A biomassa vegetal é a maior fonte de carbono renovável disponível, e é composta de celulose, hemicelulose e lignina. A lignina, um heteropolímero polifenólico complexo, é uma barreira a utilização mais eficiente da biomassa. Fungos desenvolveram formas de superar o obstáculo imposto pela lignina, através da atividade de enzimas como peroxidases, e da ação de pequenas moléculas reativas. As duas formas dependem da presença de peróxido de hidrogênio, que é produzido pela atividade de enzimas como aril-álcool oxidases (AAOs). AAOs são enzimas pertencentes a superfamília GMC de oxidoredutases e, portanto, possuem FAD como grupo prostético. Realizam a conversão de álcoois aromáticos à aldeídos, com concomitante produção de peróxido de hidrogênio. Devido à capacidade de oxidação de substratos variados, e dependente somente de oxigênio molecular, AAOs têm potencial aplicação na indústria biotecnológica, tanto como produtoras de peróxido de hidrogênio quanto na produção de químicos-plataforma a partir da biomassa. No entanto, AAOs ainda têm poucos exemplares caracterizados, e a maior parte dos estudos publicados é referente a enzimas do gênero de fungos basidiomicetos Pleurotus sp.. A enzima MtAAOx do fungo ascomiceto termofílico M. thermophila foi produzida de forma heteróloga em A. nidulans, e algumas de suas propriedades bioquímicas e estruturais foram determinadas. MtAAOx é uma enzima extracelular monomérica glicosilada, com grupo FAD dissociável, e capaz de oxidar álcoois aromáticos fenólicos e não fenólicos, incluindo um monômero da lignina, coniferil álcool, substrato para o qual a enzima teve mais afinidade. MtAAOx, além de oxidar álcoois aromáticos, também foi capaz de oxidar um substrato heterocíclico, 5-HMF, e de utilizar outro aceptor de elétrons além do oxigênio. Esses resultados, aliados a baixa similaridade entre sequencias de aminoácidos indicam que MtAAOx tem sítio catalítico e canal de acesso do substrato distintos das AAOs até o momento caracterizadas. A enzima MtAAOx deglicosilada teve estabilidade térmica reduzida em comparação com a enzima nativa. A atividade enzimática foi afetada positivamente com a presença de alguns cátions, entre eles Ca2+. Além de afetar a atividade, Ca2+proporcionou ganho de estabilidade térmica, com aumento da temperatura de melting em 5 ºC. Esta enzima é uma nova aril-álcool oxidase caracterizada, a primeira de um fungo ascomiceto, e acredita-se que tenha papel na degradação da lignina da biomassa vegetal. / Plant biomass is the largest source of available renewable carbon, and is composed of cellulose, hemicellulose and lignin. Lignin, a complex polyphenolic heteropolymer, is a barrier to a more efficient use of biomass. Fungi have developed ways to overcome the obstacle imposed by lignin through the activity of enzymes such as peroxidases and the action of small reactive molecules. The two forms depend on the presence of hydrogen peroxide, which is produced by the activity of enzymes such as aryl-alcohol oxidases (AAOs). AAOs are enzymes belonging to the GMC superfamily of oxidoreductases and therefore have FAD as the prosthetic group. They perform the conversion of aromatic alcohols to aldehydes, with simultaneous production of hydrogen peroxide. Because of their capacity of oxidizing various substrates, and dependence only on molecular oxygen, AAOs have potential applications in the biotech industry, both as hydrogen peroxide producers and in the production of platform chemicals derived from biomass. However, characterized AAOs are few, most of the published studies being on enzymes of basidiomycete fungi from genus Pleurotus sp.. The MtAAOx enzyme of the thermophilic ascomycete M. thermophila was produced heterologously in A. nidulans, and some of its biochemical and structural properties were determined. MtAAOx is a glycosylated, monomeric, extracellular enzyme with a dissociable FAD group, capable of oxidizing phenolic and non-phenolic aromatic alcohols, including a lignin monomer, coniferyl alcohol, the substrate for which the enzyme has the highest affinity. MtAAOx, besides oxidizing aromatic alcohols, was also able to oxidize a heterocyclic substrate, 5-HMF, and to use another electron acceptor in addition to oxygen. These results, combined with the low similarity between amino acid sequences, indicate that MtAAOx has a catalytic site and substrate access channel distinct from characterized AAOs\'. The deglycosylated MtAAOx enzyme had reduced thermal stability compared to the native enzyme. The enzymatic activity was positively affected by the presence of some cations, including Ca2+. In addition to affecting the activity, Ca2+ improved thermal stability, with 5 °C increase of the melting temperature. This enzyme is a novel aryl-alcohol oxidase characterized, the first of an ascomycete fungus, and is believed to play a role in the lignin degradation of plant biomass.

A biomassa vegetal é a maior fonte de carbono renovável disponível, e é composta de celulose, hemicelulose e lignina. A lignina, um heteropolímero polifenólico complexo, é uma barreira a utilização mais eficiente da biomassa. Fungos desenvolveram formas de superar o obstáculo imposto pela lignina, através da atividade de enzimas como peroxidases, e da ação de pequenas moléculas reativas. As duas formas dependem da presença de peróxido de hidrogênio, que é produzido pela atividade de enzimas como aril-álcool oxidases (AAOs). AAOs são enzimas pertencentes a superfamília GMC de oxidoredutases e, portanto, possuem FAD como grupo prostético. Realizam a conversão de álcoois aromáticos à aldeídos, com concomitante produção de peróxido de hidrogênio. Devido à capacidade de oxidação de substratos variados, e dependente somente de oxigênio molecular, AAOs têm potencial aplicação na indústria biotecnológica, tanto como produtoras de peróxido de hidrogênio quanto na produção de químicos-plataforma a partir da biomassa. No entanto, AAOs ainda têm poucos exemplares caracterizados, e a maior parte dos estudos publicados é referente a enzimas do gênero de fungos basidiomicetos Pleurotus sp.. A enzima MtAAOx do fungo ascomiceto termofílico M. thermophila foi produzida de forma heteróloga em A. nidulans, e algumas de suas propriedades bioquímicas e estruturais foram determinadas. MtAAOx é uma enzima extracelular monomérica glicosilada, com grupo FAD dissociável, e capaz de oxidar álcoois aromáticos fenólicos e não fenólicos, incluindo um monômero da lignina, coniferil álcool, substrato para o qual a enzima teve mais afinidade. MtAAOx, além de oxidar álcoois aromáticos, também foi capaz de oxidar um substrato heterocíclico, 5-HMF, e de utilizar outro aceptor de elétrons além do oxigênio. Esses resultados, aliados a baixa similaridade entre sequencias de aminoácidos indicam que MtAAOx tem sítio catalítico e canal de acesso do substrato distintos das AAOs até o momento caracterizadas. A enzima MtAAOx deglicosilada teve estabilidade térmica reduzida em comparação com a enzima nativa. A atividade enzimática foi afetada positivamente com a presença de alguns cátions, entre eles Ca2+. Além de afetar a atividade, Ca2+proporcionou ganho de estabilidade térmica, com aumento da temperatura de melting em 5 ºC. Esta enzima é uma nova aril-álcool oxidase caracterizada, a primeira de um fungo ascomiceto, e acredita-se que tenha papel na degradação da lignina da biomassa vegetal. / Plant biomass is the largest source of available renewable carbon, and is composed of cellulose, hemicellulose and lignin. Lignin, a complex polyphenolic heteropolymer, is a barrier to a more efficient use of biomass. Fungi have developed ways to overcome the obstacle imposed by lignin through the activity of enzymes such as peroxidases and the action of small reactive molecules. The two forms depend on the presence of hydrogen peroxide, which is produced by the activity of enzymes such as aryl-alcohol oxidases (AAOs). AAOs are enzymes belonging to the GMC superfamily of oxidoreductases and therefore have FAD as the prosthetic group. They perform the conversion of aromatic alcohols to aldehydes, with simultaneous production of hydrogen peroxide. Because of their capacity of oxidizing various substrates, and dependence only on molecular oxygen, AAOs have potential applications in the biotech industry, both as hydrogen peroxide producers and in the production of platform chemicals derived from biomass. However, characterized AAOs are few, most of the published studies being on enzymes of basidiomycete fungi from genus Pleurotus sp.. The MtAAOx enzyme of the thermophilic ascomycete M. thermophila was produced heterologously in A. nidulans, and some of its biochemical and structural properties were determined. MtAAOx is a glycosylated, monomeric, extracellular enzyme with a dissociable FAD group, capable of oxidizing phenolic and non-phenolic aromatic alcohols, including a lignin monomer, coniferyl alcohol, the substrate for which the enzyme has the highest affinity. MtAAOx, besides oxidizing aromatic alcohols, was also able to oxidize a heterocyclic substrate, 5-HMF, and to use another electron acceptor in addition to oxygen. These results, combined with the low similarity between amino acid sequences, indicate that MtAAOx has a catalytic site and substrate access channel distinct from characterized AAOs\'. The deglycosylated MtAAOx enzyme had reduced thermal stability compared to the native enzyme. The enzymatic activity was positively affected by the presence of some cations, including Ca2+. In addition to affecting the activity, Ca2+ improved thermal stability, with 5 °C increase of the melting temperature. This enzyme is a novel aryl-alcohol oxidase characterized, the first of an ascomycete fungus, and is believed to play a role in the lignin degradation of plant biomass.

O Câncer é uma doença responsável pelos maiores índices de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A ocorrência do câncer é relacionada com vários fatores, entre eles, ambientais, nutricionais, genéticos, infecções virais e estilo de vida. Devido a complexidade da doença, há uma busca incessante em novos tratamentos. Atualmente, os medicamentos conhecidos, além de danificar células anormais prejudicam células saudáveis, o que causa efeitos colaterais e toxicidade. Algumas moléculas, por exemplo peptídeos, possuem a capacidade de interagir com proteínas de membrana de células cancerígenas, atuando diretamente nestas células. Estes peptídeos podem ser obtidos a partir da hidrólise de diferentes fontes de proteínas com a utilização de peptidases de origem microbiana. O objetivo do presente estudo foi produzir e purificar peptidases de dois fungos, Eupenicillium javanicum e Myceliophthora thermophila, realizar ensaios de caracterização bioquímica e eficiência catalítica destas enzimas, aplica las na obtenção de peptídeos bioativos a partir de proteínas do leite, ovo e gelatina, e avaliar a atividade antioxidante (in vitro) e atividade antitumoral (in vitro e in vivo) destes peptídeos. Foram produzidas e purificadas duas peptidases, uma metalopeptidase (E. javanicum) e uma serinopeptidase (M. thermophila), o ensaio de cinética enzimática mostrou maior eficiência catalítica na utilização de substratos com alanina na posição P\'2 e tirosina na posição P\'1 da cadeia polipeptídica, respectivamente para cada uma das enzimas. Os peptídeos, produzidos a partir de caseína, apresentaram maior atividade de sequestro de radicais e de quelar ferro. Peptídeos de soro de leite e gelatina inibiram o crescimento de células tumorais de câncer oral e melanoma (in vitro). Peptídeos de soro de leite produzidos por ambas as peptidases reduziram o volume tumoral (células Cal27) em camundongos imunodepriminidos. Ensaios proteômicos destes tumores, com comparação entre grupos tratados e sem tratamento, mostraram que algumas vias envolvidas com a apoptose podem estar envolvidas na redução do volume dos tumores do camundongos tratados com peptídeos obtidos de soro de leite / The cancer is a disease responsible to the higher levels of mortality and morbity around the world. This disease is related to many factors, as environment, nutrition, genetic, virus infection and life style.The complexity of this disease increases the research of new treatments. Currently, the medicines damage both, normal and cancer cells, it promotes side effects and toxicity. Some molecules present specificity and bind to proteins from membranes of cancer cells, some examples are peptides. Peptides can be obtained from proteins by hydrolisys with microrbial proteases. The aim of this study was to produce and purify two proteases from fungi, Eupenicillium javanicum and Myceliophthora thermophila. Biochemical characterization and kinetic assays of these enzymes were evaluated. And then, the proteases were applied on obtention of peptides from milk, egg and gelatin proteins, and the antioxidant (in vitro) and antitumoral activity (in vitro e in vivo) of these peptides were evaluated. The purified enzymes belong to metalo (E. javanicum) and serine (M. thermophila) protease classes, the kinetic assay showed higher catalytic efficiency with tyrosine at P\'1 position and alanine at P\'2 position of polypeptide chain of substrate, to metalo and serine protease, respectively. The peptides from casein presented capacity to scavenge free radicals and to quelate iron. Peptides derived from whey and gelatin inhibited the grown of oral cancer and melanoma cells (in vitro). Peptides obtained from whey decreased the tumor volume of immunosupressed mice. Proteomic assays of these tumors, when compared treatment and control group, showed that peptides can be envolved in some apoptosys pathway and it influences the tumor volume, cosequently, it is decreased on treatment with peptides derived from milk whey

A produção de biocombustíveis e a obtenção de alguns compostos químicos a partir de materiais renováveis, como a biomassa lignocelulósica, ainda não são processos triviais, principalmente devido a recalcitrância destes materiais. Estudos recentes reconheceram as enzimas acessórias, como xilanases e enzimas com Atividade Auxiliar, como potencializadores da atividade de celulases no processo de despolimerização da lignocelulose. A prospecção de enzimas com características termoestáveis é vantajosa para este tipo de aplicação e além disso, estudos sobre o secretoma de diversos fungos cultivados em biomassa como fonte de carbono, tem encontrado enzimas com mecanismo oxidativo, dentre eles, o fungo termofílico Myceliophthora thermophila M77. Porém, estas enzimas tem sido pouco estudadas quanto a sua aplicação na sacarificação da biomassa. Sendo assim, este trabalho visou a expressão heteróloga, a caracterização bioquímica e a ação da enzima oxidativa celobiose desidrogenase do fungo M. thermophila (M77CDH) em conjunto com outras celulases no processo de sacarificação da biomassa. Pela análise filogenética a M77CDH prospectada foi classificada como pertencente a Classe IIB das CDHs. O gene que codifica esta enzima foi clonado no vetor pEXPYR e heterólogamente expresso em A. nidulans. A proteína recombinante M77CDH foi purificada e teve sua identidade confirmada por espectrometria de massas. Nas análises bioquímicas, apresentou atividade ótima a 65 °C e reteve mais de 80% da sua atividade a 50°C por 2 horas e pela análise de dicroísmo circular apresentou um desenovelamento da sua estrutura na temperatura de transição de 62,8 °C. Apresentou mais de 80% de atividade em uma faixa ampla de pH (4,5 - 9), em que o domínio citocromo mostrou maior afinidade em pHs alcalinos, característica incomum entre as CDHs descritas na literatura. A atividade da M77CDH foi ligeiramente aumentada pela adição de MgCl2 e Na2MoO4 e altamente afetada por CuSO4 e FeCl3. A eficiência catalítica (kcat/km=266 mM-1s-1) utilizando celobiose foi bastante similar aos valores indicados por CDHs da Classe IIA. O envelope da M77CDH gerado por SAXS foi satisfatório e conveniente com a literatura. Na sacarificação de bagaço de cana pré-tratado hidrotermicamente, utilizando coquetel de A. niveus suplementado com M77CDH, foi possível observar que a adição de M77CDH modificou o perfil de produtos liberados na desconstrução da biomassa. Por fim, na sacarificação do PASC observou-se a sacarificação e produção de ácido celobiônico. / The production of biofuels and chemicals from renewable materials such as lignocellulosic biomass are non-trivial processes mainly due to the recalcitrance of the material. Recent studies have recognized accessory enzymes such as xylanases and Auxiliary Activity enzymes as potentiators in cellulase activity during the depolymerization of lignocellulose. The prospection of thermostable enzymes can be an advantage the improve the depolymerization of these materials. In addition, several enzymes showing oxidative mode of action were found in the secretoma of the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila strain M77. However, these enzymes are poor studied regarding their application in biomass saccharification. Therefore, this project aimed the heterologous expression and biochemical characterization of the oxidative enzyme cellobiose dehydrogenase of the fungus M. thermophila (M77CDH). By phylogenetic analysis the M77CDH was classified as belonging to Class IIB of CDHs. The gene encoding this enzyme was cloned and heterologously expressed in A. nidulans, the M77CDH was purified and had its identity confirmed by mass spectrometry. In the biochemical analyzes the M77CDH showed an optimum activity at 65 °C and retained more than 80% of its activity at 50 °C for 2 hours. The circular dichroism analysis showed a denaturation of its structure at the transition temperature of 62.8 ° C. M77CDH also kept more than 80% of its activity in a wide pH range (4.5 - 9), in which the cytochrome domain showed higher affinity at alkaline pH, an unusual behavior compared with other CDHs described in the literature. The activity of M77CDH was increased slightly in the presence of MgCl2 and Na2MoO4 and was highly affected by CuSO4 and FeCl3. The catalytic efficiency (kcat/km = 266 mM-1s-1) in cellobiose was quite similar to the values indicated by CDHs from Class IIA. The envelope of M77CDH generated by SAXS was satisfactory and convenient with the literature. In saccharification of sugarcane bagasse hydrothermally pretreated using A. niveus cocktail supplemented with M77CDH was possible to observe the addition of M77CDH modified the profile of released products in the deconstruction of the biomass. Finally, in the action on PASC was observed the saccharification and production of cellobionic acid.

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As β-glicosidases são cruciais para a total sacarificação da celulose, mas na maioria dos casos elas são fortemente inibidas pelo seu produto, a glicose. Portanto, o conhecimento das cinéticas de hidrólise e as respostas dessa enzima frente a diferentes substratos e produtos pode definir a eficiência de hidrólise e do processo biotecnológico no qual poderia ser incorporada. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a β -glicosidase de 50 kDa (BG50) produzida pelo fungo termofílico Myceliophthora thermophila M.7.7 cultivado em estado sólido, em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (1:1). O zimograma do extrato bruto evidenciou duas isoformas, de aproximadamente 200 e 50 kDa, as quais foram separadas por cromatografia de filtração em gel. A caracterização da BG50 mostrou atividade ótima a 60 ˚C e pH 5,0 quando usado o 4-nitrofenol-β-D-glicopiranosídeo (pNPG), enquanto com celobiose o valor da temperatura e pH ótimo foram de 50 ˚C e pH 4,5, respectivamente. Testes realizados com adição de íons e reagentes mostraram diferenças nos efeitos sobre a atividade da enzima dependendo do substrato, principalmente com a adição de Ditiotreitol (DTT) utilizando celobiose, e inibição completa com Cu2+ e Fe3+ para pNPG e celobiose. Além disso, a enzima não mostrou efeito inibitório quando testada na presença de nove compostos fenólicos, uma característica significativa. Os estudos cinéticos revelaram um perfil de inibição competitiva pela glicose quando utilizado pNPG com valor de KI=1,5 mM e um Km significativamente menor (0,52 mM) pelo pNPG do que pela celobiose (Km=8,50 mM). Os parâmetros termodinâmicos mostraram que a BG50 é bastante estável, destacando seu tempo de meia vida de 855,6 minutos a 60 °C, porém desnatura facilmente acima dessa temperatura. Os resultados enfatizam a importância de investigar potencialidades de β-glicosidases baseadas na celobiose, uma vez que no processo industrial a enzima atuará sobre o substrato natural, além da compreensão da termoestabilidade da enzima. / Cellulases can be used in bioconversion of cellulose from agro-industrial waste into fermentable sugars in order to obtain renewable fuels and chemicals. The β-glucosidases are crucial to the overall saccharification of cellulose, but in most cases, they are strongly inhibited by its product, glucose. Therefore, knowledge of the hydrolysis kinetics of the enzyme and its responses against different substrates and products can set the hydrolysis efficiency and possible incorporation in biotechnological process. This study aimed to characterize the 50 kDa β-glucosidase (BG50) produced by the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 grown in solid state, in a mixture of sugarcane bagasse and wheat bran (1:1). The zymogram of the crude extract showed two isoforms of 200 and 50 kDa, which were separated by gel filtration chromatography. The characterization of BG50 showed optimal activity at 60 °C and pH 5.0 when used pNPG, whereas using cellobiose the values of the optimal temperature and pH were 50 °C and pH 4.5, respectively. Tests with addition of reactants and ions showed differences in the effects on enzyme activity depending on the substrate, especially with the addition of dithiothreitol (DTT) utilizing cellobiose, and complete inhibition with Cu2+ and Fe3+ for 4-nitrophenyl-β- D-glucopyranoside (pNPG) and cellobiose. Furthermore, the enzyme showed no inhibitory effect when tested in the presence of nine phenolic compounds, a remarkable characteristic. Kinetic studies showed a profile of competitive inhibition by glucose when using pNPG with Ki = 1.5 mM and Km significantly lower (0.52 mM) with pNPG than using cellobiose (Km = 8.50 mM). The thermodynamic parameters show that BG50 is quite stable, highlighting its half life of 855.6 minutes at 60 ° C, but above this temperature easily denatured. The results emphasize the importance of investigating β-glucosidases’ potential based on cellobiose, since for the industrial processes the enzyme will function with its natural substrate, in addition to understanding the thermal stability of the enzyme.