Tesis Magíster en Bioquímica, Área de Especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) es una coenzima con múltiples funciones. Participa en el metabolismo redox como molécula transportadora de electrones en procesos metabólicos, actúa como indicador del estado energético celular, y es también sustrato de numerosas enzimas implicadas en la desacetilación de reguladores transcripcionales y la movilización de Ca2+ intracelular, entre otros. Diversas investigaciones sugieren que la disminución de los niveles de NAD+ es un factor importante en la progresión de enfermedades cardiovasculares. En diferentes modelos de miocardiopatías se ha observado una disminución en la expresión de la enzima marcapaso de la síntesis de NAD+, Nampt. También se ha descrito que los niveles de NAD+ están disminuidos en condiciones de riesgo cardiovascular como son el envejecimiento, dislipidemia y diabetes mellitus tipo 2. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos de la disminución de NAD+ en el metabolismo y la capacidad adaptativa de los cardiomiocitos. Se utilizó el inhibidor de Nampt, FK866, para disminuir los niveles de NAD+ en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas. Se evaluó la viabilidad, el metabolismo mitocondrial y la respuesta adaptativa del cardiomiocito a estímulos de insulina, peróxido de hidrógeno (H2O2) y norepinefrina (NE). Los resultados mostraron que la disminución de NAD+ por FK866 redujo el metabolismo mitocondrial sin afectar la viabilidad de los cardiomiocitos. Además, disminuyó la fosforilación de Akt en respuesta a insulina, la sobrevida frente a H2O2 y previno el aumento del área celular y sarcomerización en respuesta a NE. Para evaluar la relación de causalidad entre la disminución de NAD+ y estos efectos, se rescataron los niveles de NAD+ mediante la administración de nicotinamida mononucleótido (NMN). Se observó la recuperación de los parámetros metabólicos y la sobrevida a H2O2, pero no se restableció la respuesta hipertrófica. En conclusión, este trabajo muestra que NAD+ es esencial para el metabolismo mitocondrial del cardiomiocito, y sugiere su participación en la vía de señalización de insulina y en la respuesta adaptativa a H2O2 y NE. / The nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is a coenzyme with multiple functions. In redox metabolism participates as an electron carrier in metabolic processes, is a cellular energetic status indicator and it is also substrate of many enzymes involved in transcription factor deacetylation and Ca2+ mobilization, among others. Several reports suggest that NAD+ levels are an important factor in cardiovascular diseases progression. In different cardiomyopathy models the expression of the NAD+ synthesis rate-limiting enzyme, Nampt is diminished. Also NAD+ levels are decreased in cardiovascular risk conditions such as aging, dyslipidemia and type 2 diabetes mellitus. The aim of this work was to determine the effects of NAD+ decrease on cardiomyocytes’ metabolism and adaptive capability. The Nampt inhibitor, FK866, was used to reduce NAD+ levels in primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes, and viability, mitochondrial metabolism, and cardiomyocytes adaptive response to insulin, hydrogen peroxide (H2O2) and norepinephrine (NE) stimuli were assessed. The results showed that the NAD+ reduction induced by FK866 decreased mitochondrial metabolism without affecting cardiomyocytes viability. Insulin-stimulated Akt phosphorylation and H2O2-survival were also diminished and cellular area increase and sarcomerization induced by NE was prevented. The causality between NAD+ decrease and those effects was assessed through NAD+ levels recovery by nicotinamide mononucleotide (NMN) administration. Both metabolism and H2O2-survival were reestablished, but not the hypertrophic response. In conclusion this work reveals that NAD+ is essential for cardiomyocyte mitochondrial metabolism, and suggest its participation on insulin signaling pathway and adaptive responses to H2O2 and NE. / Fondap; Fondecyt

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Los dinucleótidos de adenina nicotinamida (NAD(P)(H)) cumplen un rol fundamental como cofactores enzimáticos, principalmente en reacciones de oxido-reducción. Sus concentraciones intracelulares determinan el estado fisiológico celular, en especial la razón NAD(P)H/NAD(P)+, por lo que es necesario tener métodos que permitan una cuantificación confiable de estas moléculas. Los métodos in vitro e in vivo comúnmente utilizados no permiten determinar el estado redox intracelular con precisión dadas las dificultades analíticas que poseen. El diseño de Sensores Fluorescentes Codificados Genéticamente (GEFS, por su sigla en inglés) ayuda a superar esas dificultades, ya que, estos biosensores permiten la cuantificación in vivo y en tiempo real de moléculas específicas, sin dañar las células estudiadas. Estos sensores se diseñan a partir de la fusión de una proteína fluorescente permutada circularmente con un dominio sensor proteico capaz de generar un cambio conformacional en respuesta a la unión de un ligando específico. Utilizando esta estrategia, muchos GEFS han sido diseñados para la cuantificación in vivo de dinucleótidos. Entre los sensores de dinucleótidos publicados a la fecha de inicio de esta tesis, el sensor Peredox era el único GEFS capaz de detectar la razón NADH/NAD+ intracelular. Peredox utiliza como dominio sensor al represor transcripcional sensible al estado redox T-Rex del organismo Thermus aquaticus. Aunque T-Rex es capaz de unir tanto NADH como NAD+, sólo la unión del dinucleótido reducido induce un cambio conformacional de una forma abierta a una cerrada. Este fenómeno permite a Peredox detectar la razón NADH/NAD+. Usando Peredox y la información estructural de T-Rex como punto de partida, el objetivo de esta tesis fue estudiar los determinantes estructurales de especificidad de dinucleótido con el fin de avanzar hacia la generación de un GEFS capaz de detectar la razón NADPH/NADP+, del cual no hay sensores diseñados a la fecha. Para esto se utilizaron estrategias de Diseño Racional mediante aproximaciones in silico e in vitro. Se determinó experimentalmente que el loop β4-β5 de T-Rex contiene determinantes estructurales de la especificidad por dinucleótido. Mediante análisis de Potenciales Estadísticos, comparación de motivos de especificidad basados en homología y simulaciones de Dinámica Molecular, se determinó los residuos clave en la especificidad por NAD(H) y las mutaciones necesarias para obtener una variante NADPH preferente. Se evaluó el efecto de estas mutaciones en la especificidad por NAD(P)H a través de ensayos in vitro de fluorescencia, obteniéndose un sensor preferente por NADPH. Sin embargo, el sensor no presentó un mecanismo de unión mutuamente excluyente a NADPH y NADP+, condición sine qua non para que un sensor de cuenta de la razón NADPH/NADP+ / Nicotinamide adenine dinucleotides (NAD(P)(H)) play a fundamental role as enzymatic cofactors, mostly on oxidation-reduction reactions. The intracellular concentrations of these dinucleotides determine the cellular physiological state, especially the NAD(P)H/NAD(P)+ ratio, so it is necessary to have methods that allow a reliable quantification of these molecules. The in vitro and in vivo methods commonly used do not allow to determine the intracellular redox state with accuracy, given the analytical difficulties they show. The design of Genetically Encoded Fluorescent Sensors (GEFS) aids to overcome these difficulties, since they can perform real-time in vivo detection of specific molecules, without damaging the cells studied. These sensors are designed from the fusion of a circularly permuted fluorescent protein with a protein sensor domain capable of generating a conformational change in response to the binding of a specific ligand. Using this strategy, many GEFS have been designed for in vivo quantification of dinucleotides. Among the dinucleotide sensors published at the start date of this thesis, the sensor Peredox was the only GEFS capable of detecting intracellular NADH/NAD+ ratio. Peredox uses the redox-sensing transcriptional repressor T-Rex, from Thermus aquaticus, as a sensor domain. Although T-Rex is capable of binding both NADH and NAD+, only the binding of the reduced dinucleotide induces a conformational change from an open to a closed form. This phenomenon allows Peredox to detect the NADH/NAD+ ratio. Using Peredox and the structural information of T-Rex as a starting point, the goal of this thesis was the study of the structural determinants of dinucleotide specificity, with aim to achieve to a GEFS capable of detecting the NADPH/NADP+ ratio. There is no sensor designed for this parameter to date. To achieve this goal, we used Rational Design strategies, through in silico and in vivo aproximations. We determined experimentally that β4-β5 loop of T-Rex contains structural determinants of dinucleotide specificity. Through statistical potential analysis, homology-guided comparison of specificity motifs and Molecular Dynamics simulations, a triple mutant of T-Rex was proposed. The effect of these mutations on the specificity for NAD(P)H was evaluated through in vitro fluorescence assays, obtaining a Peredox variant with NADPH preference. However, the sensor did not show a mutually-exclusive binding fashion of NADPH and NADP+, a sine qua non condition for a sensor of the NADPH/NADP+ ratio / Fondecyt

Memoria para optar al título de Químico / Los electrodos modificados con nanotubos de carbono han recibido considerable interés debido a sus amplias propiedades estructurales, mecánicas, químicas y electrónicas. Entre estas propiedades se destacan la alta estabilidad química y térmica, buena conductividad y alta actividad electrocatalítica. Las propiedades electrocatalíticas que se destacan son la disminución de los sobrepotenciales y el incremento en la intensidad de los picos voltamétricos. Además, los nanotubos de carbono tienen la capacidad de encapsular compuestos por fisiadsorción en la nano estructura formada. Estas características permiten desarrollar nuevas metodologías en la modificación de la superficie de los nanotubos de carbono, con lo que se obtiene una mayor capacidad de detección electroquímica de diversas moléculas, por ejemplo, NADH. El NADH es el cofactor de un gran número de enzimas deshidrogenasa y desempeña un papel importante en la cadena de transferencia de electrones en sistemas biológicos. Muchas reacciones enzimáticas útiles para la fabricación de compuestos en la industria son dependientes de la reacción de este cofactor, pero requieren altos sobrepotenciales. Por este motivo muchos investigadores centran su atención en solucionar este problema a través del uso de electrodos modificados con diversas moléculas. En esta memoria de título se propone un procedimiento simple y rápido de modificación de los electrodos de carbono vítreo con nanotubos de carbono, basado en el encapsulamiento y modificación electroquímica de compuestos polinitrados como especies mediadoras para estudiar la electrocatálisis sobre NADH. Se estudiaron tres mediadores polinitrados; el ácido 3,5-dinitrobenzoico, el 1,3-dinitrobenceno y el 1,3,5-trinitrobenceno. Todos presentaron actividad electrocatalítica sobre el NADH. Además, se estudió la influencia de distintos factores en la actividad electrocatalítica, tales como el tiempo de inmersión de los electrodos modificados en solución de NADH, la variación de la concentración del mediador, el efecto de la concentración del NADH y el efecto de la velocidad de barrido. La principal ventaja de estos electrodos a diferencia de otros electrodos modificados con mediadores redox, es que la técnica de modificación propuesta consiste en un procedimiento sencillo por medio de la inmersión del electrodo con nanotubos de carbono en una disolución orgánica del nitrocompuesto, obteniendo electrodos modificados con compuestos poco solubles. Estos electrodos pueden ser utilizados en solución acuosa / Electrodes modified with carbon nanotubes had received considerable attention due to their many structural, mechanical, chemical and electrical properties. Among this many properties, high chemical and thermal stability, high conductivity and high electrocatalytic activity outstand. The most important electrocatalytic properties are lowering of overpotential and the increased voltammetric peaks. Additionally, nanotubes have the ability to encapsulate other compound by physisorption onto the nanostructure. These characteristics allow to develop novel methodologies on the modification the surface of the nanotubes, leading to a higher ability to detect electrochemically diverse molecules, for example, NADH. NADH is cofactor to a large number of dehydrogenase enzymes and plays an important role on the electron transfer chain on biological systems. Many enzymatic reactions with applications on the manufacturing industry rely on this cofactor, though they require high overpotential. Because of that researchers focus their attention on solving this problem though the use of electrodes modified with other molecules. This degree work proposes a simple and fast procedure for modifying glassy carbon electrode with carbon nanotubes multiwalled, based on the encapsulation and electrochemical modification of poli-nitrated compounds as mediator to study the electrocatalysis on NADH. Three poli-nitrated mediators were studied; 3,5-dinitrobenzoic acid, 1-3 dinitrobenzene and 1,3,5-trinitrobenzene. All of them shown electrocatalytic activity on NADH. Moreover, the influence of other factors on the level of activity were studied. These include immersion time of the modified electrodes on the NADH solution, concentration of the mediator, concentration of NADH and scan rate. The main advantage of these electrodes compared against other electrodes modified using redox mediators, is that the modification technique consists in a simple procedure based on the immersion of the electrode on a nitro compound solution, obtaining modified electrodes with compounds slightly soluble. These electrodes can be used in aqueous solution

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / 1.- RESUMEN Durante la generación de electricidad en sistemas de Celda de Combustible Microbiológicas (MFC, por su sigla en inglés), se han manipulado distintas vías metabólicas para generar un aumento en la bioelectricidad, debido a que los electrones necesarios para este proceso provienen del poder reductor generado dentro de la célula. Esto no solo se ha estudiado en cepas electrogénicas como lo son Geobacter o Shewanella, sino que también se han realizado estudios en Escherichia coli, la cual puede transferir electrones a un electrodo a través de un mediador. Estos últimos años, la investigación se ha centrado específicamente en la manipulación cofactores, principalmente el NADH. En estos casos, alteran tanto vías de consumo como de generación de este cofactor, pero evalúan principalmente la eficiencia de esta modificación en el voltaje, la corriente o en la potencia producida. Sin embargo, pocas veces consideran observar los factores intrínsecos de la bacteria que están produciendo estas mejoras. Debido a esto, en este trabajo se utilizó una MFC con distintas cepas de E. coli con el mediador rojo neutro para observar no solo los cambios en la generación de corriente, sino que también, el consumo de la fuente de carbono (glucosa en este caso), rendimiento, y flujo de electrones en estos cultivos electrogénicos. Esto ayudó a comprender en parte lo que puede estar pasando en el metabolismo bacteriano durante el proceso de generación de corriente. Las cepas utilizadas fueron la cepa de E.coli K-12 MG1655, la cepa NAD-G6PDH la cual presenta un cambio en la especificidad de cofactor de la enzima G6PDH (en la cepa silvestre utiliza NADP+ , en este caso utiliza NAD+), la cepa Δpgi (con la deleción del gen que codifica la enzima fosfogluco isomerasa) y la cepa Δpgi-NAD-G6PDH que posee las dos mutaciones mencionadas. Finalmente, el trabajo demostró que las cepas MG1655 y NAD-G6PDH, que presentan más NADH, generan mayor electricidad en el tiempo que las cepas que tienen la mutación Δpgi. No obstante, el flujo de los electrones de todas las cepas fue similar, ya que no se observaron diferencias significativas. Además, se observó que la cepa Δpgi podría poseer un mejor rendimiento de mmoles de electrones por mmoles de glucosa consumida que las otras cepas, ya que produce una corriente relativamente alta para la poca biomasa y el bajo consumo de glucosa. / During the electricity generation in Microbiological Fuel Cell (MFC) systems, different metabolic pathways have been manipulated to generate an increase in the bioelectricity since the electrons needed for this process come from the reducing power generated inside the cell. This has not only been studied in electrogenic strains such as Geobacter or Shewanella, but also studies have been carried out in Escherichia coli, which can transfer electrons to an electrode through a mediator. Over the last few years, the research has focused specifically on the manipulation of cofactors, mainly in NADH. In these cases, they alter both consumption and generation pathways of this cofactor, but they mainly evaluate the efficiency of this modification in the voltage, the current or the power produced. However, they rarely consider observing the intrinsic factors of the bacteria that are producing these improvements. Due to this, in this work we used an MFC with different strains of E. coli with the Neutral Red mediator to observe not only the changes in the current generation, but also the consumption of carbon source (glucose in this case), yields, and electron flux in these electrogenic cultures. This helped to partially understand what may be happening in the bacterial metabolism during the current generation process. The strains used in this work were E. coli strain K-12 MG1655, strain NAD-G6PDH, which shows a change in the specificity cofactor of the G6PDH enzyme (in the wild type strain uses NADP+, in this case uses NAD+), strain Δpgi (with a deletion of the gene encoding the phosphoglucose isomerase enzyme) and strain Δpgi-NAD-G6PDH that possesses the two mentioned mutations. Finally, the work demonstrated that the strains MG1655 and NAD-G6PDH that present more NADH generate higher current per time than the strains that have the Δpgi mutation. Nevertheless, the electrons flux of all the strains was similar, since no significant differences were observed. In addition, it was observed that the strain Δpgi could have a better yield of mmol of electrons per mmol of consumed glucose than the other strains, since it produces a relatively high current for the low biomass and the low glucose consumption / PAIFAC 2016. Fac Cs. (RC) y Proyecto ENL012/16.