Resumo: Por meio de exames clínicos e análises laboratoriais, o presente trabalho avaliou a prevalência de cárie dentária e a relação entre os fatores presença de cárie dental, biofilme bacteriano visível e contagem de Streptococcus grupo mutans em crianças com idade entre 12 e 48 meses, sendo 26 portadoras (grupo teste) e 142 não portadoras da síndrome de Down (grupo controle). A prevalência de cárie dentária no grupo teste foi de 15,38% e no grupo controle de 31,69%. No grupo controle houve aumento estatisticamente significativo do índice ceo-d e dos níveis de Streptococcus grupo mutans a partir dos 36 meses de idade. Nos dois grupos, com o aumento da idade, aumentou o número de crianças colonizadas por Streptococcus grupo mutans. Foi observada dependência estatisticamente significativa entre a presença de lesão cárie dentária e altos níveis de Streptococcus do grupo mutans tanto no grupo teste quanto no grupo controle. Houve também correlação positiva estatisticamente significativa entre a presença de lesão de cárie dentária e a presença de biofilme bacteriano visível, e entre a presença de biofilme bacteriano visível e altos níveis de Streptococcus do grupo mutans apenas no grupo controle. / Abstract: This study evaluated the dental caries prevalence and the relationship among dental caries, visible bacterial biofilm and mutans streptococci counts in children with Down syndrome (test-group=26) and in health children (control-group=142), aged from 12 to 48 months. The caries prevalence was 15.38% in the test group and 31.69% in the control-group. The dmf-t index and the mutans streptococci levels had a significant statistic increase after 36 months of age in the control group. The number of children who harbored mutans streptococci had a significant increased with age in all children (test and control groups). In both groups dental caries and high levels of mutans streptococci presented a strong positive correlation. High positive correlation was also observed between visible bacterial biofilm and dental caries lesions and between visible bacterial biofilm and high levels of mutans streptococci in the control-group, but not in the test-group. Keywords: Down syndrome, dental caries, mutans streptococci, biofilm. / Orientador: Ângela Cristina Cilense Zuanon / Coorientador: Denise Madalena Palomari Spolidorio / Banca: Fábio César Braga de Abreu e Lima / Banca: Cássia Cilene Dezan Garbelini / Mestre

O objetivo deste trabalho foi avaliar a desmineralização do esmalte após períodos de 4, 7 e 10 dias de acúmulo de placa bacteriana in situ, além da influência de fatores salivares e microbiológicos no processo. Após a avaliação do fluxo salivar estimulado, capacidade tampão da saliva e níveis salivares de estreptococos do grupo mutans, 13 voluntários utilizaram dispositivos intrabucais palatinos contendo 4 blocos de esmalte bovino (4 X 4 X 2 mm) polidos, cobertos por uma tela plástica, durante 3 períodos cruzados de 4, 7 e 10 dias. Os voluntários utilizaram um dentifrício não fluoretado e gotejaram 10 vezes ao dia uma solução de sacarose a 20% sobre os blocos de esmalte. A microdureza superficial dos blocos foi determinada antes e após a desmineralização in situ, utilizando um penetrador Knoop e carga de 50 g por 5 s. Ao final de cada fase experimental, a placa bacteriana formada sobre os blocos foi coletada e a porcentagem de estreptococos mutans em relação ao número de bactérias totais foi determinada. Houve diferença estatisticamente significante, segundo o teste “t" pareado, entre a microdureza inicial e final nos três períodos estudados (p<0,05). A porcentagem de perda de dureza superficial (%PDS) foi em média de 13,8%, 19,3% e 48,3%, nos períodos de 4, 7 e 10 dias. Não houve diferença estatisticamente significante entre a %PDS com 4 e 7 dias, de acordo com a análise de variância e teste de Tukey (p<0,05). A correlação entre a %PDS e os fatores salivares e microbiológicos avaliados foi determinada por meio dos coeficientes de correlação de Pearson e Spearman, com p<0,05. Não foi encontrada correlação estatisticamente significante entre a %PDS e os fatores salivares avaliados inicialmente. Em aproximadamente metade das análises de placa bacteriana não foram detectados estreptococos mutans, embora tenha ocorrido desmineralização do esmalte. A porcentagem de estreptococos mutans na placa bacteriana não apresentou correlação com os níveis salivares dessas bactérias. Não foi encontrada correlação entre a %PDS e a porcentagem de estreptococos mutans na placa bacteriana formada sobre os blocos de esmalte. A %PDS nos blocos cobertos por placa bacteriana em que foram detectados estreptococos mutans foi estatisticamente maior do que nos blocos em que eles não foram detectados, apenas no período de 4 dias, de acordo com o teste de Mann-Whitney (p<0,05). Os resultados mostraram desmineralização do esmalte in situ após curtos períodos de acúmulo de placa bacteriana, não tendo sido encontrada relação com os fatores salivares avaliados ou com as contagens de estreptococos mutans na saliva e na placa. / The aim of this study was to evaluate the in situ enamel demineralization during 4, 7 and 10 days and some of the factors influencing the process. Before the beginning of the in situ phase, a stimulated whole saliva sample was collected from 13 volunteers for 5 min and the salivary secretion rate, buffering capacity and numbers of mutans streptococci were estimated. A palatal appliance containing 4 polished bovine enamel blocks (4 X 4 X 2 mm) covered by a plastic mesh was worn on 3 separate periods of 4, 7 and 10 days, throughout which time a non-fluoridated dentifrice was used. A 20% sucrose solution was dripped extra-orally onto the enamel blocks 10 times a day. All enamel blocks were evaluated by the analysis of enamel surface microhardness before and after in situ demineralization, using a 50 g, Knoop load for 5 s. At the end of each period, plaque covering the enamel blocks was collected and analyzed for the % of mutans streptococci of the total viable counts. Paired-t test showed that initial and final microhardness were statistically different at the three periods evaluated (p<0.05). Change in surface microhardness (%CSMH) was 13.8%, 19.3% and 48.3% during the 4, 7 and 10-day periods, respectively. There was no statistically significant difference on the %CSMH between 4 and 7 days, according to analysis of variance and Tukey’s test (p<0.05). Correlation between %CSMH and the salivary and bacteriological factors evaluated was determined using Pearson’s and Spearman’s coefficient of correlation (p<0.05). The %CSMH was not significantly correlated to the salivary factors determined initially. In about half of the plaque samples analyzed mutans streptococci were not detected, although the enamel showed some demineralization. The % of mutans streptococci in plaque samples was not correlated to its numbers in saliva. There was no statistically significant correlation between the %CSMH and the % of mutans streptococci in plaque over the enamel blocks. The presence of these bacteria in plaque significantly increased enamel demineralization when compared to the blocks where they were not detected only at 4 days, according to Mann-Whitney test (p<0.05). The results showed in situ enamel demineralization after short periods of plaque accumulation, which was not related to the salivary factors evaluated nor to the numbers of mutans streptococci in saliva or plaque.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a desmineralização do esmalte após períodos de 4, 7 e 10 dias de acúmulo de placa bacteriana in situ, além da influência de fatores salivares e microbiológicos no processo. Após a avaliação do fluxo salivar estimulado, capacidade tampão da saliva e níveis salivares de estreptococos do grupo mutans, 13 voluntários utilizaram dispositivos intrabucais palatinos contendo 4 blocos de esmalte bovino (4 X 4 X 2 mm) polidos, cobertos por uma tela plástica, durante 3 períodos cruzados de 4, 7 e 10 dias. Os voluntários utilizaram um dentifrício não fluoretado e gotejaram 10 vezes ao dia uma solução de sacarose a 20% sobre os blocos de esmalte. A microdureza superficial dos blocos foi determinada antes e após a desmineralização in situ, utilizando um penetrador Knoop e carga de 50 g por 5 s. Ao final de cada fase experimental, a placa bacteriana formada sobre os blocos foi coletada e a porcentagem de estreptococos mutans em relação ao número de bactérias totais foi determinada. Houve diferença estatisticamente significante, segundo o teste “t” pareado, entre a microdureza inicial e final nos três períodos estudados (p<0,05). A porcentagem de perda de dureza superficial (%PDS) foi em média de 13,8%, 19,3% e 48,3%, nos períodos de 4, 7 e 10 dias. Não houve diferença estatisticamente significante entre a %PDS com 4 e 7 dias, de acordo com a análise de variância e teste de Tukey (p<0,05). A correlação entre a %PDS e os fatores salivares e microbiológicos avaliados foi determinada por meio dos coeficientes de correlação de Pearson e Spearman, com p<0,05. Não foi encontrada correlação estatisticamente significante entre a %PDS e os fatores salivares avaliados inicialmente. Em aproximadamente metade das análises de placa bacteriana não foram detectados estreptococos mutans, embora tenha ocorrido desmineralização do esmalte. A porcentagem de estreptococos mutans na placa bacteriana não apresentou correlação com os níveis salivares dessas bactérias. Não foi encontrada correlação entre a %PDS e a porcentagem de estreptococos mutans na placa bacteriana formada sobre os blocos de esmalte. A %PDS nos blocos cobertos por placa bacteriana em que foram detectados estreptococos mutans foi estatisticamente maior do que nos blocos em que eles não foram detectados, apenas no período de 4 dias, de acordo com o teste de Mann-Whitney (p<0,05). Os resultados mostraram desmineralização do esmalte in situ após curtos períodos de acúmulo de placa bacteriana, não tendo sido encontrada relação com os fatores salivares avaliados ou com as contagens de estreptococos mutans na saliva e na placa. / The aim of this study was to evaluate the in situ enamel demineralization during 4, 7 and 10 days and some of the factors influencing the process. Before the beginning of the in situ phase, a stimulated whole saliva sample was collected from 13 volunteers for 5 min and the salivary secretion rate, buffering capacity and numbers of mutans streptococci were estimated. A palatal appliance containing 4 polished bovine enamel blocks (4 X 4 X 2 mm) covered by a plastic mesh was worn on 3 separate periods of 4, 7 and 10 days, throughout which time a non-fluoridated dentifrice was used. A 20% sucrose solution was dripped extra-orally onto the enamel blocks 10 times a day. All enamel blocks were evaluated by the analysis of enamel surface microhardness before and after in situ demineralization, using a 50 g, Knoop load for 5 s. At the end of each period, plaque covering the enamel blocks was collected and analyzed for the % of mutans streptococci of the total viable counts. Paired-t test showed that initial and final microhardness were statistically different at the three periods evaluated (p<0.05). Change in surface microhardness (%CSMH) was 13.8%, 19.3% and 48.3% during the 4, 7 and 10-day periods, respectively. There was no statistically significant difference on the %CSMH between 4 and 7 days, according to analysis of variance and Tukey’s test (p<0.05). Correlation between %CSMH and the salivary and bacteriological factors evaluated was determined using Pearson’s and Spearman’s coefficient of correlation (p<0.05). The %CSMH was not significantly correlated to the salivary factors determined initially. In about half of the plaque samples analyzed mutans streptococci were not detected, although the enamel showed some demineralization. The % of mutans streptococci in plaque samples was not correlated to its numbers in saliva. There was no statistically significant correlation between the %CSMH and the % of mutans streptococci in plaque over the enamel blocks. The presence of these bacteria in plaque significantly increased enamel demineralization when compared to the blocks where they were not detected only at 4 days, according to Mann-Whitney test (p<0.05). The results showed in situ enamel demineralization after short periods of plaque accumulation, which was not related to the salivary factors evaluated nor to the numbers of mutans streptococci in saliva or plaque.

Early childhood caries (ECC) is closely related to high numbers of mutans streptococci, lactobacilli and Candida albicans . Oral colonization of these microorganisms was monitored in a prospective clinical study in order to investigate the effect of comprehensive treatment under general anesthesia and the sustainability of microbial changes. Saliva samples were collected from 50 healthy infants with ECC before and in regular intervals up to 12 months after treatment. Microorganisms were detected by cultivation on selective agars (CRT ® bacteria and Sabouraud/CandiSelect TM ) and scored. Additionally, plaque on upper front teeth and the dmft were recorded. Parents were repeatedly interviewed regarding the children’s diet and oral hygiene, accompanied by corresponding advice. Plaque frequency and the numbers of mutans streptococci, lactobacilli and yeasts were significantly reduced as a result of treatment (p < 0.0001, Wilcoxon test). Nevertheless, this effect was not permanent. An ordinal regression model on the follow-up period revealed that the odds for bacteria and yeasts to reach a higher score increased linearly over time (p < 0.01) with an odds ratio of 2.244 per year. One third (34%) of the children developed new dentinal lesions within 1 year postoperatively. High scores of lactobacilli before treatment predicted caries relapse (p < 0.05). Nutritional and oral hygiene habits changed only slightly despite advising. Elimination and restoration of ECC lesions under general anesthesia proved to be an effective procedure in reducing cariogenic bacteria and yeasts. A satisfactory and sustainable success, however, could be achieved neither regarding microbiologic parameters nor with respect to the relapse rate. More suitable strategies are needed.

Tendo em vista o importante papel desempenhado pelos Streptococcus mutans e pelos Streptococcus sobrinus na etiologia da cárie dental, assim como a relevância do meio de cultura empregado para a detecção desses microrganismos, os objetivos do presente estudo foram: Capítulo 1- Avaliar a eficácia do meio de cultura SB-20 modificado (SB-20M) na diferenciação morfológica de colônias de S. mutans e de S. sobrinus, comparativamente à análise bioquímica das colônias isoladas, na saliva de crianças; Capítulo 2- Comparar os meios de cultura SB-20, SB-20M e MSB na quantificação (contagem) de unidades formadoras de colônias (ufc) e na diferenciação morfológica e bioquímica de S. mutans e S. sobrinus, na saliva de crianças; e Capítulo 3- Empregar o meio de cultura SB-20M sem ágar, denominado Caldo Sacarose-Bacitracina modificado (CaSaB- 20M), para avaliar a viabilidade de cepas padrão de S. mutans (ATCC25175) in vitro e a viabilidade de estreptococos do grupo mutans in vivo, nas cerdas de escovas dentais, após diferentes períodos de secagem. No Capítulo 1, a eficácia do meio SB-20M foi avaliada tomando-se amostras de saliva não-estimulada de 145 crianças de 6 a 12 anos de idade, por meio da técnica da espátula de madeira. Após semeadura e incubação em microaerofilia, foi efetuada a contagem das ufc em microscópio estereoscópico e realizada a identificação morfológica e bioquímica (biotipagem) das colônias de S. mutans e de S. sobrinus. Os resultados obtidos após as identificações morfológicas e bioquímicas foram comparados empregando o teste x2. No Capítulo 2, a comparação dos meios de cultura SB-20, SB-20M e MSB foi efetuada em amostras de saliva não-estimulada, colhidas de 20 crianças na faixa etária de 4 a 12 anos, em tubos de ensaio. Amostras de saliva pura e diluídas até 10-4 foram semeadas em placas contendo os referidos meios, por meio de um micrométodo, e incubadas em microaerofilia. A seguir, foi efetuada a contagem das ufc e a identificação morfológica e bioquímica das colônias de S. mutans e de S. sobrinus. Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística, utilizando o teste de Wilcoxon e o teste exato de Fisher. No estudo in vitro do Capítulo 3, um total de 45 escovas dentais infantis, divididas em 9 grupos (n=5 por grupo), foram ontaminadas com uma suspensão contendo Streptococcus mutans (cepa ATCC 25175), na concentração de 1.720.000 unidades formadoras de colônias por mL (escala 0,5 de McFarland), durante 4 minutos. Logo após a lavagem, as escovas do Grupo 1 (controle) foram submetidas ao processamento microbiológico. As escovas dos Grupos 2 a 9 foram mantidas à temperatura ambiente por 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60 e 72 horas, respectivamente, previamente ao processamento microbiológico, em meio de cultura CaSaB-20M. A seguir, foi efetuada a contagem de ufc de S. mutans nas cerdas. Os resultados obtidos foram analisados por meio do teste de Kruskal-Wallis. No estudo in vivo do Capítulo 3 participaram 20 crianças de 4 a 8 anos com alto risco à cárie dental. Cada criança recebeu 13 escovações, com intervalo de 3 dias entre cada escovação, empregando sempre uma escova dental nova, sem dentifrício. As 260 escovas obtidas foram divididas em 13 grupos (n=20 por grupo). Logo após a lavagem, as escovas do Grupo 1 (controle) foram submetidas ao processamento microbiológico. As escovas dos Grupos 2 a 13 foram mantidas à temperatura ambiente por 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 e 48 horas, respectivamente, previamente ao processamento microbiológico, ou seja, semeadura e incubação em meio CasB-20M. Após a incubação foi efetuada a contagem de ufc de S. mutans e a quantificação dos polissacarídeos extracelulares presentes nas cerdas. Os dados obtidos foram avaliados por meio do teste de Wilcoxon. O nível de significância em todas as análises estatísticas foi de 5%. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que o método de identificação morfológica, empregando o meio de cultura SB-20M, foi confiável para a identificação de S. mutans e S. sobrinus. Os meios SB-20 e SB-20M foram semelhantes na quantificação de estreptococos do grupo mutans e na identificação morfológica e bioquímica de S. mutans e de S. sobrinus, evidenciando que a ubstituição da sacarose pelo açúcar cristal não alterou a eficácia do meio. Quando comparado ao meio MSB, o SB-20M apresentou resultados estatisticamente superiores, com relação à uantificação de ufc e com relação à identificação morfológica e bioquímica de S. mutans e de S. sobrinus. O Caldo Sacarose-Bacitracina modificado (CaSaB-20M) permitiu avaliar a viabilidade de estreptococos do grupo mutans nas cerdas de escovas dentais, após diferentes períodos de secagem. De acordo com o estudo in vitro com cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175), observou-se viabilidade de microrganismos nas escovas dentais por até 8 horas. Por outro lado, no estudo in vivo, os estreptococos do grupo mutans permaneceram viáveis por períodos superiores (44 horas) / The important role veloped by Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in dental caries ethyology as well as the relevance of the culture medium used for the detection of these microorganisms, the aims of the present study were divided into three parts as follows: Chapter 1 To evaluate the modified SB-20 culture medium efficacy (SB-20M) in the morphologic differentiation of the S. utans and S. sobrinus colonies comparatively to the biochemical analysis of the isolated colonies in childrens saliva samples; Chapter 2 To compare the culture media SB- 20, SB-20M, and MSB in the quantification (counting) of the colony forming units (cfu), and in the morphological and iochemical differentiation of S. mutans and S. sobrinus in childrens saliva; and Chapter 3 To employ the SB-20M culture medium without agar, called Sucrose Bacitracin Broth Modified (CaSaB-20M), in order to evaluate the viability of the in vitro S. mutans pattern strains (ATCC 25175), and the viability of the in vivo mutans streptococci in toothbrush bristles after different dry periods. In Chapter 1, the efficacy of the SB-20M was evaluated by wood spatula technique using non-stimulated saliva samples of 145 children of 6 to 12 years old. After seeding and incubation in microaerophilic conditions, the cfu counting in stereoscopic microscope, and the morphological and biochemical identification (biotyping) of S. mutans and S. sobrinus colonies were made. The results obtained after morphological and biochemical identifications were compared by the X2 test. In Chapter 2, the comparison of the SB-20, SB-20M, and MSB culture medium was made using assay tubes with non-stimulated saliva samples of 20 children with age between 4 and 12 years old. Samples of pure and diluted saliva (until 10-4) were seeded by a micromethod in Petri dishes with the culture media, and incubated under microaerophilic conditions, followed by the cfu counting, and morphological and biochemical identification of S. mutans and S. sobrinus colonies. The results obtained were submitted to the statistical analysis using Wilcoxon test and the exact Fisher test. In the in vitro study of the Chapter 3, a total of 45 childrens toothbrush divided in 9 groups (n=5 per group) were infected with a Streptococcus mutans (strain ATCC25175) suspension, under the concentration of 1.720.000 colony forming unities by mL (McFarland 0.5 scale) during 4 minutes. Briefly, after washing the Group 1 toothbrushes (control) were submitted to the microbiological processing. Group 2 to 9 toothbrushes were maintained in room temperature for 4, 8, 12, 14, 24, 36, 48, 60, and 72 hours respectively, previously to microbiological processing in CaSaB-20M culture medium. After that, the S. mutans cfu counting in the bristles were made. The results obtained were analysed by KruskalWallis test. In the in vivo study of the Chapter 3, 20 high caries risk children of 4 to 8 years old children have been participated. Each child received 13 times brushing, with intervals of 3 days between each brushing using always a new toothbrush with no toothpaste. The 260 obtained toothbrushes were divided into 13 groups (n=20 per group). After whashing the Group 1 toothbrushes (control) were submitted to microbiological processing. The other ones (groups 2 to 13) were maintained in room temperature for 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, and 48 hours respectively, previously the microbiological processing (CaSaB-20M). After incubation the S. mutans cfu counting and the quantification of extracellular polysaccharides present in the bristles were made. The data obtained were evaluated by Wilcoxon test. The level of significance in all statistical analysis was 5%. Based on the results obtained we could conclude that de morphological method for identification using SB-20M culture medium was trustable for the identification of S. mutans and S. sobrinus. The SB-20 and SB-20M showed the same effect in the quantification of the mutans streptococci, and in the morphological and biochemical identification of S. mutans and S. sobrinus evidentiating that the substitution of sucrose for coarse granular cane sugar (SB-20M) did not altered the efficacy of the medium. When compared to MSB medium, the SB-20M showed results statistically superiors with relation to cfu quantification, and morphological and biochemical of S. mutans and S. sobrinus. Sucrose-Bacitracin modified broth (CaSaB-20M) allowed the evaluation of the viability of mutans streptococci in toothbrush bristles after different drying times. According to the in vitro study with Streptococcus mutans (ATCC 25175), we could observe viability of microorganisms in toothbrush bristles for 8 hours remaining. On the other hand, in the in vivo study the mutans streptococci remain viable for extended periods (44 hours).

Im Rahmen der Untersuchung wurde bei 27 Patienten, die klinische Zeichen der Karies, aber keine pulpitischen Symptome zeigten, kariöses Dentin mit Hilfe eines sterilen Exkavators entnommen. Das durchschnittliche Alter der Patienten beträgt 41 Jahre und der Durchschnittswert des DMF-T-Index 12,5. Die Untersuchungsgruppe bestand zu 55,5 % aus männlichen Probanden sowie zu 44 % aus Rauchern. Nach Isolierung von 107 Reinkulturen aus den Patientenproben erfolgte die Identifizierung der oralen Streptokokken mittels eines mikrobiologischen Standardtests (RapidID-32Strep der Firma BioMérieux) und MALDI-TOF-MS-Analyse. Parallel wurden speziesspezifische PCRs der Dentinproben für S. sanguinis, S. constellatus, S. intermedius, S. anginosus, S. mutans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, S. gordonii und S. parasanguinis durchgeführt. Mittels MALDI-TOF-MS-Analyse konnten insgesamt sechs verschiedene Spezies oraler Streptokokken in den Dentinproben nachgewiesen werden. Am häufigsten kamen Vertreter der Mitis-Gruppe vor (in 89 % der Dentinproben), gefolgt von S. gordonii und S. sanguinis (zu 52 % und 26 % vertreten). Die MALDI-TOF-MS-Methode erwies sich als geeignetere der mit Kultivierung verbundenen Nachweismethoden. Ihre Ergebnisse wurden durch selektive PCRs einzelner Subkulturen und DNA-Sequenzierung bestätigt. Mittels der speziesspezifischen PCRs der Dentinspäne wurden zehn verschiedene Spezies oraler Streptokokken identifiziert. Vertreter der Mutans-Gruppe wurden so zu durchschnittlich 44 %, S. salivarius zu 37 % nachgewiesen. Es zeigte sich ein signifikantes Vorkommen von S. anginosus in Proben, die ebenfalls S. mutans enthielten (p= 0,00213). Alle drei Verfahren sind zur Untersuchung klinischer Proben geeignet, wobei die MALDI-TOF-MS-Analyse die genaueste Differenzierung auf Speziesebene ermöglicht. Die Non-Mutans-Streptokokken S. oralis, S. gordonii und S. anginosus scheinen die Mikroflora von kariösem Dentin zu dominieren. Sie übertrafen in der vorliegenden Arbeit in ihrem Vorkommen S. mutans in mehr als der Hälfte der untersuchten Proben. Diese Beobachtung stützt die erweiterte ökologische Plaquehypothese.

Tendo em vista o importante papel desempenhado pelos Streptococcus mutans e pelos Streptococcus sobrinus na etiologia da cárie dental, assim como a relevância do meio de cultura empregado para a detecção desses microrganismos, os objetivos do presente estudo foram: Capítulo 1- Avaliar a eficácia do meio de cultura SB-20 modificado (SB-20M) na diferenciação morfológica de colônias de S. mutans e de S. sobrinus, comparativamente à análise bioquímica das colônias isoladas, na saliva de crianças; Capítulo 2- Comparar os meios de cultura SB-20, SB-20M e MSB na quantificação (contagem) de unidades formadoras de colônias (ufc) e na diferenciação morfológica e bioquímica de S. mutans e S. sobrinus, na saliva de crianças; e Capítulo 3- Empregar o meio de cultura SB-20M sem ágar, denominado Caldo Sacarose-Bacitracina modificado (CaSaB- 20M), para avaliar a viabilidade de cepas padrão de S. mutans (ATCC25175) in vitro e a viabilidade de estreptococos do grupo mutans in vivo, nas cerdas de escovas dentais, após diferentes períodos de secagem. No Capítulo 1, a eficácia do meio SB-20M foi avaliada tomando-se amostras de saliva não-estimulada de 145 crianças de 6 a 12 anos de idade, por meio da técnica da espátula de madeira. Após semeadura e incubação em microaerofilia, foi efetuada a contagem das ufc em microscópio estereoscópico e realizada a identificação morfológica e bioquímica (biotipagem) das colônias de S. mutans e de S. sobrinus. Os resultados obtidos após as identificações morfológicas e bioquímicas foram comparados empregando o teste x2. No Capítulo 2, a comparação dos meios de cultura SB-20, SB-20M e MSB foi efetuada em amostras de saliva não-estimulada, colhidas de 20 crianças na faixa etária de 4 a 12 anos, em tubos de ensaio. Amostras de saliva pura e diluídas até 10-4 foram semeadas em placas contendo os referidos meios, por meio de um micrométodo, e incubadas em microaerofilia. A seguir, foi efetuada a contagem das ufc e a identificação morfológica e bioquímica das colônias de S. mutans e de S. sobrinus. Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística, utilizando o teste de Wilcoxon e o teste exato de Fisher. No estudo in vitro do Capítulo 3, um total de 45 escovas dentais infantis, divididas em 9 grupos (n=5 por grupo), foram ontaminadas com uma suspensão contendo Streptococcus mutans (cepa ATCC 25175), na concentração de 1.720.000 unidades formadoras de colônias por mL (escala 0,5 de McFarland), durante 4 minutos. Logo após a lavagem, as escovas do Grupo 1 (controle) foram submetidas ao processamento microbiológico. As escovas dos Grupos 2 a 9 foram mantidas à temperatura ambiente por 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60 e 72 horas, respectivamente, previamente ao processamento microbiológico, em meio de cultura CaSaB-20M. A seguir, foi efetuada a contagem de ufc de S. mutans nas cerdas. Os resultados obtidos foram analisados por meio do teste de Kruskal-Wallis. No estudo in vivo do Capítulo 3 participaram 20 crianças de 4 a 8 anos com alto risco à cárie dental. Cada criança recebeu 13 escovações, com intervalo de 3 dias entre cada escovação, empregando sempre uma escova dental nova, sem dentifrício. As 260 escovas obtidas foram divididas em 13 grupos (n=20 por grupo). Logo após a lavagem, as escovas do Grupo 1 (controle) foram submetidas ao processamento microbiológico. As escovas dos Grupos 2 a 13 foram mantidas à temperatura ambiente por 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 e 48 horas, respectivamente, previamente ao processamento microbiológico, ou seja, semeadura e incubação em meio CasB-20M. Após a incubação foi efetuada a contagem de ufc de S. mutans e a quantificação dos polissacarídeos extracelulares presentes nas cerdas. Os dados obtidos foram avaliados por meio do teste de Wilcoxon. O nível de significância em todas as análises estatísticas foi de 5%. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que o método de identificação morfológica, empregando o meio de cultura SB-20M, foi confiável para a identificação de S. mutans e S. sobrinus. Os meios SB-20 e SB-20M foram semelhantes na quantificação de estreptococos do grupo mutans e na identificação morfológica e bioquímica de S. mutans e de S. sobrinus, evidenciando que a ubstituição da sacarose pelo açúcar cristal não alterou a eficácia do meio. Quando comparado ao meio MSB, o SB-20M apresentou resultados estatisticamente superiores, com relação à uantificação de ufc e com relação à identificação morfológica e bioquímica de S. mutans e de S. sobrinus. O Caldo Sacarose-Bacitracina modificado (CaSaB-20M) permitiu avaliar a viabilidade de estreptococos do grupo mutans nas cerdas de escovas dentais, após diferentes períodos de secagem. De acordo com o estudo in vitro com cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175), observou-se viabilidade de microrganismos nas escovas dentais por até 8 horas. Por outro lado, no estudo in vivo, os estreptococos do grupo mutans permaneceram viáveis por períodos superiores (44 horas) / The important role veloped by Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in dental caries ethyology as well as the relevance of the culture medium used for the detection of these microorganisms, the aims of the present study were divided into three parts as follows: Chapter 1 To evaluate the modified SB-20 culture medium efficacy (SB-20M) in the morphologic differentiation of the S. utans and S. sobrinus colonies comparatively to the biochemical analysis of the isolated colonies in childrens saliva samples; Chapter 2 To compare the culture media SB- 20, SB-20M, and MSB in the quantification (counting) of the colony forming units (cfu), and in the morphological and iochemical differentiation of S. mutans and S. sobrinus in childrens saliva; and Chapter 3 To employ the SB-20M culture medium without agar, called Sucrose Bacitracin Broth Modified (CaSaB-20M), in order to evaluate the viability of the in vitro S. mutans pattern strains (ATCC 25175), and the viability of the in vivo mutans streptococci in toothbrush bristles after different dry periods. In Chapter 1, the efficacy of the SB-20M was evaluated by wood spatula technique using non-stimulated saliva samples of 145 children of 6 to 12 years old. After seeding and incubation in microaerophilic conditions, the cfu counting in stereoscopic microscope, and the morphological and biochemical identification (biotyping) of S. mutans and S. sobrinus colonies were made. The results obtained after morphological and biochemical identifications were compared by the X2 test. In Chapter 2, the comparison of the SB-20, SB-20M, and MSB culture medium was made using assay tubes with non-stimulated saliva samples of 20 children with age between 4 and 12 years old. Samples of pure and diluted saliva (until 10-4) were seeded by a micromethod in Petri dishes with the culture media, and incubated under microaerophilic conditions, followed by the cfu counting, and morphological and biochemical identification of S. mutans and S. sobrinus colonies. The results obtained were submitted to the statistical analysis using Wilcoxon test and the exact Fisher test. In the in vitro study of the Chapter 3, a total of 45 childrens toothbrush divided in 9 groups (n=5 per group) were infected with a Streptococcus mutans (strain ATCC25175) suspension, under the concentration of 1.720.000 colony forming unities by mL (McFarland 0.5 scale) during 4 minutes. Briefly, after washing the Group 1 toothbrushes (control) were submitted to the microbiological processing. Group 2 to 9 toothbrushes were maintained in room temperature for 4, 8, 12, 14, 24, 36, 48, 60, and 72 hours respectively, previously to microbiological processing in CaSaB-20M culture medium. After that, the S. mutans cfu counting in the bristles were made. The results obtained were analysed by KruskalWallis test. In the in vivo study of the Chapter 3, 20 high caries risk children of 4 to 8 years old children have been participated. Each child received 13 times brushing, with intervals of 3 days between each brushing using always a new toothbrush with no toothpaste. The 260 obtained toothbrushes were divided into 13 groups (n=20 per group). After whashing the Group 1 toothbrushes (control) were submitted to microbiological processing. The other ones (groups 2 to 13) were maintained in room temperature for 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, and 48 hours respectively, previously the microbiological processing (CaSaB-20M). After incubation the S. mutans cfu counting and the quantification of extracellular polysaccharides present in the bristles were made. The data obtained were evaluated by Wilcoxon test. The level of significance in all statistical analysis was 5%. Based on the results obtained we could conclude that de morphological method for identification using SB-20M culture medium was trustable for the identification of S. mutans and S. sobrinus. The SB-20 and SB-20M showed the same effect in the quantification of the mutans streptococci, and in the morphological and biochemical identification of S. mutans and S. sobrinus evidentiating that the substitution of sucrose for coarse granular cane sugar (SB-20M) did not altered the efficacy of the medium. When compared to MSB medium, the SB-20M showed results statistically superiors with relation to cfu quantification, and morphological and biochemical of S. mutans and S. sobrinus. Sucrose-Bacitracin modified broth (CaSaB-20M) allowed the evaluation of the viability of mutans streptococci in toothbrush bristles after different drying times. According to the in vitro study with Streptococcus mutans (ATCC 25175), we could observe viability of microorganisms in toothbrush bristles for 8 hours remaining. On the other hand, in the in vivo study the mutans streptococci remain viable for extended periods (44 hours).

Im Rahmen der Untersuchung wurde bei 27 Patienten, die klinische Zeichen der Karies, aber keine pulpitischen Symptome zeigten, kariöses Dentin mit Hilfe eines sterilen Exkavators entnommen. Das durchschnittliche Alter der Patienten beträgt 41 Jahre und der Durchschnittswert des DMF-T-Index 12,5. Die Untersuchungsgruppe bestand zu 55,5 % aus männlichen Probanden sowie zu 44 % aus Rauchern. Nach Isolierung von 107 Reinkulturen aus den Patientenproben erfolgte die Identifizierung der oralen Streptokokken mittels eines mikrobiologischen Standardtests (RapidID-32Strep der Firma BioMérieux) und MALDI-TOF-MS-Analyse. Parallel wurden speziesspezifische PCRs der Dentinproben für S. sanguinis, S. constellatus, S. intermedius, S. anginosus, S. mutans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, S. gordonii und S. parasanguinis durchgeführt. Mittels MALDI-TOF-MS-Analyse konnten insgesamt sechs verschiedene Spezies oraler Streptokokken in den Dentinproben nachgewiesen werden. Am häufigsten kamen Vertreter der Mitis-Gruppe vor (in 89 % der Dentinproben), gefolgt von S. gordonii und S. sanguinis (zu 52 % und 26 % vertreten). Die MALDI-TOF-MS-Methode erwies sich als geeignetere der mit Kultivierung verbundenen Nachweismethoden. Ihre Ergebnisse wurden durch selektive PCRs einzelner Subkulturen und DNA-Sequenzierung bestätigt. Mittels der speziesspezifischen PCRs der Dentinspäne wurden zehn verschiedene Spezies oraler Streptokokken identifiziert. Vertreter der Mutans-Gruppe wurden so zu durchschnittlich 44 %, S. salivarius zu 37 % nachgewiesen. Es zeigte sich ein signifikantes Vorkommen von S. anginosus in Proben, die ebenfalls S. mutans enthielten (p= 0,00213). Alle drei Verfahren sind zur Untersuchung klinischer Proben geeignet, wobei die MALDI-TOF-MS-Analyse die genaueste Differenzierung auf Speziesebene ermöglicht. Die Non-Mutans-Streptokokken S. oralis, S. gordonii und S. anginosus scheinen die Mikroflora von kariösem Dentin zu dominieren. Sie übertrafen in der vorliegenden Arbeit in ihrem Vorkommen S. mutans in mehr als der Hälfte der untersuchten Proben. Diese Beobachtung stützt die erweiterte ökologische Plaquehypothese.