L’anémie est un symptôme fréquent chez les patients atteints de cancer. La libération de la cytokine pro-inflammatoire TNFα, un inhibiteur connu de l’érythropoïèse, en est l’une des causes. L’érythropoïèse est un processus nécessitant l’arrêt de la prolifération et l’autophagie. Les résultats précédents ont montré que le TNFα inhibe l’expression des marqueurs érythroïdes et module l’expression de facteurs de transcription (FT) hématopoïétiques. Notre objectif est d’étudier l’implication de la voie TNFα/sphingomyélinase (SMase)/céramide dans l’inhibition de l’érythropoïèse en utilisant des cellules souches hématopoïétiques CD34+ induites à se différencier par l’érythropoïétine recombinante (Epo). Par l’utilisation de céramides exogènes, de SMase bactérienne et d’inhibiteurs de SMases, nous montrons l’implication de la voie SMase/céramide dans l’inhibition de l’expression des marqueurs érythroïdes mais également dans l’induction de la différenciation myéloïde avec une augmentation de l’expression du CD11b. Cet effet sur la différenciation est corrélé à la modulation du réseau FT/miR impliquant GATA-1, GATA-2 et PU.1 et les miR-144, 451, 155, 146a et 223. De plus, l’analyse par microscopie électronique à transmission, l’absence de formation de punctae GFP-LC3 et l’accumulation de SQSTM1/p62 montrent que le TNFα et les céramides inhibent l’autophagie induite par l’Epo. L’analyse des protéines impliquées dans la régulation de l’autophagie montre que le TNFα et les céramides activent mTOR. Son implication est confirmée par l’utilisation de rapamycine et l’inhibition de ULK1 et Atg13. De plus, le TNFα et les céramides inhibent l’expression de bécline 1 et de la formation du complexe Atg5-Atg12. Ces résultats démontrent que la voie TNFα/SMase/céramide joue un rôle dans l’homéostasie hématopoïétique par l’inhibition de l’érythropoïèse au profit de la myélopoïèse, en impactant les réseaux de régulation FT/miR et le processus d’autophagie / Anemia is a common symptom in cancer patients. It can be caused by the release of pro-inflammatory cytokines such as TNFα, a known inhibitor of erythropoiesis. Erythropoiesis involves proliferation arrest and autophagy. Our previous studies showed that TNFα inhibits the expression of erythroid markers as well as hematopoietic transcription factors (TF) expression. The aim is to study the involvement of TNFα/sphingomyelinase (SMase)/ceramide pathway in erythropoiesis inhibition using recombinant erythropoietin (Epo)-induced CD34+ hematopoietic stem cells. Using exogenous ceramides, a bacterial SMase and sphingomyelinase inhibitors, we show the involvement of SMase/ceramide pathway in the inhibition of erythroid markers as well as the induction of myeloid differentiation as shown by the increase in CD11b expression. This effect is correlated to the modulation of the TF/miR network involving GATA-1, GATA-2 and PU.1 as well as miR-144, 451, 155, 146a and 223. We show that TNFα and ceramides inhibit Epo-induced autophagy through transmission electron microscopy analysis, the absence of GFP-LC3 punctae formation and SQSTM1/p62 accumulation. Analysis of proteins involved in autophagy regulation showed that TNFα and ceramides activate mTOR, which is confirmed using rapamycin as well as the inhibition of ULK1 and Atg13. Moreover, TNFα and ceramides inhibit Beclin 1 expression and Atg5-Atg12 complex formation. These results demonstrate the role of TNFα/SMase/ceramide pathway in hematopoietic homeostasis through an erythropoiesis-myelopoiesis switch resulting from perturbation of TF/miR network and autophagy

La LMMC est une pathologie clonale de la cellule souche hématopoïétique dont les caractéristiques la classent parmi les syndromes myélodysplasiques/myéloprolifératifs (SMD/SMP). L’invalidation conditionnelle de Tif1γ au niveau hématopoïétique chez la Souris (Tif1γΔ/Δ) est responsable du développement d’un SMD/SMP mimant la LMMC humaine lorsque la souris atteint l’âge de 6 mois, faisant de Tif1γ un gène suppresseur de tumeur. Par ailleurs, malgré une monocytose, la population macrophagique péritonéale de ces souris est diminuée.Les objectifs de mon travail étaient de caractériser chez les souris malades la population myéloïde et d’étudier la différenciation macrophagique. Nous avons identifié chez les souris homozygotes Tif1γΔ/Δ une population morphologiquement immature, associant des caractéristiques granulocytaires et monocytaires. Les propriétés phénotypiques et moléculaires de cette population évoquent celles des cellules myéloïdes suppressives granulocytaires de type PMN-MDSC, faisant de Tif1γ un régulateur négatif de son développement. En sus, la différenciation in vitro des cellules myéloïdes médullaires en macrophages sous l’effet du CSF-1 est altérée. La baisse d’expression du CSF-1R n’explique pas à elle seule ces altérations puisque celle des cellules dendritiques est également perturbée sans modification de l’expression du GM-CSFR. Nous émettons l’hypothèse que l’augmentation d’expression de S100A8 et S100A9 chez les souris malades induit le développement des progéniteurs myéloïdes en cellules proches des PMN-MDSC au détriment des différenciations dendritique et macrophagique. En conclusion, Tif1γ est un régulateur majeur de la myélopoïèse. / Chronic myelomonocytic leukemia (CMML) is a hematologic stem cell disease whose characteristics correspond to myelodysplastic/myeloproliferative syndroms (MDS/MPS). Hematopoietic conditional deletion of Tif1γ in mice leads to the development of a MDS/MPS, mimiking human CMML, when age is comprised between 6 to 10 months, defining Tif1γ as a tumour suppressor gene. Moreover, peritoneal macrophage population in these mice is decreased despite a monocytosis.The aims of my work were first to characterize in sick mice the myeloid population, and second to study macrophage differentiation. The myeloid population in Tif1γΔ/Δ mice is morphologically immature, with granulocytic and monocytic features. We demonstrated that phenotypic and molecular characteristics of this population are close to those observed in PMN-MDSC (polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells), suggesting that Tif1γ is a negative regulator gene of this myeloid subset. Furthermore, we showed that in vitro macrophage differentiation of myeloid progenitors upon CSF-1 treatment is altered. Decreased expression of CSF1-R (CSF-1 receptor) does not totally explain this alteration since dendritic cell differentiation is also abnormal, without alteration in GM-CSFR expression. Therefore, we hypothesize that S100A8 and S100A9 hyperexpression in Tif1γΔ/Δ mice is able to promote PMN-MDSC-like differentiation at the expense of macrophage and dendritic differentiations. In conclusion, Tif1γ is a major myelopoiesis regulator gene.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les facteurs régulant l’hématopoïèse en contexte de vieillissement s’avèrent incomplètement compris. Nous avons étudié les déterminants de la variabilité des traits de la formule sanguine complète dans une cohorte de 2996 femmes apparentées et non-apparentées d’ascendance française du Québec âgées de 55 à 101 ans. Les déterminants héréditaires ont été évalués par étude d’association pan-génomique. Des facteurs acquis, incluant comorbidités et hématopoïèse clonale, ont aussi été évalués. Des analyses multivariées ont été réalisées avec des modèles linéaires mixtes généralisés. Nous avons identifié des variants dans la région de GSDMA et PSMD3-CSF3 significativement associés au décompte de neutrophiles et un polymorphisme intronique à ARHGEF3 associé au décompte plaquettaire. L’effet de certains variants diminuait avec l’âge. Avec l’âge, les décomptes de neutrophiles et monocytes augmentaient tandis que le décompte des lymphocytes décroissait. Les valeurs de neutrophiles (4,1x109/L vs 3,83x109/L, valeur-p <0,001), monocytes (0,50x109/L vs 0,45x109/L, valeur-p <0,001) et plaquettes (259x109/L vs 243x109/L, valeur-p <0,001) étaient augmentées lors de comorbidités cardiométaboliques (maladie coronarienne, hypertension, diabète, dyslipidémie). L’hématopoïèse clonale ne modifiait pas les décomptes. En conclusion, nous identifions des déterminants génétiques héréditaires contribuant à la variabilité des décomptes cellulaires sanguins dans une cohorte vieillissante. De plus, le vieillissement est associé à des niveaux accrus de neutrophiles et monocytes et une diminution des lymphocytes indiquant un biais myéloïde, lequel est majoré lors de comorbidités métaboliques. L’hématopoïèse clonale ne contribue pas à ce biais myéloïde. Ces résultats supportent le fait que des facteurs extrinsèques, possiblement via un effet inflammatoire, promeuvent le biais myéloïde relié à l’âge. / Our understanding of the factors regulating peripheral blood cell traits in the setting of aging remains incomplete. We investigated the determinants underlying blood cell trait variability in a cohort of 2996 related and unrelated women of French ancestry from Québec aged 55 to 101 years. We performed a genome-wide association study to assess for genetic variants. We also assessed the impact of acquired factors such as chronic comorbidities and clonal hematopoiesis. Multivariate analyses were subsequently performed using generalized linear mixed models. We identify variants in the region of GSDMA and PSMD3-CSF3 that meet genome-wide requirements for neutrophil counts and a variant intronic to ARHGEF3 for platelet counts. With aging, the effect of certain variants decreased. Aging was associated with increasing neutrophil and monocyte counts and decreasing lymphocyte counts. We also document that individuals with cardiometabolic comorbidities (diabetes, coronary heart disease, hypertension and dyslipidemia) exhibit significantly higher neutrophil (4.1x109/L vs 3.83x109/L, p-value <0.001), monocyte (0.50x109/L vs 0.45x109/L p-value <0.001), and platelet (259x109/L vs 243x109/L, p-value <0.001) counts. Clonal hematopoiesis did not contribute significantly to these traits. In conclusion, germline variants related to GSDMA and PSMD3-CSF3 contribute to neutrophil counts and a SNP intronic to ARHGEF3 contributes to platelet counts. Aging is associated with a myeloid shift with increased levels of neutrophils and monocytes, and reduced lymphocyte counts. This myeloid-biased skewing is further increased with cardiometabolic comorbidities. Clonal hematopoiesis does not contribute to this phenomenon. These findings support that cellextrinsic factors may contribute to the myeloid shift possibly through low-grade inflammation.