequencing. In the first part of this work, we have demonstrated an association between the presence of Clostridium butyricum in the stool and the occurrence of necrotizing enterocolitis whether by pyrosequencing methods and Culture or by quantitative PCR specific real time C. butyricum; identified after sequencing the complete genome of all our strains of C. butyricum, the presence of the gene of β-hemolysin (toxin). In the second part of this work, we showed by cuturomics that Gram-negative bacteria (BGN) were frequently spread out over the transitional skin microbiota of patients hospitalized in intensive care; the reservoir would essentially digestive. In conclusion, the gut microbiota is an underestimated reservoir of pathogenic bacteria. Modern microbiology including new culture-based methods is currently extending exponentially our knowledge on gut microbiota giving rise to new insights into the pathogenesis or the transmission of infectious diseases.

Le mélanome est le cancer de la peau le plus dangereux : il est capable de métastaser rapidement vers les ganglions et les viscères, et est réfractaire aux chimio/radiothérapies. De nouvelles thérapies ciblant la kinase BRAFV600 retrouvée dans 60% des mélanomes ont montré des effets spectaculaires en termes de survie globale et sans progression de la maladie. L’efficacité de ces thérapies est compromise par l’apparition fréquente de résistances. Les cellules cancéreuses sont ancrées au sein d’un microenvironnement avec lequel elles interagissent. Elles profitent de facteurs solubles du stroma et de l’adhésion à la matrice extracellulaire (MEC) pour survivre face aux thérapies. La protéine matricellulaire SPARC orchestre les interactions entre les cellules saines ou cancéreuses et leur microenvironnement. Absente dans les mélanocytes, son expression est initiée et augmentée dans les mélanomes, corrélée à la progression tumorale et à un mauvais pronostic clinique. Lorsqu’elle est sécrétée par les cellules de mélanome, elle active la kinase AKT, déstabilise le suppresseur de tumeur p53 et favorise la prolifération/survie tumorale. Nous avons montré que le module SPARC/AKT est un nouveau déterminant de la résistance innée ou acquise des mélanomes mutés BRAFV600 aux anti-BRAF, et mis en évidence l’intérêt du ciblage de SPARC en combinaison avec des anti-BRAF ou -MEK pour optimiser/restaurer la sensibilité des mélanomes à ces inhibiteurs. Nous avons aussi montré que les fibroblastes ganglionnaires ont des caractéristiques de fibroblastes activés, et confèrent une résistance aux anti-BRAF aux cellules de mélanomes en générant une MEC permissive à laquelle elles adhérent. / Melanoma is the most dangerous form of skin cancer due to its high metastatic potential and its resistance to both classical chemo- and radiotherapies. New targeted therapies directed against the V600E oncogenic form of BRAF found in about 60% of patients have demonstrated spectacular efficacy both in terms of progression free and overall survival. However most patients invariably relapse after a few months due to resistance mechanisms. Cancer cells are anchored and interact constantly with their microenvironment. Both soluble factors and the extracellular matrix produced by stromal cells have been shown to contribute to cancer cell resistance to therapies. SPARC is a matricellular protein that orchestrates interactions between normal and/or cancer cells and their microenvironment. While it is absent in melanocytes, SPARC expression increases in melanoma and is correlated with both tumoral progression and a bad prognosis. When SPARC is secreted by melanoma cells, it activates the AKT kinase, destabilizes the p53 tumor suppressor and promotes proliferation and survival. Here we identify the couple SPARC/AKT as a new actor contributing to both innate and acquired resistance to BRAFV600E inhibitors. In addition, we demonstrate that targeting SPARC in melanoma cells increases their sensitivity to both BRAF and MEK inhibitors. Finally we show that lymph node fibroblasts share features of activated fibroblasts and confer resistance to BRAF inhibitors to melanoma cells through the production of a permissive extracellular matrix.

En pratique clinique, les résultats de l’Anesthésie Loco-Régionale diffèrent parfois notablement de ceux prévus par les traités d’anatomie. Le but de notre travail a été de montrer que les nerfs musculocutané (MC) et cutanémédial de l’avant-bras (CMAB) participent fréquemment à l’innervation cutanée de la paume de la main. L’analyse multivariée de 551 patients opérés du canal carpien a révélé que l’absence de bloc du nerf MC était associée aux échecs de l’ALR. Pourtant, ce résultat était en partie masqué par une fréquente diffusion d’anesthésique local du nerf médian vers le nerf MC au bras, comme le prouve l’étude échographique de l’anatomie des nerfs au creux axillaire chez 387 autres patients. Une cartographie du territoire cutané des nerfs MC (N=28) et CMAB (N=2l) à la face antérieure de la main et du poignet a révélé des territoires bien plus étendus que ceux décrits dans la littérature. Les microdissections de ces 2 nerfs sur 23 membres supérieurs ont permis d’associer les différents types de territoires décrits lors des cartographies à diverses configurations anatomiques. Il convient donc d’anesthésier ces deux nerfs pour toute chirurgie de la paume de la main. / In daily practice, the extent of peripheral nerve blockade often differs from the one predicted by referencetextbooks. In this work, we strived to demonstrate that musculocutaneous (MC) and medial antebrachialcutaneous (MABC) nerves participate frequently in the palm innervation. A multivariate analysis of 551 patients operated from carpal tunnel release showed that the absence of MC nerve block was associated with anesthesia failure. Yet, these results were minimized by frequent local anesthetic diffusion from the median nerve to the MC one at the arm, as demonstrated by our anatomical study of the nerves in 387 ultrasound guided axillary blocks. Cutaneous territory mapping of MC (N28) and MABC (N=2 1) nerves revealed their territories were far more extended than the ones described in reference textbooks. Microdissections of these nerves on 23 upper limbs allow to associate the different types of territories with several anatomical patterns. Therefore, MC and MABC nerve should be blocked when considering any palm surgery.