Les myopathies héréditaires représentent un large groupe de pathologies neuromusculaires progressives affectant l’intégrité générale, structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique. Elles engendrent une myriade de symptômes, ternissant qualité de vie et autonomie, et pouvant même s’avérer mortelles. La pose d’un diagnostic juste peut être difficile, entravée notamment par une faible prévalence de certaines myopathies, l’importante hétérogénéité clinique existante, et le chevauchement symptomatique des diverses formes. Malgré les avancées récentes faites dans le domaine des techniques de séquençage qui contribuent grandement au dépistage, au moins 25% des individus atteints de myopathies demeurent sans diagnostic génétique. Suivant l’investigation clinique d’un patient (Z46) atteint d’une myopathie distale à apparition tardive, l’analyse par séquençage ARN (RNA-seq) a révélé un variant non-sens homozygote de signification inconnue (VUS) à la fin de l’exon 5 du gène MLIP. Les niveaux d’expression génique altérés de « Protéine musculaire interagissant avec LMNA » (MLIP) et son partenaire « Lamine de type A » (LMNA) ont poussé à approfondir l’investigation. Davantage d’altérations -omiques furent identifiées par les techniques de RT-PCR, qPCR et WB, renforçant l’effet pathogénique du variant. Consolidant tous les résultats, le séquençage de longues lectures (LRS) a révélé un mécanisme d’épissage alternatif compensatoire de MLIP, qui tend à contourner et minimiser la production de transcrits arborant l’exon 5 muté. La présente étude vise à : 1) apporter un diagnostic génétique définitif au patient Z46, posant le variant MLIP comme causatif de la myopathie distale; 2) démontrer le pouvoir diagnostique du RNA-seq dans la résolution de ce cas complexe par l’identification et l’élucidation du VUS; 3) témoigner de l’étendue de la caractérisation transcriptomique offerte par les longues lectures du LRS. Couplé à cela, la modélisation du variant pathogénique par CRISPR/Cas9 dans une lignée cellulaire de myoblastes humains immortalisés permettra l’évaluation des impacts morpho-fonctionnels; conférant un supplément d’informations relatives aux fonctions musculaires normales et pathologiques de MLIP, faiblement caractérisées jusqu’à présent. / Hereditary myopathies represent a large group of progressive neuromuscular disorders affecting the general, structural and functional integrity of skeletal muscle. They cause a myriad of symptoms, impairing quality of life and autonomy, and can even be fatal. Making an accurate diagnosis can be difficult, hampered in particular by the low prevalence of certain myopathies, the significant clinical heterogeneity that exists, and the symptomatic overlap of the various forms. Despite recent advances in sequencing techniques that greatly assist in screening, at least 25% of individuals with myopathies remain without a genetic diagnosis. Following the clinical investigation of a patient (Z46) with a late-onset distal myopathy, RNA-sequencing (RNA-seq) analysis revealed a homozygous nonsense variant of unknown significance (VUS) at the end of exon 5 of the MLIP gene. Altered gene expression levels of ‘’Muscular LMNA-Interacting Protein’’ (MLIP) and its partner ‘’A-type Lamin’’ (LMNA) prompted further investigation. More -omic alterations were identified by RT-PCR, qPCR and WB technics, reinforcing the pathogenic effect of the variant. Consolidating all results, Long-Read Sequencing (LRS) revealed a compensatory alternative splicing mechanism of MLIP, which tends to bypass and minimize the production of transcripts carrying the mutated exon 5. The present study aims to: 1) provide a formal genetic diagnosis for patient Z46, positing the MLIP variant as causative of the distal myopathy; 2) demonstrate the diagnostic power of RNA-seq in resolving this complex case through identification and elucidation of the VUS; 3) testify to the breadth of transcriptomic characterization afforded by the long reads of LRS. Coupled with this, CRISPR/Cas9 modeling of the pathogenic variant in an immortalized human myoblast cell line will allow assessment of morpho-functional impacts; conferring additional information related to the normal and pathological muscles functions of MLIP, poorly characterized thus far.

L’ingénierie du tissu musculaire squelettique vise à reconstituer in vitro un tissu fonctionnel aussi physiologique que possible dans le but de mieux comprendre la myogenèse, l’impact de mutations génétiques et tester des médicaments. Ces dernières années, différents modèles de tissus musculaires tridimensionnels ont été développés. Toutefois, l’utilisation prépondérante de cellules murines et la taille de ces modèles restreint leur pertinence pour les études de pathologies humaines et le criblage pharmacologique. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons donc développé différents modèles de tissus musculaires humains micrométriques pour répondre à ces limitations. Dans un premier temps, nous avons conçu et optimisé par microfabrication une plateforme caractérisée par la présence de microcanaux. Nous avons ainsi généré des tissus musculaires multicouches alignés présentant une organisation proche du muscle natif à partir de myoblastes murins immortalisés C2C12 puis de myoblastes humains immortalisés. Nous avons ainsi montré l’influence de la topographie et de la concentration cellulaire sur l’alignement des myotubes et la maturation du tissu musculaire. Dans un second temps, nous avons développé une plateforme constituée de micropuits contenant chacun deux micropiliers permettant d’analyser la contractilité des tissus. Des microtissus musculaires 3D standardisés ont ainsi été générés avec cette plateforme à partir de myoblastes murins, et de myoblastes C2C12 électroporés avec un gène muté ou non de la desmine. Par la suite, des microtissus ont été générés à partir de myoblastes humains. L’importance du choix de la matrice dans la formation des microtissus et les bénéfices d’une coculture de myoblastes et fibroblastes dans la stabilité des tissus ont ainsi été mis en évidence. La géométrie de micropiliers a aussi été optimisée afin de générer et comparer des microtissus composés de myoblastes isolés de patients sains et malades (dystrophie musculaire de Duchenne). Une preuve de concept démontrant la possibilité d’utiliser cette technologie pour tester des thérapies chimiques et géniques a été établie. Nous avons en effet suivi en temps réel les effets de l’inhibiteur de la kinase Rho-associée Y-27632 sur la contractilité des microtissus, ainsi que la transduction d’un gène rapporteur fluorescent modèle par les cellules composant les microtissus. Les résultats de ce travail de thèse démontrent le potentiel de cette technologie pour l’étude des processus fondamentaux de la myogenèse, l’évaluation des effets fonctionnels de mutations patient-spécifique et le criblage de thérapies chimiques et géniques. / Skeletal muscle tissue engineering aims to build functional and physiological tissues in vitro in order to better understand myogenesis, to investigate the impact of genetic mutations and to screen potential therapies. Over the past few years, bi- and tridimensional models of muscle tissue have been developed, but most of these models are based on the use of murine cells and require large amounts of cells, thus limiting their relevance to study pathologies of human muscles and drug screening assays. Here we aimed at developing different models of human muscle microtissues to address these issues. By using microfabrication techniques, we first engineered a microgrooved platform we used to generate aligned multilayered skeletal muscle tissues from murine C2C12 myoblasts and human immortalized myoblasts. We showed the impact of topography and cell density on the maturation and myotube alignment. We then fabricated a microdevice, consisting of microwells containing two micropillars allowing an easy access to the contractility of muscle tissues. We engineered microtissues from C2C12 and C2C12 myoblasts electroporated with a mutated gene of desmin, and showed some limitation of this technique of transduction. Finally, we generated microtissues from human myoblasts. We investigated the role of the extracellular matrix in the tissue formation and evidenced the benefits of coculturing myoblasts and fibroblasts on the stability of muscle microtissues. Furthermore, we optimized the geometry of the micropillars to engineer and compare microtissues composed of human myoblasts isolated from healthy and diseased (Duchenne muscular dystrophy) patients. A proof of concept of the potential of this technology for screening chemical and gene therapies was established. We were indeed able to analyze in real time the effects of the Rho-associated kinase-inhibitor Y-27632 on the tissue contractility, as well as the transduction of a model fluorescent reporter gene. Altogether, the results of this work demonstrate the potential of this technology to study fundamental muscle biology, examine functional effects of patient-specific mutations or screen chemical and gene therapies.

Cette thèse interdisciplinaire a été dédiée à la caractérisation des propriétés mécaniques de myoblastes (murins et humains) et de myotubes (murins) à l'aide de la microscopie à force atomique (AFM). En modifiant ou en inhibant la dynamique du cytosquelette (CSK) d’actine de ces cellules, nous avons pu montrer que ces propriétés mécaniques variaient. L’enregistrement de courbes de force indentation nous a permis de montrer que la présence de cellules adhérentes introduisait sur les leviers d’AFM un amortissement visqueux supplémentaire à celui d’une paroi solide, et que cet amortissement visqueux dépendait de sa vitesse d’approche et que celui-ci restait non négligeable pour les plus faibles vitesses (1μm/s). Nous avons observé que les propriétés mécaniques des précurseurs de muscles devenaient non linéaires (comportement plastiques) pour des grandes déformations (>1μm) et qu’elles dépendaient de l’état, du type de cellule et de leur environnement. En combinant des expériences d’AFM, des modèles visco-élastiques et des méthodes d'analyse multi-échelle basées sur la transformation en ondelettes, nous avons illustré la variabilité des réponses mécaniques de ces cellules (de visco-élastiques à visco-plastiques). À l'aide de courbes de force-indentation, de l’imagerie morpho-structurale (DIC, microscopie à fluorescence) et de traitements pharmacologiques, nous avons éclairé le rôle essentiel des processus actifs (dépendants de l’ATP) dans la mécanique de myoblastes, en discutant tout particulièrement ceux des moteurs moléculaires (myosine II) couplés aux filaments d’actine. En particulier, nous avons montré que les fibres de stress du cytosquelette d’actine situées autour du noyau pouvaient présenter des évènements de remodelage soudains (ruptures) et que ces ruptures étaient une mesure indirecte de l’aptitude de ces cellules à tendre leur CSK. Nous avons enfin montré qu’il était possible de généraliser cette approche à des cas cliniques humains, en l’occurrence des myoblastes primaires de porteurs sains et de patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne, ouvrant la voie à des études plus larges sur d’autres types cellulaires et pathologies. / This interdisciplinary thesis was dedicated to the atomic force microscopy (AFM) characterization of the mechanical properties of myoblasts (murine and human) and myotubes (murine). We reported that the mechanical properties of these cells were modified when their actin cytoskeleton (CSK) dynamics was inhibited or altered. Recording single AFM force indentation curves, we showed that adherent layers of myoblasts and myotubes introduced on the AFM cantilever an extra hydrodynamic drag as compared to a solid wall. This phenomenon was dependent on the cantilever scan speed and not negligible even at low scan velocities (1μm/s). We observed that the mechanical properties of the muscle precursor cells became non-linear (plastic behaviour) for large local deformations (>1μm) and that they varied depending on the state, type and environment of the cells. Combining AFM experiments, viscoelastic modeling and multi-scale analyzing methods based on the wavelet transform, we illustrated the variability of the mechanical responses of these cells (from viscoelastic to viscoplastic). Through AFM force indentation curves analysis, morpho-structural imaging (DIC, fluorescence microscopy) and pharmacological treatments, we enlightened the important role of active (ATP-dependent) processes in myoblast mechanics, focusing especially on those related to the molecular motors (myosin II) coupled to the actin filaments. In particular, we showed that the perinuclear actin stress fibers could exhibit some abrupt remodelling events (ruptures), which are characteristic of the ability of these cells to tense their CSK. Finally, we showed that this approach can be generalized to some human clinical cases, namely primary human myoblasts from healthy donors and patients affected by Duchenne muscular dystrophy, paving the way for broader studies on different cell types and diseases.