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Rôle des cellules dendritiques plasmocytoïdes dans la leucémie myélomonocytaire chronique / A Role for Plasmacytoid Dendritic Cells in Chronic Myelomonocytic LeukemiaLucas, Nolwenn 02 November 2017 (has links)
Une infiltration médullaire par des cellules plasmocytoïdes CD123+ est présente chez certains patients atteints de leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC), mais les mécanismes aboutissant à la génération de ces cellules, et leur impact sur l'évolution de la maladie n'ont jamais été explorés. En cytométrie en flux, nous avons détecté un excès de cellules mononucléées négatives pour les marqueurs de lignée lymphocytaires, monocytaires et granulocytaires, et exprimant CD123, HLA-DR, BDCA-2, BDCA-4 et CD4 dans la moelle de 39/161 patients(24%) . L'analyse de ces cellules en microscopie conventionnelle et électronique, en cytométrie en flux et leur analyse transcriptomique identifient ces cellules comme d'authentiques cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDCs). Ces pDCs répondent à la stimulation par des agonistes de Toll-like receptor 9 (TLR9) et de TLR7 en produisant respectivement de faibles quantités d'interféron alpha et de grandes quantités d'interleukine 8. Le séquençage d'exome complet de monocytes et de pDCs triés détecte une ou plusieurs mutations qui activent constitutivement la voie Ras chez tous les patients riches en pDCs, avec un certain niveau d'hétérogénéité sous-clonale. Les cellules CD34+ de patients LMMC riches en pDCs génèrent de grandes quantités de pDCs en culture ex vivo, y compris en l'absence de FMS-like tyrosine kinase 3-ligand (Flt3-L). Dans des expériences de coculture, les pDCs extraites de moelles de LMMC riches en pDC diminuent la prolifération des cellules CD34+ de manière dose-dépendante. L'augmentation des pDCs est associée à une expansion des lymphocytes T régulateurs (Tregs). L'analyse rétrospective d'une cohorte de 212 patients atteints de LMMC a montré un effet mitigé de l'infiltration médullaire par des cellules CD123+ TCL1+ sur la survie, avec une tendance à une meilleure survie globale chez les patients riches en pDCs, mais également un risque accru de transformation en leucémie aigüe. / Bone marrow infiltration with plasmacytoid CD123high cells was identified in a fraction of patients with a chronic myelomonocytic leukemia (CMML), but the mechanisms promoting the generation of these cells and their impact on disease evolution remain poorly known. Using a multiparametric flow cytometry assay, we detect an excess of lineage-negative mononucleated cells expressing CD45, CD123, HLA-DR, BDCA-2, BDCA-4 and CD4 in the bone marrow of 39/161 (24%) CMML patients. Conventional and electron microscopy, flow cytometry and gene expression analyses identify these cells as authentic plasmacytoid dendritic cells (pDCs). These pDCs respond to Toll-like receptor-9 (TLR9) and TLR7 agonists by producing low levels of interferon alpha and high levels of interleukin-8 (IL-8), respectively. Whole exome sequencing of sorted monocytes and pDCs detects one or several mutations that constitutively activate the Ras pathway in every pDC-rich patient, with some subclonal heterogeneity. CD34+ cells from pDC-rich CMML produce high level of pDCs in ex vivo culture, even in the absence of FMS-like tyrosine kinase 3 ligand (FLT-3L). In co-culture experiments, pDCs collected from the bone marrow of pDC-rich CMML decrease the proliferation of CD34+ cells in a dose-dependent manner. pDC increase is associated with an expansion of CD4+ regulatory T cells (Tregs). Retrospective analysis of a cohort of 216 CMML patients detected a mitigated effect of bone marrow infiltration with CD123high, TLC1+ cells on disease outcome, including a trend for a better overall survival of patients with a pDC excess but also an increased risk of leukemic transformation.
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Rôle de Tif1gamma dans les différenciations granulo-monocytaire et macrophagique / Role of Tif1gamma in granulomonocytory and macrophagic differentiationsChretien, Marie-Lorraine 18 December 2015 (has links)
La LMMC est une pathologie clonale de la cellule souche hématopoïétique dont les caractéristiques la classent parmi les syndromes myélodysplasiques/myéloprolifératifs (SMD/SMP). L’invalidation conditionnelle de Tif1γ au niveau hématopoïétique chez la Souris (Tif1γΔ/Δ) est responsable du développement d’un SMD/SMP mimant la LMMC humaine lorsque la souris atteint l’âge de 6 mois, faisant de Tif1γ un gène suppresseur de tumeur. Par ailleurs, malgré une monocytose, la population macrophagique péritonéale de ces souris est diminuée.Les objectifs de mon travail étaient de caractériser chez les souris malades la population myéloïde et d’étudier la différenciation macrophagique. Nous avons identifié chez les souris homozygotes Tif1γΔ/Δ une population morphologiquement immature, associant des caractéristiques granulocytaires et monocytaires. Les propriétés phénotypiques et moléculaires de cette population évoquent celles des cellules myéloïdes suppressives granulocytaires de type PMN-MDSC, faisant de Tif1γ un régulateur négatif de son développement. En sus, la différenciation in vitro des cellules myéloïdes médullaires en macrophages sous l’effet du CSF-1 est altérée. La baisse d’expression du CSF-1R n’explique pas à elle seule ces altérations puisque celle des cellules dendritiques est également perturbée sans modification de l’expression du GM-CSFR. Nous émettons l’hypothèse que l’augmentation d’expression de S100A8 et S100A9 chez les souris malades induit le développement des progéniteurs myéloïdes en cellules proches des PMN-MDSC au détriment des différenciations dendritique et macrophagique. En conclusion, Tif1γ est un régulateur majeur de la myélopoïèse. / Chronic myelomonocytic leukemia (CMML) is a hematologic stem cell disease whose characteristics correspond to myelodysplastic/myeloproliferative syndroms (MDS/MPS). Hematopoietic conditional deletion of Tif1γ in mice leads to the development of a MDS/MPS, mimiking human CMML, when age is comprised between 6 to 10 months, defining Tif1γ as a tumour suppressor gene. Moreover, peritoneal macrophage population in these mice is decreased despite a monocytosis.The aims of my work were first to characterize in sick mice the myeloid population, and second to study macrophage differentiation. The myeloid population in Tif1γΔ/Δ mice is morphologically immature, with granulocytic and monocytic features. We demonstrated that phenotypic and molecular characteristics of this population are close to those observed in PMN-MDSC (polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells), suggesting that Tif1γ is a negative regulator gene of this myeloid subset. Furthermore, we showed that in vitro macrophage differentiation of myeloid progenitors upon CSF-1 treatment is altered. Decreased expression of CSF1-R (CSF-1 receptor) does not totally explain this alteration since dendritic cell differentiation is also abnormal, without alteration in GM-CSFR expression. Therefore, we hypothesize that S100A8 and S100A9 hyperexpression in Tif1γΔ/Δ mice is able to promote PMN-MDSC-like differentiation at the expense of macrophage and dendritic differentiations. In conclusion, Tif1γ is a major myelopoiesis regulator gene.
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TIF1 gamma est un régulateur essentiel de l'hématopoïèse et agit en tant que suppresseur de tumeur dans la leucémie myélomonocytaire chronique / TIF1γ is an essential regulator of hematopoïesis and acts as a tumor suppressor in chronic myelomonocytic leukemiaAucagne, Romain 17 December 2010 (has links)
Mon travail de thèse consistait à caractériser le rôle de la protéine TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma) dans l’hématopoïèse adulte. L’hématopoïèse est un processus actif, ordonné, et hautement régulé faisant intervenir des étapes de prolifération, de différenciation et d’apoptose et permettant la production de toutes les cellules sanguines matures à partir d’un nombre restreint de cellules souches hématopoïétiques. La dérégulation des mécanismes intervenant dans l’hématopoïèse induit le développement d’hémopathies, notamment de leucémies. Les souris nullizygotes pour Tif1γ meurent au cours de l’embryogenèse du fait de graves défauts du développement. Afin d’étudier le rôle de Tif1γ dans l’hématopoïèse murine, et plus particulièrement sa contribution au développement et à la différenciation des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques, nous avons généré des souris déficientes pour Tif1γ uniquement dans les cellules hématopoïétiques. Nous avons observé que Tif1γ agit en tant que gène suppresseur de tumeur dans ces cellules. Nous avons aussi démontré que Tif1γ est un régulateur clef du devenir des cellules souches hématopoïétiques chez les mammifères. Nous avons mis en évidence que, chez les souris âgées, la délétion de Tif1γ provoque l’apparition d’un syndrome myéloprolifératif dysplasique, ressemblant fortement au phénotype de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) humaine. De façon intéressante, nous avons identifiéé que plus de 40% de patients atteints de cette pathologie présentent un faible taux de TIF1γ. La décitabine, molécule hypométhylante utilisée en thérapeutique, permet le rétablissememnt d’une expression normale de TIF1γ. Chez certains patients, nous avons corrélé la diminution de l’expression de TIF1 avec l’hyperméthylation de l’ADN et un patron spécifique de modifications d’histones (acétylations et méthylations) sur le promoteur du gène TIF1γ. Ces résultats suggèrent une signature épigénétique spécifique de la leucémie myélomonocytaire chronique sur le promoteur de TIF1γ. L’ensemble de nos données indiquent donc que TIF1γ est un gène suppresseur de tumeur régulé épigénétiquement dans les cellules hématopoïétiques. / My thesis deals with the characterization of the role of the protein TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma) in adult hematopoiesis. Hematopoiesis is an active process, orderly and highly regulated, using proliferation, differentiation and apoptosis steps, and allowing the production of mature blood cells from a restricted number of hematopoietic stem cells. Deregulation of mechanisms involved in hematopooiesis leads to the development of leukemias. Tif1γ knockout mice die during embryogenesis with severe development defects. In order to study the role of Tif1γ in murine hematopoiesis, and more particularly its contribution to hematopoietic stem and progenitor cells development and differentiation, we generated hematopoietic Tif1γ deleted mice. We showed that Tif1γ functions as a tumor suppressor gene in hematopoietic cells. Moreover, we identified Tif1γ as a key player in the commitment of mammal hematopoietic stem cells. In ageing mice, we demonstrated that the Tif1γ deletion leads to a myeloproliferative and myelodysplastic syndrome, phenotypically very close to the human chronic myelomonocytic leukemia (CMML). We also identified a very low level of TIF1γexpression in the monocytes of 40% CMML patients. Decitabine, a hypomethylating molecule used in CMML therapy, allows the restoration of a normal TIF1γ expression. In some patients, we have highlighted the correlation between the low expression of TIF1γ, the DNA hypermethylation and a specific pattern of histone modifications (acetylation and methylation) on TIF1γ gene promoter. These results suggest a specific epigenetic signature of the disease on this promoter. Taking together, our data indicate that TIF1γ is a tumor suppressor gene, epigenetically regulated in hematopoietic cells.
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Altérations génétiques et épigénétiques dans la leucémie myélomonocytaire chronique - Modulation par les agents déméthylants / Genetic and epigenetic alterations of chronic myelomonocytic leukemia - Modulation by demethylating agentsMerlevede, Jane 01 October 2015 (has links)
La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une pathologie clonale de la cellule souche hématopoïétique qui touche principalement les personnes âgées. Le seul traitement curatif de cette maladie est la greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques, souvent difficile à mettre en oeuvre. Les patients qui ne peuvent être greffés et dont la maladie présente des critères de gravité se voient proposer un agent déméthylant de l'ADN. Chez 30 à 40% d'entre eux, ce traitement induit une réponse objective dont le bénéfice en termes de survie n'est pas démontré. Le séquençage de gènes candidats a identifié une trentaine de gènes mutés de façon récurrente. Il s'agit de gènes codant des régulateurs épigénétiques, des facteurs d'épissage, des facteurs de transcription, et des protéines de la signalisation intracellulaire. Cette approche ne donnait qu'une vision partielle des événements génétiques associés à la maladie.Le premier objectif de cette thèse a été de recenser l'ensemble des mutations touchant les régions codantes et non codantes de l'ADN dans les cellules leucémiques des patients.Le séquençage de l'exome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 49 patients. Nos analyses ont montré qu'en moyenne, un patient porte 14 mutations somatiques dans les régions codantes. Nous avons confirmé que les mutations récurrentes les plus fréquentes affectaient les gènes TET2, SRSF2 et ASXL1. Nous avons aussi identifié 8 nouveaux gènes mutés de façon récurrente à une faible fréquence. En moyenne, 3 des 14 mutations affectent des gènes touchés de façon récurrente.Le séquençage du génome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 17 patients. L'analyse réalisée a détecté 475 mutations par patient dans les régions non répétées du génome. Dans l'exome, comme dans le reste du génome, les altérations principales sont des transitions. Deux signatures mutationnelles ont été identifiées et sont observées dans de nombreux cancers, traduisant probablement des altérations de la méthylation des cytosines au cours du vieillissement. Une troisième signature, jamais observée jusqu'alors et de signification indéterminée, a été détectée chez 2 patients.Nous avons alors répété l'analyse de l'exome dans les monocytes triés de 17 patients prélevés de façon séquentielle sur plus de 2 années : 6 n'ont pas été traités et 11 ont été traités par un agent déméthylant, parmi lesquels 6 sont restés stables et 5 ont montré une réponse clinique et biologique objective. L'analyse montre que 1) l'accumulation de mutations est un événement rare ; 2) l'hétérogénéité génétique du clone malade est limitée ; 3) la charge allélique des mutations reste inchangée, même chez les répondeurs ; 4) de nouvelles mutations peuvent apparaître alors que le patient est répondeur.Nous avons alors sélectionné 9 patients, 3 non traités, 3 stables sous traitement sans réponse objective, et 3 répondeurs. Nous avons collecté leurs monocytes avant tout traitement et quelques mois plus tard, alors que 6 d'entre eux étaient traités par un agent déméthylant. Nous avons analysé l'expression des gènes et la méthylation globale de l'ADN à ces deux temps. Chez les patients non traités, nous avons observé une remarquable stabilité de l'expression des gènes et de la méthylation de l'ADN. Chez les patients répondeurs, le traitement induit un changement significatif du niveau d'expression d'environ 500 gènes et la déméthylation d'environ 35,000 régions de l'ADN. Chez les patients stables sous traitement, le traitement induit un changement d'expression d'une soixantaine de gènes et du niveau de méthylation d'une centaine de régions seulement. Ces résultats suggèrent que les agents déméthylants n'affectent l'expression des gènes et la méthylation de l'ADN que chez les répondeurs, fournissant un argument important pour un effet essentiellement épigénétique et très peu cytotoxique de ces médicaments. / Chronic myelomonocytic leukemia is a clonal disorder of the hematopoietic stem cell, affecting mainly the elderly. The only curative therapeutic is allogeneic stem cell transplantation, which is rarely feasible. When transplantation is not an option, patients with a severe disease can be treated with a demethylating agent. Thirty to 40% of these patients show hematological improvement, but it remains unknown if these drugs increase overall survival. Analysis of candidate genes by Sanger sequencing, then by New Generation Sequencing, identified about thirty genes that are frequently mutated. These genes encode epigenetic regulators, splicing factors, transcription factors and cell signalling regulators. However, this approach catched only part of the genetic events that characterize this disease.The first objective of this study was to determine the mutational landscape of CMML cells by analyzing the coding and non coding regions of leukemic cell genome.We first performed whole exome sequencing analysis of leukemic and control cells in 49 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 14 somatic mutations in its coding regions. We confirmed that the most frequent mutations were in TET2, SRSF2 and ASXL1 genes. We identified also recurrent mutations in 8 new genes, these recurrent mutations occurring at a low frequency. In average, 3 out of the 14 mutations identified in each patient affected recurrently mutated genes.Secondly, we performed whole genome sequencing of leukemic and control cells in 17 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 475 somatic mutations in the non repeated regions of the genome. In both the coding and non coding sequences, alterations were observed to be mainly transitions. As a signature of CMML, two mutational processes were identified in all 17 patients and are found in various other cancer types, most likely resulting from the cytosine methylation observed with ageing. A third process, never seen before and without known significance, was also detected in two patients.We collected several samples from 17 patients on a more than two year period: 6 of these patients remained untreated whereas 11 were treated with demethylating agent, among which 6 showed a stable disease and 5 fulfilled criteria of hematological improvement. These sequential analyses showed that 1) the occurence of new mutations is a relatively rare event ; 2) the genetic heterogeneity of the malignant clone is limited ; 3) the mutation allele burden remains unchanged under treatment, whatever the response ; 4) new mutations can appear, even in responding patients.We selected 9 patients, 3 untreated, 3 stable on therapy and 3 responders. We collected monocytes before treatment and a few months later and we analyzed gene expression and DNA methylation in sorted monocytes at these two time points. We did not detect any significant change in gene expression and DNA methylation pattern in untreated patients. In those who responded to treatment, we noticed significant changes in both gene expression, with about 500 deregulated genes, and the DNA methylation pattern, with about 35,000 demethylated regions. In stable patients, the treatment had a limited effect with changes in the expression of about 60 genes, and in the DNA methylation pattern of about 100 regions. These results show that demethylating agents affect gene expression and DNA methylation of responding patients only, suggesting they have mostly an epigenetic effect rather than a cytotoxic one.
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