A S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por astrócitos e tem sido relacionada à interação neurônio-glia. Nosso primeiro objetivo foi investigar um possível efeito autócrino da S100B na captação de glutamato. A utilização do anticorpo anti-S100B reduziu a captação de glutamato após 30 minutos de incubação, sem afetar a integridade e viabilidade celular. Além disso, baixas concentrações de S100B (menos de 0,1 ng/mL) estimularam a captação de glutamato avaliada imediatamente após a troca de meio. Este dado reforça a importância dos astrócitos na transmissão glutamatérgica, particularmente, a função da S100B na neuroproteção contra dano excitotóxico. De fato, a S100B extracelular protege os neurônios quanto ao dano excitotóxico, enquanto concentrações tóxicas de glutamato têm demonstrado reduzir a secreção de S100B em astrócitos e fatias cerebrais, por mecanismos desconhecidos. Nosso segundo objetivo foi investigar os mecanismos possivelmente envolvidos neste efeito em cultura primária de astrócitos hipocampais utilizando agonistas glutamatérgicos e inibidores da captação de glutamato. Nossos resultados sugerem que a secreção de S100B está inversamente ligada à captação de glutamato. Além disso, a secreção da S100B parece ser estimulada por serotonina e estudos clínicos têm sugerido que a elevação da S100B está positivamente relacionada à resposta terapêutica dos antidepressivos, particularmente, os inibidores da recaptação da serotonina. Desta forma, nosso terceiro objetivo foi medir a secreção da S100B em culturas de astrócitos expostas à fluoxetina. Nós observamos um significativo aumento da secreção da S100B pela fluoxetina, efeito aparentemente dependente de PKA. Este dado reforça a importância da fluoxetina, independente da serotonina e receptores serotoninérgicos, para a atividade antidepressiva, bem como a função putativa da S100B nas doenças depressivas. Em paralelo, a padronização de uma técnica de ELISA para GFAP (a principal proteína marcadora de astrócitos), nós observamos que a fosforilação in vitro da GFAP purificada ou de amostras biológicas com PKA, indicam que a fosforilação aumenta o reconhecimento pelo anticorpo policlonal anti GFAP da DAKO. Estes resultados favorecem o entendimento de rápidas alterações na imunoreatividade da GFAP. / S100B is a calcium-binding protein expressed and secreted by astrocytes, which has been implicated in glial-neuronal communication. Our first aim was to investigate a possible autocrine role of S100B in glutamate uptake activity. Antibody anti-S100B addition decreased glutamate uptake measured 30 min after medium replacement, without affect cell integrity or viability. Moreover, low levels of S100B (less than 0.1 ng/mL) stimulated glutamate uptake measured immediately after medium replacement. This finding reinforces the importance of astrocytes in the glutamatergic transmission, particularly the role of S100B neuroprotection against excitotoxic damage. In fact, extracellular S100B protects hippocampal neurons from excitotoxic damage, whilst toxic levels of glutamate to neurons have been shown to reduce S100B secretion in astrocytes and brain slices, by unknown mechanisms. Our second aim was to investigate which mechanisms are possibly involved in this effect in primary cultures of hippocampal astrocytes using glutamate agonists and glutamate uptake inhibitors. Our findings suggest that S100B secretion is inversely coupled to glutamate uptake. Moreover, S100B secretion appears to be stimulated by serotonin and clinical studies have suggested that serum elevation of S100B is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors. Our third aim was to measure S100B secretion is astrocyte cultures exposed to fluoxetine. We observed a significant increment of S100B release by fluoxetine, apparently dependent on PKA. These data reinforce the importance of fluoxetine, independent of serotonin and serotonin receptors, for antidepressant activity, as well as the putative role of S100B in depressive disorders. In parallel, standardizing an ELISA for GFAP (the main protein marker for mature astrocytes) we found that in vitro phosphorylation of purified GFAP or biological samples with PKA indicate that GFAP phosphorylation improves the recognition by the polyclonal antibody anti-GFAP from DAKO. These results provide support to the understanding of fast changes in the GFAP-immunoreactivity.

O genoma das células eucarióticas é um dos principais alvos para danos induzidos por inúmeros fatores ambientes, sejam estes de origem biótica ou abiótica. Considerando a complexidade da molécula de DNA, não é supreendente que existam diferentes tipos de lesões com os mais variados graus de severidade. Dentre todas as lesões que podem ser induzidas no DNA, as pontes intercadeias (ICLs) estão entre as mais graves. Se não forem reparadas, a presença de apenas um ICL pode ser letal para a célula. Além disso, as lesões do tipo ICLs são quimicamente heterogêneas, podendo modificar a estrutura do DNA de forma permanente ou temporária. Os mecanismos relacionados à reparação de ICLs ainda são pouco conhecidos em eucariotos. Apesar de várias proteínas terem sido descritas como essenciais ao processo, não há um modelo único que explique esta reparação. Contudo, dentre as diferentes proteínas que participam na reparação de ICLs, destacam-se as nucleases Pso2/Snm1. A forma de atuação das proteínas Pso2/Snm1 não é conhecida, mas inúmeros dados obtidos com mutantes de Saccharomyces cerevisiae e, recentemente, com células de mamífero, mostram que a ausência de Pso2p/Snm1p bloqueia a restituição do DNA de alta massa molecular. Por outro lado, tem sido mostrado que o Pso2p/Snm1p provavelmente atua na manutenção da cromatina, mas de uma forma ainda não completamente esclarecida. Uma das proteínas pertencentes à família Pso2p/Snm1p, Ártemis, possui um papel importante no desenvolvimento do sistema imunológico adaptativo de metazoários e parece ser essencial para outros processos relacionados ao metabolismo de DNA eucariótico. Desta maneira, este trabalho teve como objetivo principal o estudo da família Pso2p/Snm1p por meio da análise filogenética e de seqüências, comparando-a com proteínas homólogas já descritas em outros organismos. Além disso, esta comparação XVII permitiu estabelecer uma correlação funcional entre as proteínas em termos de reparação de DNA e manutenção da cromatina eucariótica. As análises de filogenia e de seqüências claramente demonstraram que as proteínas Pso2/Snm1 podem ser agrupadas em quatro grupos principais ao invés de três, ao contrário do que se conhecia previamente. Três destes grupos, por sua vez, são formados por subgrupos específicos, que possivelmente atuam de forma diferenciada na reparação de DNA, na manutenção da cromatina e na geração de diversidade biológica. Por outro lado, os estudos das seqüências Pso2/Snm1, baseados principalmente na técnica de análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA), revelaram um alto grau de similaridade de estruturas primárias e secundárias entre os diferentes grupos, um indicativo da importância estrutural para a função destas proteínas no metabolismo de DNA. A técnica de HCA permitiu mapear regiões conservadas (CRs) em todas as seqüências estudadas, compondo o chamado domínio Pso2p/Snm1p. Em alguns casos, o domínio Pso2p/Snm1p encontra-se fusionado a outros domínios catalíticos. Neste caso, destaca-se o estudo de uma nova família de DNA ligases dependentes de ATP que são exclusivas de plantas. Esta nova família, denominada de Lig6p, parece ter funções importantes no metabolismo do DNA de plantas, sendo esta a primeira DNA ligase eucariótica com função nucleásica identificada. Usando os dados obtidos neste trabalho em conjunto com os resultados de outros autores, é sugerido um possível modo de atuação das proteínas Pso2p/Snm1p na reparação de danos do tipo ICL, na manutenção da cromatina e na geração de diversidade biológica.

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos. / A significant amount of plant proteins is compartmentalized in different cellular structures. The location of such proteins is essential to understand the function of biosynthetic and catabolic processes and also to help the identification of important genes. To identify the location of gene products related to resistance, rice (Oryza sativa) cDNAs were fused to a gene coding a GFP protein (green fluorescent protein). The cDNAs were obtained from a suppressive subtractive library of rice plants during an incompatible interaction with Magnaporthe grisea fungus. The cDNAs were fused to an enhanced version of gfp and they were used to transform 500 Arabidopsis thaliana plants, yielding 25.500 T1 seeds. Other 50 plants were transformed with the same vector, but without the EGFP::cDNA fusion (empty vector), yielding 35.000 T1 seeds. Seven hundred and fifty and 800 plants were generated from T1 seeds of the EGFP::cDNA fusions and empty vector transformations, respectively. Following herbicide selection, detached leaves were analyzed under a fluorescence microscope to evaluate the pattern of EGFP localization. It was observed that 18 plants transformed with EGFP:cDNA fusion and 16 plants transformed with empty vector showed detectable EGFP accumulation. One plant transformed with EGFP::cDNA showed a unique localization of the fluorescent signal. In this plant, the EGFP expression was predominantly visible at the stomata guard cells and trichomes. After, cDNA sequencing, the cDNA from this plant has shown insert similarity to kinase protein sequence, an enzyme class frequently related to signal transduction in response to pathogenic infections.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por astrócitos e tem sido relacionada à interação neurônio-glia. Nosso primeiro objetivo foi investigar um possível efeito autócrino da S100B na captação de glutamato. A utilização do anticorpo anti-S100B reduziu a captação de glutamato após 30 minutos de incubação, sem afetar a integridade e viabilidade celular. Além disso, baixas concentrações de S100B (menos de 0,1 ng/mL) estimularam a captação de glutamato avaliada imediatamente após a troca de meio. Este dado reforça a importância dos astrócitos na transmissão glutamatérgica, particularmente, a função da S100B na neuroproteção contra dano excitotóxico. De fato, a S100B extracelular protege os neurônios quanto ao dano excitotóxico, enquanto concentrações tóxicas de glutamato têm demonstrado reduzir a secreção de S100B em astrócitos e fatias cerebrais, por mecanismos desconhecidos. Nosso segundo objetivo foi investigar os mecanismos possivelmente envolvidos neste efeito em cultura primária de astrócitos hipocampais utilizando agonistas glutamatérgicos e inibidores da captação de glutamato. Nossos resultados sugerem que a secreção de S100B está inversamente ligada à captação de glutamato. Além disso, a secreção da S100B parece ser estimulada por serotonina e estudos clínicos têm sugerido que a elevação da S100B está positivamente relacionada à resposta terapêutica dos antidepressivos, particularmente, os inibidores da recaptação da serotonina. Desta forma, nosso terceiro objetivo foi medir a secreção da S100B em culturas de astrócitos expostas à fluoxetina. Nós observamos um significativo aumento da secreção da S100B pela fluoxetina, efeito aparentemente dependente de PKA. Este dado reforça a importância da fluoxetina, independente da serotonina e receptores serotoninérgicos, para a atividade antidepressiva, bem como a função putativa da S100B nas doenças depressivas. Em paralelo, a padronização de uma técnica de ELISA para GFAP (a principal proteína marcadora de astrócitos), nós observamos que a fosforilação in vitro da GFAP purificada ou de amostras biológicas com PKA, indicam que a fosforilação aumenta o reconhecimento pelo anticorpo policlonal anti GFAP da DAKO. Estes resultados favorecem o entendimento de rápidas alterações na imunoreatividade da GFAP. / S100B is a calcium-binding protein expressed and secreted by astrocytes, which has been implicated in glial-neuronal communication. Our first aim was to investigate a possible autocrine role of S100B in glutamate uptake activity. Antibody anti-S100B addition decreased glutamate uptake measured 30 min after medium replacement, without affect cell integrity or viability. Moreover, low levels of S100B (less than 0.1 ng/mL) stimulated glutamate uptake measured immediately after medium replacement. This finding reinforces the importance of astrocytes in the glutamatergic transmission, particularly the role of S100B neuroprotection against excitotoxic damage. In fact, extracellular S100B protects hippocampal neurons from excitotoxic damage, whilst toxic levels of glutamate to neurons have been shown to reduce S100B secretion in astrocytes and brain slices, by unknown mechanisms. Our second aim was to investigate which mechanisms are possibly involved in this effect in primary cultures of hippocampal astrocytes using glutamate agonists and glutamate uptake inhibitors. Our findings suggest that S100B secretion is inversely coupled to glutamate uptake. Moreover, S100B secretion appears to be stimulated by serotonin and clinical studies have suggested that serum elevation of S100B is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors. Our third aim was to measure S100B secretion is astrocyte cultures exposed to fluoxetine. We observed a significant increment of S100B release by fluoxetine, apparently dependent on PKA. These data reinforce the importance of fluoxetine, independent of serotonin and serotonin receptors, for antidepressant activity, as well as the putative role of S100B in depressive disorders. In parallel, standardizing an ELISA for GFAP (the main protein marker for mature astrocytes) we found that in vitro phosphorylation of purified GFAP or biological samples with PKA indicate that GFAP phosphorylation improves the recognition by the polyclonal antibody anti-GFAP from DAKO. These results provide support to the understanding of fast changes in the GFAP-immunoreactivity.

A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de mortalidade em todo o mundo por um único agente infeccioso. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), todos os anos cerca de 8 milhões de pessoas são infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e aproximadamente 2 milhões morrem em todo mundo. Desde a década de 80, o aumento da prevalência da TB em países em desenvolvimento, o aumento e a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas, a falta de recursos públicos adequados para o tratamento e a alta incidência de pacientes infectados pelo HIV, destacou a necessidade de desenvolver novos agentes antimicobacterianos. A via do ácido chiquímico ou chiquimato está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitas do filo apicomplexa. Esta via leva a biossíntese de corismato, um importante precursor metabólico de ácido fólico, menaquinonas, micobactinas e aminoácidos aromáticos. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina é catalizada pela corismato mutase e involve a conversão de corismato a prefenato. A segunda reação é catalisada pela prefenato desidratase que realiza a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato. As enzimas presentes na via do chiquimato e biossíntese de fenilalanina parecem ser essenciais ao M. tuberculosis, o que as torna promissoras como alvo para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O gene pheA que codifica a enzima prefenato desidratase (PDT) foi amplificado por PCR do DNA genômico, clonado em vetor pET23a(+) e superexpresso em células E.coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada por FPLC e a cristalização foi realizada pela técnica de difusão de vapor “hanging drop”. Os primeiros cristais apareceram sete dias após as gotas terem sido feitas. Cristais difrataram a 3.2 Å de resolução usando uma fonte de radiação síncrotron e pertencem ao grupo orthorrombico I222 ou I212121. Análise da estrutura por substituição molecular foi realizada, contudo os resultados não foram satisfatórios. Assim, outras ferramentas foram utilizadas para inferir a estrutura da PDT. A técnica de modelagem molecular foi usada para inferir a estrutura tridimensional da PDT. Dicroísmo circular e ferramentas de bioinformática mostraram resultados similares quanto à estrutura secundária, sendo formada por 33% de hélices alfas e 18% de fitas betas. Dessa maneira, técnicas de espalhamento de raios X a baixo ângulo somado com ultracentrifugação analítica mostraram que o estado oligomérico da PDT é um homotetrâmero e com forma de um disco achatado. Dinâmica molecular demonstrou que o modelo predito é estável durante uma trajetória de 6ns. Dados experimentais e ferramentas de bioinformática corroboram os resultados aqui apresentados, dando evidências da estrutura tetramérica da PDT em solução. Além disso, este é o primeiro relato da caracterização estrutural da PDT de M.tuberculosis. / Tuberculosis (TB) is one of the major causes of deaths worldwide from an infectious agent. According to the World Health Organization (WHO), every year 8 million people are infected by Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, and approximately 2 million people died in the world. Since 1980’s the increasing of prevalence of TB in developing countries, the emergence and proliferation of multidrug-resistant and extensively drug resistant strains, the lack of adequate public resources for treatment and the high incidence of HIV-infected populations have highlighted the need for developing new antimycobacterial agents. The shikimate pathway is present in mycobacteria and absent in algae, plants, fungi and parasite of the phylum apicomplexa. This pathway leads to the biosynthesis of chorismate, an important metabolic precursor of folic acid, menaquinones, mycobactinas and aromatic amino acids. The first reaction in phenylalanine biosynthesis is catalysed by chorismate mutase and involves the conversion of chorismate to prephenate. The second reaction is catalysed by prephenate dehydratase and involves the decarboxilation and dehydratation of prephenate to phenylpiruvate. The enzymes of this pathway seem to be essential to M. tuberculosis and can thus be used as targets for the development of new antimycobacterial drugs. The pheA gene that encodes to prephenate dehydratase (PDT) was amplified by PCR from genomic DNA, cloned in pET23a(+) and overexpressed in E. coli BL21(DE3). The recombinant protein was purified by FPLC, and crystallization was performed by the hanging drop vapor diffusion method. Crystals appear seven days after drops were done. The crystal diffracted at 3.2 Å resolution using a synchrotron radiation source and belong to the orthorhombic group I222 or I212121. Molecular replacement was used to solve the structure of PDT, but did not yield meaningful results. Other tools were used to infer the structural arrangement of PDT. Molecular modeling were used to infer the three dimensional structure of PDT. Circular dicroism and bioinformatics tools were in agreement in about secondary structure, showing 33% of -helix e 18% of beta sheet. Small Angle X-Ray scattering and analytical centrifugation showed that the oligomeric state of this protein is a homotetramer and the PDT is a flat disk protein. Molecular dynamics showed that this model is stable at a trajectory of 6ns. Experimental and bioinformatics tools were in agreement and provide evidence for a tetrameric structure of PDT at solution. Therefore, this is the first report of a structural characterization of PDT from M.tuberculosis.

A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de mortalidade em todo o mundo por um único agente infeccioso. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), todos os anos cerca de 8 milhões de pessoas são infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e aproximadamente 2 milhões morrem em todo mundo. Desde a década de 80, o aumento da prevalência da TB em países em desenvolvimento, o aumento e a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas, a falta de recursos públicos adequados para o tratamento e a alta incidência de pacientes infectados pelo HIV, destacou a necessidade de desenvolver novos agentes antimicobacterianos. A via do ácido chiquímico ou chiquimato está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitas do filo apicomplexa. Esta via leva a biossíntese de corismato, um importante precursor metabólico de ácido fólico, menaquinonas, micobactinas e aminoácidos aromáticos. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina é catalizada pela corismato mutase e involve a conversão de corismato a prefenato. A segunda reação é catalisada pela prefenato desidratase que realiza a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato. As enzimas presentes na via do chiquimato e biossíntese de fenilalanina parecem ser essenciais ao M. tuberculosis, o que as torna promissoras como alvo para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O gene pheA que codifica a enzima prefenato desidratase (PDT) foi amplificado por PCR do DNA genômico, clonado em vetor pET23a(+) e superexpresso em células E.coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada por FPLC e a cristalização foi realizada pela técnica de difusão de vapor “hanging drop”. Os primeiros cristais apareceram sete dias após as gotas terem sido feitas. Cristais difrataram a 3.2 Å de resolução usando uma fonte de radiação síncrotron e pertencem ao grupo orthorrombico I222 ou I212121. Análise da estrutura por substituição molecular foi realizada, contudo os resultados não foram satisfatórios. Assim, outras ferramentas foram utilizadas para inferir a estrutura da PDT. A técnica de modelagem molecular foi usada para inferir a estrutura tridimensional da PDT. Dicroísmo circular e ferramentas de bioinformática mostraram resultados similares quanto à estrutura secundária, sendo formada por 33% de hélices alfas e 18% de fitas betas. Dessa maneira, técnicas de espalhamento de raios X a baixo ângulo somado com ultracentrifugação analítica mostraram que o estado oligomérico da PDT é um homotetrâmero e com forma de um disco achatado. Dinâmica molecular demonstrou que o modelo predito é estável durante uma trajetória de 6ns. Dados experimentais e ferramentas de bioinformática corroboram os resultados aqui apresentados, dando evidências da estrutura tetramérica da PDT em solução. Além disso, este é o primeiro relato da caracterização estrutural da PDT de M.tuberculosis. / Tuberculosis (TB) is one of the major causes of deaths worldwide from an infectious agent. According to the World Health Organization (WHO), every year 8 million people are infected by Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, and approximately 2 million people died in the world. Since 1980’s the increasing of prevalence of TB in developing countries, the emergence and proliferation of multidrug-resistant and extensively drug resistant strains, the lack of adequate public resources for treatment and the high incidence of HIV-infected populations have highlighted the need for developing new antimycobacterial agents. The shikimate pathway is present in mycobacteria and absent in algae, plants, fungi and parasite of the phylum apicomplexa. This pathway leads to the biosynthesis of chorismate, an important metabolic precursor of folic acid, menaquinones, mycobactinas and aromatic amino acids. The first reaction in phenylalanine biosynthesis is catalysed by chorismate mutase and involves the conversion of chorismate to prephenate. The second reaction is catalysed by prephenate dehydratase and involves the decarboxilation and dehydratation of prephenate to phenylpiruvate. The enzymes of this pathway seem to be essential to M. tuberculosis and can thus be used as targets for the development of new antimycobacterial drugs. The pheA gene that encodes to prephenate dehydratase (PDT) was amplified by PCR from genomic DNA, cloned in pET23a(+) and overexpressed in E. coli BL21(DE3). The recombinant protein was purified by FPLC, and crystallization was performed by the hanging drop vapor diffusion method. Crystals appear seven days after drops were done. The crystal diffracted at 3.2 Å resolution using a synchrotron radiation source and belong to the orthorhombic group I222 or I212121. Molecular replacement was used to solve the structure of PDT, but did not yield meaningful results. Other tools were used to infer the structural arrangement of PDT. Molecular modeling were used to infer the three dimensional structure of PDT. Circular dicroism and bioinformatics tools were in agreement in about secondary structure, showing 33% of -helix e 18% of beta sheet. Small Angle X-Ray scattering and analytical centrifugation showed that the oligomeric state of this protein is a homotetramer and the PDT is a flat disk protein. Molecular dynamics showed that this model is stable at a trajectory of 6ns. Experimental and bioinformatics tools were in agreement and provide evidence for a tetrameric structure of PDT at solution. Therefore, this is the first report of a structural characterization of PDT from M.tuberculosis.

O genoma das células eucarióticas é um dos principais alvos para danos induzidos por inúmeros fatores ambientes, sejam estes de origem biótica ou abiótica. Considerando a complexidade da molécula de DNA, não é supreendente que existam diferentes tipos de lesões com os mais variados graus de severidade. Dentre todas as lesões que podem ser induzidas no DNA, as pontes intercadeias (ICLs) estão entre as mais graves. Se não forem reparadas, a presença de apenas um ICL pode ser letal para a célula. Além disso, as lesões do tipo ICLs são quimicamente heterogêneas, podendo modificar a estrutura do DNA de forma permanente ou temporária. Os mecanismos relacionados à reparação de ICLs ainda são pouco conhecidos em eucariotos. Apesar de várias proteínas terem sido descritas como essenciais ao processo, não há um modelo único que explique esta reparação. Contudo, dentre as diferentes proteínas que participam na reparação de ICLs, destacam-se as nucleases Pso2/Snm1. A forma de atuação das proteínas Pso2/Snm1 não é conhecida, mas inúmeros dados obtidos com mutantes de Saccharomyces cerevisiae e, recentemente, com células de mamífero, mostram que a ausência de Pso2p/Snm1p bloqueia a restituição do DNA de alta massa molecular. Por outro lado, tem sido mostrado que o Pso2p/Snm1p provavelmente atua na manutenção da cromatina, mas de uma forma ainda não completamente esclarecida. Uma das proteínas pertencentes à família Pso2p/Snm1p, Ártemis, possui um papel importante no desenvolvimento do sistema imunológico adaptativo de metazoários e parece ser essencial para outros processos relacionados ao metabolismo de DNA eucariótico. Desta maneira, este trabalho teve como objetivo principal o estudo da família Pso2p/Snm1p por meio da análise filogenética e de seqüências, comparando-a com proteínas homólogas já descritas em outros organismos. Além disso, esta comparação XVII permitiu estabelecer uma correlação funcional entre as proteínas em termos de reparação de DNA e manutenção da cromatina eucariótica. As análises de filogenia e de seqüências claramente demonstraram que as proteínas Pso2/Snm1 podem ser agrupadas em quatro grupos principais ao invés de três, ao contrário do que se conhecia previamente. Três destes grupos, por sua vez, são formados por subgrupos específicos, que possivelmente atuam de forma diferenciada na reparação de DNA, na manutenção da cromatina e na geração de diversidade biológica. Por outro lado, os estudos das seqüências Pso2/Snm1, baseados principalmente na técnica de análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA), revelaram um alto grau de similaridade de estruturas primárias e secundárias entre os diferentes grupos, um indicativo da importância estrutural para a função destas proteínas no metabolismo de DNA. A técnica de HCA permitiu mapear regiões conservadas (CRs) em todas as seqüências estudadas, compondo o chamado domínio Pso2p/Snm1p. Em alguns casos, o domínio Pso2p/Snm1p encontra-se fusionado a outros domínios catalíticos. Neste caso, destaca-se o estudo de uma nova família de DNA ligases dependentes de ATP que são exclusivas de plantas. Esta nova família, denominada de Lig6p, parece ter funções importantes no metabolismo do DNA de plantas, sendo esta a primeira DNA ligase eucariótica com função nucleásica identificada. Usando os dados obtidos neste trabalho em conjunto com os resultados de outros autores, é sugerido um possível modo de atuação das proteínas Pso2p/Snm1p na reparação de danos do tipo ICL, na manutenção da cromatina e na geração de diversidade biológica.

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos. / A significant amount of plant proteins is compartmentalized in different cellular structures. The location of such proteins is essential to understand the function of biosynthetic and catabolic processes and also to help the identification of important genes. To identify the location of gene products related to resistance, rice (Oryza sativa) cDNAs were fused to a gene coding a GFP protein (green fluorescent protein). The cDNAs were obtained from a suppressive subtractive library of rice plants during an incompatible interaction with Magnaporthe grisea fungus. The cDNAs were fused to an enhanced version of gfp and they were used to transform 500 Arabidopsis thaliana plants, yielding 25.500 T1 seeds. Other 50 plants were transformed with the same vector, but without the EGFP::cDNA fusion (empty vector), yielding 35.000 T1 seeds. Seven hundred and fifty and 800 plants were generated from T1 seeds of the EGFP::cDNA fusions and empty vector transformations, respectively. Following herbicide selection, detached leaves were analyzed under a fluorescence microscope to evaluate the pattern of EGFP localization. It was observed that 18 plants transformed with EGFP:cDNA fusion and 16 plants transformed with empty vector showed detectable EGFP accumulation. One plant transformed with EGFP::cDNA showed a unique localization of the fluorescent signal. In this plant, the EGFP expression was predominantly visible at the stomata guard cells and trichomes. After, cDNA sequencing, the cDNA from this plant has shown insert similarity to kinase protein sequence, an enzyme class frequently related to signal transduction in response to pathogenic infections.

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos. / A significant amount of plant proteins is compartmentalized in different cellular structures. The location of such proteins is essential to understand the function of biosynthetic and catabolic processes and also to help the identification of important genes. To identify the location of gene products related to resistance, rice (Oryza sativa) cDNAs were fused to a gene coding a GFP protein (green fluorescent protein). The cDNAs were obtained from a suppressive subtractive library of rice plants during an incompatible interaction with Magnaporthe grisea fungus. The cDNAs were fused to an enhanced version of gfp and they were used to transform 500 Arabidopsis thaliana plants, yielding 25.500 T1 seeds. Other 50 plants were transformed with the same vector, but without the EGFP::cDNA fusion (empty vector), yielding 35.000 T1 seeds. Seven hundred and fifty and 800 plants were generated from T1 seeds of the EGFP::cDNA fusions and empty vector transformations, respectively. Following herbicide selection, detached leaves were analyzed under a fluorescence microscope to evaluate the pattern of EGFP localization. It was observed that 18 plants transformed with EGFP:cDNA fusion and 16 plants transformed with empty vector showed detectable EGFP accumulation. One plant transformed with EGFP::cDNA showed a unique localization of the fluorescent signal. In this plant, the EGFP expression was predominantly visible at the stomata guard cells and trichomes. After, cDNA sequencing, the cDNA from this plant has shown insert similarity to kinase protein sequence, an enzyme class frequently related to signal transduction in response to pathogenic infections.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por astrócitos e tem sido relacionada à interação neurônio-glia. Nosso primeiro objetivo foi investigar um possível efeito autócrino da S100B na captação de glutamato. A utilização do anticorpo anti-S100B reduziu a captação de glutamato após 30 minutos de incubação, sem afetar a integridade e viabilidade celular. Além disso, baixas concentrações de S100B (menos de 0,1 ng/mL) estimularam a captação de glutamato avaliada imediatamente após a troca de meio. Este dado reforça a importância dos astrócitos na transmissão glutamatérgica, particularmente, a função da S100B na neuroproteção contra dano excitotóxico. De fato, a S100B extracelular protege os neurônios quanto ao dano excitotóxico, enquanto concentrações tóxicas de glutamato têm demonstrado reduzir a secreção de S100B em astrócitos e fatias cerebrais, por mecanismos desconhecidos. Nosso segundo objetivo foi investigar os mecanismos possivelmente envolvidos neste efeito em cultura primária de astrócitos hipocampais utilizando agonistas glutamatérgicos e inibidores da captação de glutamato. Nossos resultados sugerem que a secreção de S100B está inversamente ligada à captação de glutamato. Além disso, a secreção da S100B parece ser estimulada por serotonina e estudos clínicos têm sugerido que a elevação da S100B está positivamente relacionada à resposta terapêutica dos antidepressivos, particularmente, os inibidores da recaptação da serotonina. Desta forma, nosso terceiro objetivo foi medir a secreção da S100B em culturas de astrócitos expostas à fluoxetina. Nós observamos um significativo aumento da secreção da S100B pela fluoxetina, efeito aparentemente dependente de PKA. Este dado reforça a importância da fluoxetina, independente da serotonina e receptores serotoninérgicos, para a atividade antidepressiva, bem como a função putativa da S100B nas doenças depressivas. Em paralelo, a padronização de uma técnica de ELISA para GFAP (a principal proteína marcadora de astrócitos), nós observamos que a fosforilação in vitro da GFAP purificada ou de amostras biológicas com PKA, indicam que a fosforilação aumenta o reconhecimento pelo anticorpo policlonal anti GFAP da DAKO. Estes resultados favorecem o entendimento de rápidas alterações na imunoreatividade da GFAP. / S100B is a calcium-binding protein expressed and secreted by astrocytes, which has been implicated in glial-neuronal communication. Our first aim was to investigate a possible autocrine role of S100B in glutamate uptake activity. Antibody anti-S100B addition decreased glutamate uptake measured 30 min after medium replacement, without affect cell integrity or viability. Moreover, low levels of S100B (less than 0.1 ng/mL) stimulated glutamate uptake measured immediately after medium replacement. This finding reinforces the importance of astrocytes in the glutamatergic transmission, particularly the role of S100B neuroprotection against excitotoxic damage. In fact, extracellular S100B protects hippocampal neurons from excitotoxic damage, whilst toxic levels of glutamate to neurons have been shown to reduce S100B secretion in astrocytes and brain slices, by unknown mechanisms. Our second aim was to investigate which mechanisms are possibly involved in this effect in primary cultures of hippocampal astrocytes using glutamate agonists and glutamate uptake inhibitors. Our findings suggest that S100B secretion is inversely coupled to glutamate uptake. Moreover, S100B secretion appears to be stimulated by serotonin and clinical studies have suggested that serum elevation of S100B is positively correlated with therapeutic antidepressant response, particularly selective serotonin reuptake inhibitors. Our third aim was to measure S100B secretion is astrocyte cultures exposed to fluoxetine. We observed a significant increment of S100B release by fluoxetine, apparently dependent on PKA. These data reinforce the importance of fluoxetine, independent of serotonin and serotonin receptors, for antidepressant activity, as well as the putative role of S100B in depressive disorders. In parallel, standardizing an ELISA for GFAP (the main protein marker for mature astrocytes) we found that in vitro phosphorylation of purified GFAP or biological samples with PKA indicate that GFAP phosphorylation improves the recognition by the polyclonal antibody anti-GFAP from DAKO. These results provide support to the understanding of fast changes in the GFAP-immunoreactivity.