In this study I investigate the role of Schwann cell and axon-derived trophic signals as modifiers of axonal integrity and sprouting in motoneuron disease and diabetic neuropathy (DNP). The first part of this thesis focuses on the role of the Schwann-cell-derived ciliary neurotrophic factor (CNTF) for compensatory sprouting in a mouse model for mild spinal muscular atrophy (SMA). In the second part, the role of the insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and its binding protein 5 (IGFBP-5) is examined in the peripheral nerves of patients with DNP and in two corresponding mouse models. Proximal SMA is caused by homozygous loss or mutation of the SMN1 gene on human chromosome 5. The different forms of SMA can be divided into four groups, depending on the levels of SMN protein produced from a second SMN gene (SMN2) and the severity of the disease. Patients with milder forms of the disease, type III and type IV SMA, normally reach adulthood and regularly show enlargement of motor units, signifying the reinnervation of denervated muscle fibers. However, the underlying mechanisms are not understood. Smn+/- mice, a model of type III/IV SMA, are phenotypically normal, but they reveal progressive loss of motor neurons and denervation of motor endplates starting at 4 weeks of age. The progressive loss of spinal motor neurons reaches 50% at 12 months but muscle strength is not reduced. The first evidence for axonal sprouting as a compensatory mechanism in these animals was the more than 2-fold increase in amplitude of single motor unit action potentials (SMUAP) in the gastrocnemius muscle. Confocal analysis confirmed pronounced sprouting of innervating motor axons. As CNTF is highly expressed in Schwann cells and known to be involved in sprouting, its role for this compensatory sprouting response and the maintenance of muscle strength in Smn+/- mice was investigated. Deletion of CNTF in this mouse model results in reduced sprouting and decline of muscle strength in Smn+/- Cntf-/- mice. These findings indicate that CNTF is necessary for a sprouting response and thus enhances the size of motor units in skeletal muscles of Smn+/- mice. DNP afflicting motor and sensory nerve fibers is a major complication in diabetes mellitus. The underlying cellular mechanisms of motor axon degeneration are poorly understood. IGFBP-5, an inhibitory binding protein for IGF-1, is highly upregulated in peripheral nerves in patients with DNP. The study investigates the pathogenic relevance of this finding in transgenic mice overexpressing IGFBP-5 in motor axons. These mice develop motor axonopathy similar to that seen in DNP. Motor axon degeneration is also observed in mice in which the IGF-1 receptor (IGF-1R) was conditionally depleted in motoneurons, indicating that reduced activity of IGF-1 on IGF-1R in motoneurons is responsible for the observed effect. These data provide evidence that elevated expression of IGFBP-5 in diabetic nerves reduces the availability of IGF-1 for IGF-1R on motor axons leading to progressive neurodegeneration, and thus offers novel treatment strategies. / In dieser Arbeit habe ich die Rolle der neurotrophen Faktoren Ciliary neurotrophic factor (CNTF) und Insulin-like-growth factor 1 (IGF-1), die in Schwannzellen gebildet werden, als Modulatoren der axonalen Integrität bei einer degenerativen Motoneuronenerkrankung und bei diabetischer Neuropathie (DNP) untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit wird gezeigt, dass CNTF für ein kompensatorisches Sprouting von motorischen Axonen in einem Mausmodell für spinale Muskelatrophie (SMA) verantwortlich ist. Im zweiten Teil wird die Rolle von IGF-1 und dessen Bindeprotein, IGFBP-5, in Axonen motorischer Nerven bei Patienten mit DNP und zwei korrespondieren Mausmodellen gezeigt. Die proximale SMA wird durch einen homozygoten Verlust oder Mutation des SMN1 Gens auf dem Chromosom 5 verursacht. Bei der spinalen Muskelatrophie unterscheidet man verschiedene Schweregrade, abhängig von der Menge an SMN Protein, das vom zweiten SMN Gen (SMN2) produziert werden kann. Patienten mit einer milderen Form von SMA (Typ III und IV) erreichen das Erwachsenenalter und zeigen oft vergrößerte motorische Einheiten, im Gegensatz zu Patienten mit den schweren kindlichen Formen der Erkrankung. Smn+/- Mäuse, ein Modell für die leichten SMA Formen Typ II und IV, zeigen denervierte Endplatten bereits 4 Wochen nach der Geburt und einen fortschreitenden Verlust von Motoneuronen, der nach 12 Monaten mehr als 50% beträgt, ohne dass sich die Muskelkraft der Tiere verringert. Die Amplitude der Summenpotenziale von einzelnen motorischen Einheiten (Single motor unit action potential, SMUAP) im Wadenmuskel ist mehr als 2-fach erhöht. Konfokale Aufnahmen bestätigen ausgeprägtes Sprouting der noch innervierenden Axone. Smn+/- Mäuse ohne CNTF, das normalerweise stark in Schwann-Zellen exprimiert ist, zeigen reduziertes Sprouting und verringerte Muskelkraft. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass CNTF für das Sprouting und die vergrößerten motorischen Einheiten in Smn+/- Mäusen verantwortlich ist. Dieser kompensatorische Mechanismus könnte neue Behandlungs-möglichkeiten für Motoneuronerkrankungen eröffnen. Die Diabetische Neuropathie (DNP), eine der Hauptkomplikationen bei Diabetes Mellitus, betrifft sowohl motorische als auch sensorische Nervenfasern. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen, die zur Degeneration motorischer Axone in Spätstadien der Erkrankung führen, sind größtenteils noch ungeklärt. IGFBP-5, ein IGF-1 hemmendes Bindeprotein, ist in peripheren Nervbiopsien von DNP Patienten stark überexprimiert. Diese potenzielle pathogene Relevanz wurde bei IGFBP-5 überexprimierenden transgenen Mäusen untersucht. Diese Mäuse entwickeln ähnlich wie die DNP Patienten eine motorische Axonopathie. Diese Axondegeneration zeigen auch Mäuse, bei denen der IGF-1 Rezeptor (IGF-1R) neuronenspezifisch ausgeschaltet wurde. Das bedeutet, dass reduzierte Wirkung von IGF-1 am IGF-1R auf Axonen von Motoneuronen für die beobachtete Axonopathie verantwortlich ist. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass erhöhtes IGFBP-5 in diabetischen Nerven die Verfügbarkeit von IGF-1 für den IGF-1R reduziert und zu progressiver Neurodegeneration führt. Diese Erkenntnis könnte neue Behandlungsstrategien für Patienten mit DNP eröffnen.

In highly polarized neurons, endoplasmic reticulum (ER) forms a dynamic and continuous network in axons that plays important roles in lipid synthesis, Ca2+ homeostasis and the maintenance of synapses. However, the mechanisms underlying the regulation of axonal ER dynamics and its function in regulation of local translation still remain elusive. In the course of my thesis, I investigated the fast dynamic movements of ER and ribosomes in the growth cone of wildtype motoneurons as well as motoneurons from a mouse model of Spinal Muscular Atrophy (SMA), in response to Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) stimulation. Live cell imaging data show that ER extends into axonal growth cone filopodia along actin filaments and disruption of actin cytoskeleton by cytochalasin D treatment impairs the dynamic movement of ER in the axonal filopodia. In contrast to filopodia, ER movements in the growth cone core seem to depend on coordinated actions of the actin and microtubule cytoskeleton. Myosin VI is especially required for ER movements into filopodia and drebrin A mediates actin/microtubule coordinated ER dynamics. Furthermore, we found that BDNF/TrkB signaling induces assembly of 80S ribosomes in growth cones on a time scale of seconds. Activated ribosomes relocate to the presynaptic ER and undergo local translation. These findings describe the dynamic interaction between ER and ribosomes during local translation and identify a novel potential function for the presynaptic ER in intra-axonal synthesis of transmembrane proteins such as the α-1β subunit of N-type Ca2+ channels in motoneurons. In addition, we demonstrate that in Smn-deficient motoneurons, ER dynamic movements are impaired in axonal growth cones that seems to be due to impaired actin cytoskeleton. Interestingly, ribosomes fail to undergo rapid structural changes in Smn-deficient growth cones and do not associate to ER in response to BDNF. Thus, aberrant ER dynamics and ribosome response to extracellular stimuli could affect axonal growth and presynaptic function and maintenance, thereby contributing to the pathology of SMA. / Das Endoplasmatische Retikulum (ER) bildet ein dynamisches und kontinuierliches Netzwerk in Axonen von stark polarisierten Neuronen und spielt dabei eine wichtige Rolle in der Lipidsynthese, dem Ca2+ Homöostase und der Aufrechterhaltung von Synapsen. Allerding sind die Mechanismen, die der Regulierung der axonalen ER-Dynamik und seiner Funktion bei der dynamischen Regulierung der lokalen Translation zugrunde liegen, nicht vollständig aufgeklärt. Im Rahmen meiner Dissertation habe ich die schnellen dynamischen Bewegungen des ERs und Ribosomen in Wachstumskegeln von Wildtyp- und Smn-defizienten Motoneuronen als Reaktion auf einen kurzen Puls von Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) untersucht. Daten der Bildgebung lebender Zellen zeigen, dass sich das ER in axonalen Filopodien des Wachstumskegels entlang von Aktin-Filamenten ausbreitet. Die Beeinträchtigung des Aktin-Zytoskeletts mittels Cytochalasin D Behandlung führt zu einer Einschränkung der dynamischen Bewegung des ERs in den axonalen Filopodien. Im Gegensatz zu den Filopodien scheinen die Bewegungen des ERs in Wachstumskegeln von einem koordinierten Zusammenspiel des Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts zu beruhen. Myosin VI ist insbesondere für die ER-Bewegungen in Filopodien erforderlich, während Drebrin A die Aktin/Mikrotubuli koordinierte ER-Dynamik vermittelt. Darüber hinaus zeigte sich, dass das BDNF/TrkB Signal die Bildung von 80S-Ribosomen in Wachstumskegeln in Sekundenschnelle auslöst. Aktivierte Ribosomen verlagern sich in das präsynaptische ER und vollziehen eine lokale Translation. Diese Ergebnisse beschreiben die dynamische Interaktion zwischen ER und Ribosomen während der lokalen Translation und zeigen eine neuartige potentielle Funktion des präsynaptischen ER bei der intra-axonalen Synthese von Transmembranproteinen wie die α-1β Untereinheit der N-Typ Ca2+ Kanäle in Motoneuronen auf. Darüber hinaus zeigen wir, dass in Smn-defizienten Motoneuronen die dynamischen ER-Bewegungen in axonalen Wachstumskegeln beeinträchtigt sind, was mit einer gestörten Polymerisation von Aktinfilamenten zusammenzuhängen scheint. Interessanterweise erfahren Ribosomen in Smn-defizienten Wachstumskegeln keine schnellen strukturellen Veränderungen und assoziieren nicht mit dem ER als Reaktion auf BDNF. Somit könnten eine abweichende ER-Dynamik und die Reaktion der Ribosomen auf extrazelluläre Reize das axonale Wachstum und die präsynaptische Funktion und Aufrechterhaltung beeinträchtigen und damit zur Pathologie von SMA beitragen.

Spinal muscular atrophy (SMA) is a genetic pediatric condition that affects lower motoneurons leading to their degeneration and muscle weakness. It is caused by homozygous loss or mutations in the Survival Motor Neuron 1 (SMN1) gene; however, the pathomechanism leading to motoneuron degeneration is not fully resolved. Cultured embryonic SMA motoneurons display axon elongation and differentiation defects accompanied by collapsed growth cones with a disturbed actin cytoskeleton. Intriguingly, motoneurons cultured from mice deficient for the Tropomyosin-kinase receptor B (TrkB), exhibit similar pathological features. Thus, the question arises whether SMA motoneurons suffer from defective Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)/TrkB signaling and whether there is a link to the disturbed actin cytoskeleton. In the recent years, modifier genes such as Plastin 3 (PLS3) were shown to beneficially interfere with SMA pathology. Nevertheless, the mechanism of how the actin-bundler PLS3 counteracts SMN deficiency is not well understood. In this study, we investigated TrkB localization and its activation in cultured SMA motoneurons and neuromuscular junctions (NMJs). While TrkB levels are only mildly affected locally in axon terminals, BDNF-mediated TrkB phosphorylation was massively disturbed. The activity-dependent TrkB translocation to the cell surface and its activation via BDNF were shown to be Pls3-dependent processes, that can be abolished by knockdown of Pls3. In contrast, PLS3 overexpression in SMA motoneurons rescued the defects on morphological and functional level. In particular, the relocation of TrkB to the cell surface after BDNF-induced internalization is disturbed in SMA, which is based on an actin-dependent TrkB translocation defect from intracellular stores. Lastly, AAV9-mediated PLS3 overexpression in vivo in neonatal SMA mice provided further evidence for the capacity of PLS3 to modulate actin dynamics necessary for accurate BDNF/TrkB signaling. In conclusion, we provide a novel role for PLS3 in mediating proper alignment of transmembrane proteins as prerequisite for their appropriate functioning. Hence, PLS3 is required for a key process indispensable for the development and function of motoneurons even beyond the context of SMA. / Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine Erkrankung der unteren Motoneurone, die zu deren Degeneration und Muskelschwund führt. Ausgelöst wird sie durch Verlust oder Mutation des Survival Motor Neuron 1 Gens. Kultivierte embryonale Motoneurone von SMA Mäusen zeigen eine veränderte zelluläre Differenzierung, sowie kollabierte Wachstumskegel und ein gestörtes Aktin Zytoskelett. Interessanterweise zeigen Motoneurone mit einem Verlust des Tropomyosinrezeptorkinase B (TrkB) die gleichen zellulären Dysregulationen. Daher stellte sich die Frage, ob SMA Motoneurone eine Störung der Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)/TrkB Signalkaskade entwickeln, die auf einem gestörten Aktin Zytoskelett beruht. Studien der letzten Jahre haben gezeigt, dass modifizierende Gene wie Plastin 3 (PLS3) eine schützende Wirkung auf die SMA Pathophysiologie haben. Allerdings ist der genaue Mechanismus, inwieweit PLS3 F-Aktin-gesteuerte Prozesse reguliert nicht gut verstanden. In dieser Studie haben wir die Lokalisierung und Aktivierbarkeit von TrkB in Motoneuronen und Endplatten von SMA Mäusen untersucht. Obwohl die Lokalisierung von TrkB nur wenig verändert ist, war die Aktivierung von TrkB via BDNF in den Axonterminalen stark beeinträchtigt. Außerdem stellten sich die aktivitätsabhängige TrkB Translokation zur Plasmamembran, als auch dessen BNDF-induzierte Phosphorylierung als Pls3-abhängige Prozesse heraus, die durch Pls3 Knockdown inhibiert werden konnten. Im Gegensatz dazu, bewirkt die PLS3 Überexpression in SMA Motoneuronen eine Wiederherstellung der morphologischen und funktionellen Defekte. Vor allem die gestörte Re-Lokalisierung von TrkB an die Zellmembran nach BDNF-Stimulation, welches auf einer defekten Translokation aus intrazellulären Speichern basiert, konnte durch PLS3 Überexpression verbessert wird. Des Weiteren brachte die Viren-basierte PLS3 Überexpression in SMA Mäusen weitere Beweise für die Fähigkeit von PLS3, die Aktin Dynamik zu regulieren. Zusammenfassend zeigen die Daten eine neue Rolle von PLS3 für die korrekte Anordnung von Transmembranproteinen, als Grundvoraussetzung für deren Funktionalität. Somit wird PLS3 für Schlüsselprozesse benötigt, die für die Entwicklung und Funktion von Motoneuronen, auch über den Kontext von SMA hinaus, unverzichtbar sind.

Eine optimale Nachbehandlung operativ versorgter Sprunggelenksfrakturen bzw. Tibiakopffrakturen ist immens wichtig, um die Funktionsfähigkeit, Muskelkraft, -masse, -funktion und Gelenkbeweglichkeit aufrecht zu erhalten bzw. wiederherzustellen. Ziel ist es, nach der eingetretenen Verletzung und der operativen Versorgung negative Auswirkungen zu vermeiden bzw. möglichst gering zu halten, um Kraft, Ausdauer und körperliche Leistungsfähigkeit zu gewährleisten, da diese entscheidend für die Wiedererlangung einer uneingeschränkten Mobilität sind. Bisher erhielten die Patienten mit einer Sprunggelenk- bzw. Tibiakopffraktur eine Krankengymnastik, manuelle Lymphdrainage und Kryotherapie im Rahmen der Standard-Physiotherapie. Verschiedene Studien bei neurologischen und orthopädisch-unfallchirurgischen Krankheitsbildern konnten im Rahmen der Nutzung eines Antigravitationslaufbandes positive Veränderungen z.B. bezüglich der Gehkinematik, der funktionellen Beweglichkeit und der Muskelkraft sowie der Schmerzsymptomatik zeigen. So liegt es nahe, dass auch Patienten mit einer Sprunggelenk- bzw. Tibiakopffraktur von einer Therapie auf einem Antigravitationslaufband profitieren können. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, den Effekt eines Antigravitationslaufbandes bei Patienten mit Sprunggelenk- bzw. Tibiakopffrakturen zu zeigen. Es wurden 73 Patienten mit einer Sprunggelenkfraktur bzw. Tibiakopffraktur und postoperativer Teilbelastung randomisiert und der Interventionsgruppe oder der Kontrollgruppe zugeteilt. Die Patienten in der Kontrollgruppe erhielten eine sechswöchige Standard-Physiotherapie mit einer Krankengymnastik, manuellen Lymphdrainage und Kryotherapie. Die Patienten in der Interventionsgruppe absolvierten an Stelle der Krankengymnastik ein 20-minütiges Training auf einem Antigravitationslaufband und bekamen entsprechend der Patienten in der Kontrollgruppe eine manuelle Lymphdrainage sowie Kryotherapie. Alle Patienten erhielten zu definierten Zeitpunkten Fragebögen. Hier wurden die Veränderungen des Gesamt-FAOS (Foot and Ankle Outcome Score) für Sprunggelenksfrakturen und des Gesamt-KOOS (Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score) für Tibiakopffrakturen sowie die jeweiligen Subscores in jeder Gruppe erfasst. Zur quantitativen Beurteilung der Muskelatrophie des Oberschenkels wurde in jeder Untersuchung der Umfang beider unterer Extremitäten an definierten Stellen zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Verglichen wurden die Unterschiede zum Zeitpunkt T4 (6 Wochen postoperativ) und im Vergleich T4-T1 (T1=Baseline, Tag des Studieneinschlusses) für jede Gruppe (Interventions- versus Kontrollgruppe der Patienten mit Tibiakopffrakturen bzw. Sprunggelenksfrakturen) sowie das Gesamtkollektiv. In den Patient Reported Outcomes unterschieden sich zu Studienbeginn die mittleren Gesamt-FAOS- bzw. Gesamt-KOOS-Scores der Kontroll- versus Interventionsgruppe nur marginal. Auch in den Subscores fanden sich nur geringfügige Unterschiede zwischen den Gruppen. Im Gesamtkollektiv der Patienten mit einer Tibiakopffraktur bzw. einer Sprunggelenkfraktur fanden sich 6 Wochen postoperativ gemischte Ergebnisse. So profitierte die Kontrollgruppe in vier der fünf Subscores (Symptome, Aktivitäten des täglichen Lebens, Sport/Freizeit, Lebensqualität). Nur der Subscore Schmerz wurde durch die Interventionsgruppe minimal geringer bewertet. Im Vergleich T4-T1 fanden sich ähnliche Ergebnisse. Ausnahme bildet der Subscore Sport/Freizeit, bei dem die Interventionsgruppe nun ein geringfügig besseres Ergebnis erzielte als die Kontrollgruppe. Die Patienten mit einer Sprunggelenkfraktur tendierten, wie auch das Gesamtkollektiv, 6 Wochen postoperativ im Vergleich zur Baseline in vier von fünf Subscores (Symptome, Aktivitäten des täglichen Lebens, Sport/Freizeit, Lebensqualität) dazu, von der Standard-Physiotherapie zu profitieren. Ausnahme war auch hier der Subscore Schmerz, bei dem die Interventionsgruppe bessere Ergebnisse erzielte. Dieses Ergebnis fand sich nach der sechswöchigen Teilbelastung sowie im Vergleich T4-T1. Diese Ergebnisse waren jedoch weder signifikant noch klinisch relevant. Von einer klinischen Relevanz spricht man ab einer Minimal Important Change (MIC) von 8-10 Punkten. Im Gegensatz zu den Patienten mit einer Sprunggelenkfraktur profitierten die Patienten mit einer Tibiakopffraktur eher von der Therapie auf dem Antigravitationslaufband. Dies zeigte sich in den Subscores Schmerz und Aktivitäten des täglichen Lebens und noch deutlicher im Bereich Sport/Freizeit und Lebensqualität. Und obwohl die Unterschiede statistisch nicht signifikant waren, stellten sie doch im Sport/Freizeit und der Lebensqualität einen klinisch relevanten Unterschied auf der Grundlage unserer Intervention mit dem Antigravitationslaufband dar. So ergab sich im Bereich Lebensqualität zum Zeitpunkt T4 mit 16,1 Punkten Differenz ein klinisch relevantes Ergebnis zugunsten der Laufbandtherapie. Im Vergleich T4-T1 lag der Unterschied sogar bei 18,9 Punkte. Auch im Subscore Sport/Freizeit zeigte sich mit 14,9 Punkten Unterschied ein klinisch relevantes Ergebnis in der Interventionsgruppe im Vergleich T4-T1. Verschiedene Studien mit anderen Krankheitsbildern konnten ähnliche Ergebnisse aufweisen [10, 48, 54, 65]. In der Umfangmessung fand sich bei den Patienten mit einer Tibiakopffraktur eine Umfangdifferenz von 4,6 cm im Vergleich T4-T1. Dieser Grad der Veränderung in der Messung des Beinumfanges als Maß für die Muskelatrophie war signifikant (Signifikanzniveau p=0,005). Ein weiteres signifikantes Ergebnis fand sich im Gesamtkollektiv mit einer Differenz von 1,9 cm im Vergleich T4-T1 (Signifikanzniveau p=0,007). Schlussfolgerung Erstmals wurden Patienten nach der operativen Versorgung einer Tibiakopf- bzw. Sprunggelenkfraktur in der postoperativen Nachbehandlung mit einer Standard-Physiotherapie bzw. der Therapie auf einem Antigravitationslaufband verglichen. Obwohl sich in den Patient Reported Outcomes beider Gruppen keine statistisch signifikanten Ergebnisse zeigten, konnten klinisch relevante Unterschiede detektiert werden. Es zeigte sich bei der Umfangmessung im Gesamtkollektiv sowie in der Interventionsgruppe der Patienten mit Tibiakopffrakturen ein signifikanter Unterschied bzgl. der Muskelatrophie im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bisher war es nicht möglich, bei Patienten mit postoperativer Teilbelastung durch ein gezieltes Trainingsprogramm einem Muskelschwund entgegenzuwirken. Mit Hilfe einer Therapie auf einem Antigravitationslaufband konnten wir dies in unserer Studie insbesondere bei Patienten mit Tibiakopffrakturen nachweisen. Schließlich steht eine Therapie auf einem Antigravitationslaufband einem Standard-Rehabilitationsprotokoll nicht nach und sollte als ergänzende Therapieoption zur Erhaltung und Verbesserung bzw. schnelleren Regeneration der Muskulatur zusätzlich zur Standard-Physiotherapie eingesetzt werden, um bessere Kurz- und möglicherweise auch bessere Langzeitergebnisse zu erzielen.:INHALTSVERZEICHNIS I. Abkürzungsverzeichnis………………………………………….………………….. 4 1 Einführung 5 1.1 Sprunggelenkfrakturen 7 1.1.1 Epidemiologie 7 1.1.2 Ursachen und Unfallmechanismus 7 1.1.3 Anatomische Grundlagen und Biomechanik 7 1.1.4 Klassifikation 8 1.1.5 Diagnostik 8 1.1.6 Therapie 8 1.1.6.1 Konservative Therapie 9 1.1.6.2 Operative Therapie 9 1.1.7 Postoperative Nachbehandlung 9 1.2 Tibiakopffrakturen 10 1.2.1 Epidemiologie 10 1.2.2 Ursachen und Unfallmechanismus 10 1.2.3 Anatomische Grundlagen und Biomechanik 10 1.2.4 Klassifikation 11 1.2.5 Diagnostik 12 1.2.6 Therapie 12 1.2.6.1 Konservative Therapie 12 1.2.6.2 Operative Therapie 13 1.2.7 Postoperative Nachbehandlung 13 1.3 Einordnung in die aktuelle Literatur 14 1.4 Ziel der Studie 16 2 Publikationsmanuskript 17 3 Zusammenfassung der Arbeit 29 3.1 Patient Reported Outcomes 31 3.2 Umfangmessung 32 3.3 Schlussfolgerung 32 4 Literaturverzeichnis 34 5 Darstellung des eigenen Beitrags 42 6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 44 7 Lebenslauf 45 8 Publikationen 47 9 Danksagung 48

Die Spinalen Muskelatrophie (SMA) ist eine neurodegenerative Krankheit, die durch einen Mangel an Survival Motor Neuron (SMN) Protein verursacht wird. Die vorliegende Dissertation vergleicht drei SMA-Mausmodelle, um festzustellen, ob sich die Pathologien und die zeitliche Abfolge gleichen. Das SMN-Delta7-Modell zeigt umfassende Defekte im motorischen System, einschließlich der Degeneration von Motoneuronen, sowie der Denervierung von spinalen exzitatorischen Synapsen und neuromuskulären Endplatten. Im Gegensatz dazu weist das Taiwanese Modell milde Motoneuron-Pathologien, aber einen frühen Verlust zentraler Synapsen auf. Beim intermediären Smn2B/- Modell treten starke Pathologien in zentralen exzitatorischen Synapsen und Neuromuskulären Endplatten auf, gefolgt von einem späten Absterben der Motoneurone, das p53-abhängig ist. Diese Ereignisse korrelieren mit einer SMN-abhängigen Störung der Splicing-Regulation bestimmter mRNAs. Die Studie liefert eine Wissensgrundlage für zukünftige Untersuchungen und identifiziert die zentrale exzitatorische Synaptopathie als Schlüsselmerkmal der motorischen Pathologie bei SMA.:Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis .................................................................................................. III Abkürzungsverzeichnis.................................................................................................IV 1 Bibliographische Zusammenfassung............................................................... 1 2 Einführung ......................................................................................................... 2 2.1 Der sensomotorische Schaltkreis im Rückenmark .................................... 2 2.2 Grundlagen der spinalen Muskelatrophie (SMA)....................................... 6 2.3 Mechanismen der Motoneurondegeneration in SMA ................................ 9 2.4 Die Rolle peripherer und zentraler Synapsen in SMA…………………….11 3 Ziele der Arbeit................................................................................................. 16 4 Publikationsmanuskript .................................................................................. 17 5 Zusammenfassung .......................................................................................... 45 6 Literaturverzeichnis………………………………………………………………….50 7 Anlagen ............................................................................................................ 55 7.1 Supplemental Material ............................................................................. 55 7.2 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden zur Publikation................................................................................................ 66 7.3 Selbstständigkeitserklärung ..................................................................... 67 7.4 Lebenslauf................................................................................................ 68 7.5 Publikationen............................................................................................ 70 7.6 Danksagung ............................................................................................. 71

Die Muscle-RING-finger (MuRF) Proteine sind E3-Ubiquitin-Ligasen, die im Muskelgewebe den Ubiquitin-Proteasom-System abhängigen Abbau von Proteinen vermitteln. MuRF1 wird in der Muskelatrophie verstärkt synthetisiert, was zu einem gesteigerten Proteinabbau und damit zum Verlust von Muskelmasse führt. Zudem sind Mäuse, denen MuRF1 fehlt vor Muskelatrophie geschützt. E3-Ubiquitin-Ligasen fungieren oftmals in Multiproteinkomplexen. Dies wurde für MuRF-Proteine bisher nicht gezeigt. Aufgrund dessen sollten neue MuRF-Multiproteinkomplex assoziierte Faktoren mittels Hefe-Zwei-Hybrid-System und SILAC AP-MS identifiziert und deren Einfluss auf die MuRF-Funktion charakterisiert werden. Es wurden sowohl neue als auch publizierte MuRF-Interaktionspartner (Iap) gefunden. Von den neu entdeckten MuRF-Iap wurde der Fokus auf WDR42A gelegt, da das Protein mit beiden Methoden identifiziert wurde und zudem funktionell hoch interessant ist. WDR42A homologe Proteine bilden zirkuläre β-Propeller Strukturen die Multiproteinkomplexe koordinieren. Die Interaktion zwischen MuRF-Proteinen und WDR42A wurde mittels Ko-IP Experimenten und Kolokalisationsstudien bestätigt. Cycloheximid-Abbau-Experimente deuten darauf hin, dass WDR42A kein MuRF1 Substrat-Protein ist. Da die MuRF-Proteine spezifisch im Muskel hergestellt werden, sollte überprüft werden ob WDR42A ebenfalls im Muskelgewebe synthetisiert wird. Es wurde gezeigt, dass WDR42A ubiquitär sowie im Muskelgewebe und in immortalisierten Muskelzellen hergestellt wird. Analog zu MuRF1 wird WDR42A in der Denervations-induzierten Skelettmuskelatrophie und der Muskelentwicklung verstärkt synthetisiert. Die Herunterregulation von WDR42A mittels siRNA in C2C12 Myotuben schützte diese Zellen vor dem Auftreten von Atrophie. Diese Ergebnisse zeigen, dass WDR42A wie MuRF1 an der Entstehung von Muskelatrophie beteiligt ist. Aufgrund der WDR42A Domänenstruktur wird vermutet, dass WDR42A als Scaffolding-Protein MuRF1-Multiproteinkomplexe reguliert. / The muscle-RING-finger (MuRF) proteins are E3 ubiquitin ligases which coordinate the ubiquitin-proteasome system dependent protein degradation in muscle tissue. MuRF1 is up-regulated under muscle atrophy conditions. This leads to enhanced proteolysis and thereby to loss of muscle mass and strength. Furthermore are MuRF1 knockout mice resistant to muscle atrophy. E3 ubiquitin ligases often operate in multi-protein complexes. This has not been shown for MuRF proteins. Therefore we used yeast-two-hybrid and SILAC-AP-MS to identify and subsequently characterize new MuRF multi-protein complex associated proteins. We found new and also published MuRF interaction partners (Iap) with both methods. Amongst the new Iap, we focused on WDR42A, because it was found with both techniques and his interesting functional potential. WDR42A exhibits seven consecutive arranged WD40-repeat domains. This domain arrangement leads in homologues proteins to the formation of seven-bladed β-propeller structures, which act as protein interaction platforms that coordinate multi-protein complexes. The protein interaction between the MuRFs and WDR42A was confirmed with Co-IP and co-localization experiments. Cycloheximide decay experiments indicated that WDR42A is not a MuRF1 substrate protein. The MuRF proteins are muscle specific, therefore we tested if WDR42A is also synthetized in muscle tissue. We could show that WDR42A is ubiquitously, but also in muscle tissue as well as in immortalized muscle cells produced. WDR42A is similar to MuRF1 up-regulated under denervation-induced skeletal muscle atrophy as well as in muscle development. Furthermore are C2C12 myotubes resistant to muscle atrophy after siRNA down-regulation of WDR42A. These results demonstrate that WDR42A is like MuRF1 important for the development of muscle atrophy. Due to the domain structure of WDR42A, we hypothesize that WDR42A regulates MuRF1 multi protein complexes as scaffolding protein.

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Objective: Activated astroglia is involved in the pathophysiology of neurodegenerative diseases and has also been described in animal models of spinal muscular atrophy (SMA). Given the urgent need of biomarkers for treatment monitoring of new RNA-modifying and gene replacement therapies in SMA, we examined glial fibrillary acidic protein concentrations in cerebrospinal fluid (cGFAP) as a marker of astrogliosis in SMA. - Methods: 58 adult patients and 21 children with genetically confirmed 5q-associated SMA from four German motor neuron disease specialist care centers and 30 age- and sex-matched controls were prospectively included in this study. cGFAP was measured and correlated to motor performance and disease severity. Additionally, we compared fL). - Results: cGFAP concentrations did not differ from controls but showed higher levels in more severely affected patients after adjustment for patients’ age. Normalized cNfL values were associated with disease severity. Within 14 months of nusinersen treatment, cGFAP concentrations did not change, while cNfL decreased significantly. - Interpretation: cGFAP is not an outstanding biomarker in SMA, but might support the hypothesis that glial activation is involved in SMA pathology. Unlike previously suggested, cNfL may be a promising biomarker also in adult patients with SMA, which should be subject to further investigations.

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