A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Resumo: O presente trabalho evidencia os esforços realizados na tentativa de se aperfeiçoar a técnica de MIRU ("Mycobacterial Interspersed Repetitive Units"). Esta utiliza como marcadores, diferenças em fragmentos de DNA não codificadores específicos do Mycobacterium tuberculosis e vem sendo empregada para o estudo epidemiológico da tuberculose, pela facilidade de execução. A técnica de MIRU possibilita uma comparação entre linhagens de diferentes áreas geográficas e permite o rastreamento da movimentação de linhagens individuais. Na otimização os seguintes parâmetros foram determinados: 1. protocolos de purificação de DNA; 2. estratégias de amplificação pela PCR; 3. comparações entre um "kit" de PCR ("PCR Master Mix" - PROMEGA) e a utilização da PCR da maneira convencional; 4. testes de variadas condições de amplificação utilizando o "kit" e os reagentes convencionais de PCR; 5. determinação de protocolos de ciclagem para a amplificação dos fragmentos desejados; 6. teste de amplificação sem a prévia extração de DNA das amostras utilizadas. Após a padronização a metodologia foi utilizada na tipagem de 82 amostras de M. tuberculosis que se encontravam divididas em dois grupos, sendo o primeiro com 49 amostras, provenientes de pacientes do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA - USP, Araraquara) e o segundo, composto de 33 amostras de bactérias com perfil de resistência a pirazinamida e a outras drogas, provenientes de Maringá. Nesta etapa foram realizados: 7. PCR para a confirmação de gênero e espécie para M. tuberculosis nas 82 amostras analisadas. 8. Aplicação da técnica de MIRU e análise manual de todas as amostras provenientes de pacientes; 9. Emprego de ferramentas de bioinformática (programa PAST "Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis") para a análise das amostras... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present work shows efforts to improve the MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) assay. This methodology, that has been exploited for fingerprinting the Mycobacterium tuberculosis in molecular epidemiological studies, allows for direct and reliable comparison of results between laboratories and the development of large-scale epidemiological studies. In the optimization of MIRU assay, some parameters were defined: DNA purification protocols and PCR strategies were compared, to select the most practical and economical among them. After the standartization, 82 M. tuberculosis strains, from two different groups were analised. The 49 bacteria strains from the first group were sensible and the 33 from the second one were resistant to pyrazinamide and another drugs as isoniazide and/or rifampicin. To stablish the allelic studies the samples were first confirmed as M. tuberculosis by PCR. Then the MIRU assay was applied and the genetic profile was determined. These results generated dendrograms, obtained by bioinformatic tools. This study showed that any kind of DNA purification and even the use of fresh bacterial culture directly into the PCR tube can be used. When the PCR strategies were compared the utilization of the PCR kit seemed to be more practical and to avoid some mistakes that can happens during the "home-made" PCR mixture preparation. Furthermore, it allows some dilutions higher than those recommended by the manufacturer. In the same way, the "home-made" mixture in amounts smaller than those suggested can be used. These experiments indicated that only two annealing temperatures can be used to the PCR with the twelve primer pairs, always in the same MgCl2 concentration, allowing the amplification of more samples at the same time. To generate dendrograms with the allelic data from clinical samples... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Coorientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Mario Hiroyuki Hirata / Banca: Fernando Augusto Fiúza de Melo / Banca: Daisy Nakamura Sato / Banca: Rosilene Fressatti Cardoso / Doutor

Dentre todas as doenças infecciosas que têm afligido a raça humana, a tuberculose (TB) continua sendo uma das mais letais, resistindo às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. Atualmente, epidemiologistas estimam que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo da TB, com uma taxa anual de 8 a 10 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes. O aumento na prevalência da TB, a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas, e o efeito devastador da co-infecção pelo vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas e mais eficientes drogas anti-TB. Estas podem ser desenhadas baseadas em vias metabólicas essenciais ao patógeno e ausentes em seu hospedeiro; este é o caso da via de biossíntese de histidina, que está ausente em mamíferos e é comprovadamente essencial em micobactérias. Mais especificamente, demonstrou-se experimentalmente que o nocauteamento por recombinação homóloga do gene hisD de Mycobacterium tuberculosis, codificante da enzima L-histidinol desidrogenase (HisD), gerou mutantes auxotróficos para histidina completamente inviáveis, comprovando sua essencialidade para sobrevivência. Visto que as enzimas codificantes desta via podem representar alvos atrativos para o desenvolvimento de agentes anti-TB, o gene hisD de M. tuberculosis H37Rv foi amplificado, clonado e seqüenciado, e a proteína recombinante foi superexpressa na forma solúvel em Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados aqui apresentados validam hisD como o gene estrutural codificante da enzima HisD em M. tuberculosis, sendo um passo crucial em direção à purificação da proteína recombinante de forma a prover material para estudos estruturais e cinéticos, visando o desenho racional de novos agentes anti-TB. / Among all infectious diseases that have afflicted the human race, tuberculosis (TB) remains one of the deadliest, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. At present, epidemiologist estimate that one-third of the world population is infected by the tubercle bacilli, with an annual rate of 8 to 10 million new cases and 3 million deaths. The increasing prevalence of TB, the emergence of multidrug-resistant strains, and the devastating effect of the human immunodeficiency virus co-infection have led to an urgent need for the development of new and more efficient anti-TB drugs. They can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen and absent in its host; that is the case for the histidine biosynthetic pathway, which is absent in mammals and has been proved to be essential in mycobacteria. More precisely, experimental data has demonstrated that the disruption of Mycobacterium tuberculosis L-histidinol dehydrogenase hisD-encoding gene by homologous recombination resulted in unviable histidine auxotrophic mutants, proving its essentiality for survival. Since the coding enzymes of this pathway may represent attractive targets for the design of anti-TB agents, the hisD gene from M. tuberculosis H37Rv was amplified, cloned and sequenced, and the recombinant protein was superexpressed in the soluble form in Escherichia coli BL21(DE3). The results reported here validate hisD as the structural gene coding for histidinol dehydrogenase in M. tuberculosis, which is a crucial step towards purification of recombinant protein to provide material for structural and kinetic studies, aiming at the rational design of new anti-TB agents.

Tuberculose (TB) Multidroga resistente (MDR) é definida como a doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis) com resistência ao menos a isoniazida (INH) e rifampicina (RMP), sendo um crescente problema de saúde pública em todo o mundo. A escolha do tratamento da tuberculose multiresistente (MDR-TB) deveria ser baseada em testes de suscetibilidade as drogas. Estes métodos são laboriosos e demorados, sendo comum ter que aguardar até mais de quatro semanas para obtenção do resultado. Por esta razão, a maioria dos pacientes é orientado a realizar o tratamento sem um teste de susceptibilidade. A detecção precoce do bacilo, bem como a detecção de sua resistência, é crucial para um tratamento adequado, evitando a propagação de cepas resistentes na comunidade. Os métodos baseados em biologia molecular, apesar de rápidos, costumam requerer o uso de equipamentos de alto custo, como o, sequenciador ou GeneXpert MTB/RIF o que inviabiliza a sua utilização na rotina dos laboratórios públicos no Brasil. Por estas razões, objetivamos padronizar uma metodologia de hibridização molecular em membranas (LINE-TB/MDR) capaz de detectar as mutações mais frequentemente relacionadas com resistência a RMP e a INH em isolados de M. tuberculosis, as duas principais drogas utilizadas no tratamento da doença. Sondas gênicas com estas mutações, localizadas nos genes katG, rpoB e inhA , foram fixadas em membrana de náilon para hibridizar com o produto de um PCR multiplex, permitindo a detecção rápida das mutações. O método foi validado em um painel de referência de 108 amostras devidamente caracterizadas pelo teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA) e sequenciamento gênico. Quando comparado com o TSA a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo, para RMP foi 100% em todas as análises. Considerando a análise de resistência a INH, o teste obteve sensibilidade, especificidade, VPP e VPN de 77%, 100%, 100% e 82% respectivamente. Quando comparado com o sequenciamento a sensibilidade, especificidade, VPP e VPN para RMP foi de 100% para todas as análises. Para resistência a INH a sensibilidade especificidade PPV e NPV foi 94,3%, 100%, 100% e 94,8% respectivamente. O método desenvolvido poderá ser utilizado como uma alternativa para a identificação rápida de cepas multirresistentes, além de permitir a identificação do complexo M. tuberculosis. / Multidrug-resistant (MDR) tuberculosis (TB), defined as the disease caused by a Mycobacterium tuberculosis strain with resistance to at least isoniazid (INH) and rifampicin (RMP), is a growing public health and clinical problem worldwide. The choice of treatment of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is often based on drug susceptibility testing (DST). Drug susceptibility testing by conventional methods takes more than 4 weeks. An accurate and early detection of drug resistance in M. tuberculosis isolates is crucial for appropriate treatment, and to prevent the development of further resistance and the spread of resistant strains. Generally, DNA sequencing-based approaches are considered the reference assays for the detection of mutations, but often they have been found to be too cumbersome for routine use. For this reason, the aim of this study was to standardize a molecular hybridization method (LINE-TB/MDR) able to detect the most frequent mutations related to resistance to RMP and INH in M. tuberculosis isolates. Specific mutations found in the genes rpoB, katg and inhA have been reported as a marker for resistance to tuberculosis first line drugs. The assay was validated on a reference panel with 108 samples well-characterized by antimicrobial susceptibility testing (AST) and DNA sequencing. When compared to AST, the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of the LINE-TB/MDR, were 100% for all analyses. For INH resistance, the sensitivity, specificity, PPV and NPV were 77%, 100%, 100% and 82% respectively. When compared with sequencing, the sensitivity, specificity, PPV and NPV of the LINE-TB/MDR, for RMP resistance, were 100% for all analyses. For INH resistance the sensitivity, specificity, PPV and NPV were 94,3%, 100%, 100% and 94.8% respectively The developed assay could be used as an alternative for rapid identification of multi drug resistant (MDR) strains, and additionally, allowing the M. tuberculosis complex identification.

A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada pelo bacilo 288 Mycobacterium tuberculosis, a qual ocupa a segunda posição mundial entre 289 causas de mortes por um único agente infeccioso. O desenvolvimento da 290 imunidade protetora e o controle da infecção por M. tuberculosis são amplamente 291 atribuídos a função desempenhada por citocinas pró e anti-inflamatórias. No 292 entanto, 90-95% dos indivíduos infectados com o bacilo conseguem conter ou 293 eliminar a infecção enquanto o restante desenvolve a TB ativa. As razões pelas 294 quais 5-10% dos indivíduos com competência imunológica completa são 295 suscetíveis `a TB ainda permanecem desconhecidas. Porém, nas últimas 296 décadas, estudos epidemiológicos têm trazido fortes evidências de que 297 componentes genéticos humanos contribuem significativamente para essa 298 interindividual variabilidade na suscetibilidade `a TB. Assim, o objetivo deste 299 trabalho foi avaliar a influência dos polimorfismos IL2 -330 T>G (rs2069762); IL4 -300 590 C>T (rs2243250); IL6 -174 G>C (rs1800795); IL10 -592 A>C (rs1800872); 301 IL10 -1082 G>G (rs1800896); IL17A -692 C>T (rs8193036); IL17A -197 G>A 302 (rs2275913); TNF -238 G>A (rs361525); TNF -308 G>A (rs1800629) e IFNG +874 303 T>A (rs2430561) localizados em genes de citocinas na suscetibilidade ao 304 desenvolvimento da tuberculose pulmonar (TBP) em uma população de adultos 305 do sul do Brasil.Os resultados obtidos sugerem fortemente um papel protetor para 306 os polimorfismo IL17A -197G>A (rs2275913) e IL6-174 G>C (rs1800795) no 307 desenvolvimento da TBP nessa população. O efeito protetor foi atribuído ao alelo 308 IL17A-197A (OR=0.29; p=0.04), genótipo AA (OR=0.12; p=0.04) e portadores do 309 alelo A (AG/AA) (OR=0.29; p=0.004). Da mesma forma, o polimorfismo IL6-310 174G>C mostrou ter um efeito protetor no desenvolvimento da TBP em 311 portadores do alelo C (CC/CG) (OR= 0.46; p=0.04). Ambos os polimorfismos 312 mantiveram a significância estatística após a correção usando o teste FDR. Os 313 demais polimorfismos avaliados não mostraram evidências que suportem 314 associação ao desenvolvimento da TBP em adultos nesta população. Os 315 polimorfismos IL17A -692 C>T (rs8193036) e IFNG +874 T>A (rs2430561) foram excluídos das análises porque não estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Em 317 conclusão, este trabalho identificou pela primeira vez na população do sul do 318 Brasil um efeito protetor dos polimorfismo IL17A -197 G>A e IL6 -174 G>C no 319 desenvolvimento da TBP em adultos. Esses resultados indicam o papel 320 importante para as citocinas pro-inflamatórias IL17A e IL6 na imunofisiologia da 321 TB. / Tuberculosis is an infectious disease caused by Mycobacterium 340 tuberculosis bacillus, which ranks second worldwide position among causes of 341 deaths from a single infectious agent. The development of protective immunity and 342 control of infection by M. tuberculosis are largely attributed to the role of pro and 343 anti-inflammatory cytokines. However, 90-95% of individuals infected with bacillus 344 can contain or eliminate the infection while the remainders develop active TB. The 345 reasons why 5-10% of individuals with full immune competence are susceptible to 346 TB remain unknown. However, in recent decades, epidemiological studies have 347 brought strong evidence that human genetic components contribute significantly to 348 this interindividual variability in susceptibility to TB.Thus the aim of this work was 349 to evaluate the influence of polymorphisms IL2 -330 T>G (rs2069762); IL4 -590 350 C>T (rs2243250); IL6 -174 G>C (rs1800795); IL10 -592 A>C (rs1800872); IL10 -351 1082 A>G (rs1800896); IL17A -692 C>T (rs8193036); IL17A -197 G>A 352 (rs2275913); TNF -238 G>A (rs361525); TNF -308 G>A (rs1800629) and IFNG 353 +874 T>A (rs2430561) located in cytokine candidates genes in the susceptibility to 354 development of pulmonary tuberculosis in south Brazil population.The results 355 strongly suggest a protective role for the IL17A -197G > A (rs2275913) and IL6-356 174 G>C polymorphism (rs1800795) in the development of pulmonary 357 tuberculosis in this population. The protective effect was attributed to IL17A -197 358 allele A (OR = 0.29; p = 0:04), AA genotype (OR = 0:12; p = 0:04) and carriers of 359 the A allele (AG / AA) (OR = 0.29; p = 0.004 ). Likewise, the IL6 -174G>C shows 360 an association for C carriers (CC/CG) (OR= 0.46; p=0.04). Both polymorphisms 361 maintained the statistical significance after correction using FDR test. However, no 362 evidence of association was identified for any other polymorphism studied in this 363 population.IL17A polymorphisms -692 C>T (rs8193036) and IFNG +874 T>A 364 (rs2430561) polymorphisms were excluded from the analysis because they were 365 not in Hardy-Weinberg equilibrium. In conclusion, our results identified for the first 366 time in Southern Brazil population a protective role for IL17A -197 G>A and IL6 -367 174 G>C polymorphisms in adult pulmonary tuberculosis development. These results indicate an important role for IL-17A and IL-6 pro-inflammatory cytokines in 369 immunophysiology of tuberculosis.

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Considerando as limitações do diagnóstico convencional da tuberculose (TB) e o avanço das tecnologias de diagnóstico, nosso grupo desenvolveu o ensaio in house TaqMan-IS6110 para a detecção do DNA do complexo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo deste estudo foi determinar a acurácia do Detect-TB e do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com os métodos de diagnóstico padrão ouro para a TB e o desfecho clínico. Um total de 216 amostras clínicas de escarro espontâneo de pacientes com suspeita de TB foram incluídas. A sensibilidade (SE) e especificidade (SP) do Detect-TB em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram de 89,4% e 70,4%. A SE e SP do Detect-TB em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 86,6% e 66,4%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram 92,1% e 62,0%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 93,3% e 55,5%. A concordância entre os testes foi demonstrada pelo índice Kappa de 0,56 (P < 0,001) (n= 197). O Detect-TB e o ensaio TaqMan-IS6110 apresentaram valores de SE consistentes e SP inferiores quando comparados com outros testes moleculares in house e kits comerciais. O ensaio TaqMan-IS6110 deve ser avaliado com um maior número amostral para poder ser validado e para, eventualmente, poder ser implementado comercialmente. / Considering the limitations of conventional tuberculosis (TB) diagnosis and the advancement of diagnostic technologies, our group developed an in house IS6110-TaqMan assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA. The aim of the study was to determine the accuracy of the commercial molecular diagnostic assay Detect-TB and the IS6110-TaqMan assay compared to the TB gold standard diagnostic methods and the clinical outcome. A total of 216 clinical specimens of spontaneous sputum from TB suspected patients were included. Detect-TB sensitivity (SE) and specificity (SP) compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 89.4% and 70.4%. Detect-TB SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 86.6% and 66.4%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 92.1% and 62.0%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 93.3% and 55.5%. The concordance among the tests were demonstrated by the Kappa index of 0.56 (P < 0.001) (n= 197). IS6110-TaqMan assay and Detect-TB showed consistent SE and lower SP when compared with other current molecular in house and commercial kits. IS6110-TaqMan assay should be evaluated with a larger number of samples to be validated and may eventually be implemented commercially.

A enzima -cetoacil-PCA redutase catalisa a redução, dependente de NADPH, de - cetoacil-PCA, a segunda etapa do sistema tipo II de elongação de ácidos graxos em bactérias, plantas e organismos apicomplexos. No presente trabalho, utilizou-se acetoacetil- CoA como substrato para caracterizar cineticamente a reação catalisada pela enzima de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose. O mecanismo cinético da reação foi investigado pela análise de padrões de velocidade inicial, inibição por produtos e efeitos isotópicos primários cinéticos, e os resultados apontam para um mecanismo aleatório em estado estacionário. Efeitos isotópicos cinéticos primários, a-secundários, de solvente e múltiplos, bem como estudos de pH e temperatura, ressonância magnética nuclear e variação dos efeitos isotópicos primários com o pH foram utilizados para determinar o mecanismo químico da reação, e a análise dos resultados sugere que as transferências de hidreto e próton e a re-hibridização dos substratos ocorrem de modo concertado. A interação entre NADPH e enzima foi estudada tanto em condições de equilíbrio quanto em estado pré-estacionário, monitorando-se o aumento na fluorescência do nucleotídeo ao ligar na proteína. Os dados coletados em equilíbrio sugerem a presença de cooperatividade homotrópica positiva entre as subunidades do dímero, e a análise dos dados cinéticos sugere duas formas de enzima livre em solução como base para a cooperatividade. Diálise em equilíbrio foi empregada para caracterizar a ligação de acetoacetil-CoA à enzima, e os resultados indicam que não há cooperatividade na ligação deste substrato. Mecanismos cinético, químico e cooperativo para a reação catalisada pela -cetoacil-PCA redutase de M. tuberculosis são propostos com base nos dados aqui apresentados. / The -ketoacyl-ACP reductase enzyme catalyzes the NADPH-dependent reduction of -ketoacyl-ACP, the second step of type II fatty acid elongation system of bacteria, plants, and apicomplexan organisms. In the present work, acetoacetyl-CoA was utilized as substrate to kinetically characterize the reaction catalyzed by the enzyme of Mycobacterium tuberculosis, the etiogical agent of tuberculosis. The reaction kinetic mechanism was investigated by analyzing initial velocity and product inhibition patterns, and primary kinetic isotope effects, and the results point to a random steady-state mechanism. Primary, a-secondary, solvent, and multiple kinetic isotope effects, as well as pH and temperature studies, nuclear magnetic resonance, and pH variation of primary isotope effects were utilized to determine the reaction chemical mechanism, and analysis of the results suggests that hydride and proton transfer and substrate re-hybridization occur in a concerted fashion. Interaction between NADPH and enzyme was studied both in equilibrium and pre-steadystate conditions, by monitoring the enhancement in nucleotide fluorescence upon its binding to the enzyme. Data collected at equilibrium suggest the presence of positive homotropic cooperativity between subunits of the dimer, and analysis of kinetic data suggests two forms of free enzyme in solution as the basis for cooperativity. Equilibrium dialysis was employed to characterize the binding of acetoacetyl-CoA to the enzyme, and the results indicate there is no cooperativity in the binding of this substrate. Kinetic, chemical, and cooperaive mechanisms for the M. tuberculosis -ketoacyl-ACP reductasecatalyzed reaction are proposed on the basis of the data presented here.

Dentre todas as doenças infecciosas que têm afligido a raça humana, a tuberculose (TB) continua sendo uma das mais letais, resistindo às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. Atualmente, epidemiologistas estimam que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo da TB, com uma taxa anual de 8 a 10 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes. O aumento na prevalência da TB, a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas, e o efeito devastador da co-infecção pelo vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas e mais eficientes drogas anti-TB. Estas podem ser desenhadas baseadas em vias metabólicas essenciais ao patógeno e ausentes em seu hospedeiro; este é o caso da via de biossíntese de histidina, que está ausente em mamíferos e é comprovadamente essencial em micobactérias. Mais especificamente, demonstrou-se experimentalmente que o nocauteamento por recombinação homóloga do gene hisD de Mycobacterium tuberculosis, codificante da enzima L-histidinol desidrogenase (HisD), gerou mutantes auxotróficos para histidina completamente inviáveis, comprovando sua essencialidade para sobrevivência. Visto que as enzimas codificantes desta via podem representar alvos atrativos para o desenvolvimento de agentes anti-TB, o gene hisD de M. tuberculosis H37Rv foi amplificado, clonado e seqüenciado, e a proteína recombinante foi superexpressa na forma solúvel em Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados aqui apresentados validam hisD como o gene estrutural codificante da enzima HisD em M. tuberculosis, sendo um passo crucial em direção à purificação da proteína recombinante de forma a prover material para estudos estruturais e cinéticos, visando o desenho racional de novos agentes anti-TB. / Among all infectious diseases that have afflicted the human race, tuberculosis (TB) remains one of the deadliest, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. At present, epidemiologist estimate that one-third of the world population is infected by the tubercle bacilli, with an annual rate of 8 to 10 million new cases and 3 million deaths. The increasing prevalence of TB, the emergence of multidrug-resistant strains, and the devastating effect of the human immunodeficiency virus co-infection have led to an urgent need for the development of new and more efficient anti-TB drugs. They can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen and absent in its host; that is the case for the histidine biosynthetic pathway, which is absent in mammals and has been proved to be essential in mycobacteria. More precisely, experimental data has demonstrated that the disruption of Mycobacterium tuberculosis L-histidinol dehydrogenase hisD-encoding gene by homologous recombination resulted in unviable histidine auxotrophic mutants, proving its essentiality for survival. Since the coding enzymes of this pathway may represent attractive targets for the design of anti-TB agents, the hisD gene from M. tuberculosis H37Rv was amplified, cloned and sequenced, and the recombinant protein was superexpressed in the soluble form in Escherichia coli BL21(DE3). The results reported here validate hisD as the structural gene coding for histidinol dehydrogenase in M. tuberculosis, which is a crucial step towards purification of recombinant protein to provide material for structural and kinetic studies, aiming at the rational design of new anti-TB agents.

Tuberculose (TB) Multidroga resistente (MDR) é definida como a doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis) com resistência ao menos a isoniazida (INH) e rifampicina (RMP), sendo um crescente problema de saúde pública em todo o mundo. A escolha do tratamento da tuberculose multiresistente (MDR-TB) deveria ser baseada em testes de suscetibilidade as drogas. Estes métodos são laboriosos e demorados, sendo comum ter que aguardar até mais de quatro semanas para obtenção do resultado. Por esta razão, a maioria dos pacientes é orientado a realizar o tratamento sem um teste de susceptibilidade. A detecção precoce do bacilo, bem como a detecção de sua resistência, é crucial para um tratamento adequado, evitando a propagação de cepas resistentes na comunidade. Os métodos baseados em biologia molecular, apesar de rápidos, costumam requerer o uso de equipamentos de alto custo, como o, sequenciador ou GeneXpert MTB/RIF o que inviabiliza a sua utilização na rotina dos laboratórios públicos no Brasil. Por estas razões, objetivamos padronizar uma metodologia de hibridização molecular em membranas (LINE-TB/MDR) capaz de detectar as mutações mais frequentemente relacionadas com resistência a RMP e a INH em isolados de M. tuberculosis, as duas principais drogas utilizadas no tratamento da doença. Sondas gênicas com estas mutações, localizadas nos genes katG, rpoB e inhA , foram fixadas em membrana de náilon para hibridizar com o produto de um PCR multiplex, permitindo a detecção rápida das mutações. O método foi validado em um painel de referência de 108 amostras devidamente caracterizadas pelo teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA) e sequenciamento gênico. Quando comparado com o TSA a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo, para RMP foi 100% em todas as análises. Considerando a análise de resistência a INH, o teste obteve sensibilidade, especificidade, VPP e VPN de 77%, 100%, 100% e 82% respectivamente. Quando comparado com o sequenciamento a sensibilidade, especificidade, VPP e VPN para RMP foi de 100% para todas as análises. Para resistência a INH a sensibilidade especificidade PPV e NPV foi 94,3%, 100%, 100% e 94,8% respectivamente. O método desenvolvido poderá ser utilizado como uma alternativa para a identificação rápida de cepas multirresistentes, além de permitir a identificação do complexo M. tuberculosis. / Multidrug-resistant (MDR) tuberculosis (TB), defined as the disease caused by a Mycobacterium tuberculosis strain with resistance to at least isoniazid (INH) and rifampicin (RMP), is a growing public health and clinical problem worldwide. The choice of treatment of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is often based on drug susceptibility testing (DST). Drug susceptibility testing by conventional methods takes more than 4 weeks. An accurate and early detection of drug resistance in M. tuberculosis isolates is crucial for appropriate treatment, and to prevent the development of further resistance and the spread of resistant strains. Generally, DNA sequencing-based approaches are considered the reference assays for the detection of mutations, but often they have been found to be too cumbersome for routine use. For this reason, the aim of this study was to standardize a molecular hybridization method (LINE-TB/MDR) able to detect the most frequent mutations related to resistance to RMP and INH in M. tuberculosis isolates. Specific mutations found in the genes rpoB, katg and inhA have been reported as a marker for resistance to tuberculosis first line drugs. The assay was validated on a reference panel with 108 samples well-characterized by antimicrobial susceptibility testing (AST) and DNA sequencing. When compared to AST, the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of the LINE-TB/MDR, were 100% for all analyses. For INH resistance, the sensitivity, specificity, PPV and NPV were 77%, 100%, 100% and 82% respectively. When compared with sequencing, the sensitivity, specificity, PPV and NPV of the LINE-TB/MDR, for RMP resistance, were 100% for all analyses. For INH resistance the sensitivity, specificity, PPV and NPV were 94,3%, 100%, 100% and 94.8% respectively The developed assay could be used as an alternative for rapid identification of multi drug resistant (MDR) strains, and additionally, allowing the M. tuberculosis complex identification.