La mort subite engendrée par des troubles du rythme cardiaque est souvent due à des anomalies de la repolarisation ventriculaire, qui peuvent être d’origine génétique. Dans la première partie de cette thèse nous avons caractérisé un nouveau modèle murin de syndrome du QT long congénital de type 3 associé à une cardiomyopathie: la souris Scn5a+/ΔQKP. Ce modèle récapitule les conséquences de la mutation équivalente humaine sur le gène SCN5A (delQKP 1507-1509) : la présence d’un intervalle QT prolongé, des troubles de la conduction, des tachycardies et fibrillations ventriculaires, associés à des altérations structurales cardiaques et une mort prématurée. La mutation induit une augmentation du courant sodique persistant, et des perturbations du cycle du calcium. Des inhibiteurs du courant sodique persistant raccourcissent l’intervalle QT, améliorent la conduction cardiaque et réduisent les troubles du rythme dans ce modèle. La seconde partie du travail a permis l’identification et la caractérisation des tout premiers variants rares sur le gène SLC8A1, codant pour l’échangeur Na+/Ca2+ sarcolemmique NCX1, induisant une pathologie chez l’Homme : un syndrome de repolarisation précoce associé à un raccourcissement de l’intervalle QTc. L’expression de ces variants génétiques en système de réexpression hétérologue montrent des pertes de fonction sévères du courant d’échange INCX et de la prise en charge du calcium par NCX1. Des défauts d’expression sarcolemmique de NCX1 expliquent ces pertes de fonction pour une partie des variants. La simulation in silico de ces pertes de fonction récapitule le phénotype observé chez les patients à l’ECG, via un raccourcissement de la phase de repolarisation du potentiel d’action ventriculaire. Ces deux projets mettent en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques chez les patients atteints de pathologies de la repolarisation ventriculaire. / Arrhythmias-induced cardiac sudden death is often due to ventricular repolarization abnormalities, which can be congenital. In the first part of this thesis, we have characterized a new murine model of congenital type 3 long QT syndrome associated with a cardiomyopathy: the Scn5a+/ΔQKP mouse. This model recapitulates the consequences of the equivalent human mutation in the SCN5A gene (delQKP 1507-1509): the presence of a prolonged QT interval, conduction disorders, tachycardias and ventricular fibrillations, associated with cardiac structural defects and premature mortality. The mutation induces an increase of the persistent sodium current and perturbations of calcium cycle. Pharmacological inhibitors of the persistent sodium current shorten QT interval, improve cardiac conduction and reduce arrhythmias in this model. The second part of the thesis has permitted the identification and the functional characterization of the very first rare variants in the SLC8A1 gene, which encodes the sarcolemmal Na+/Ca2+ exchanger NCX1, associated with a pathology in human: an early repolarization syndrome associated with shortened QT interval. The expression of these variants in heterologous expression systems shows severe losses of function of both the exchange current INCX and the NCX1-related calcium uptake. Defects in NCX1 sarcolemmal expression explain these losses of function for part of the variants. In silico simulation of these losses of function recapitulates the phenotype observed in patients’ ECGs, by shortening the repolarization phase of the ventricular action potential. These two projects reveal new therapeutic targets in patients with ventricular repolarization diseases.

Les canaux Na+ dépendants du potentiel (Nav) sont des régulateurs clefs de l’excitabilité cardiaque, et tout défaut de fonctionnement ou de régulation de ces canaux, dans le contexte de pathologies cardiaques héréditaires ou acquises, augmente le risque de développer des arythmies létales. En particulier, l’insuffisance cardiaque est associée à des défauts d’expression et/ou de fonctionnement des canaux Nav, bien que l’origine de ces altérations demeure largement débattue. Des analyses phosphoprotéomiques au laboratoire ont été entreprises afin d’identifier in situ les sites de phosphorylation de la protéine Nav1.5 et de ses protéines partenaires à partir de ventricules gauches de souris contrôles (souris Sham) ou insuffisantes cardiaques après constriction de l’aorte transverse (souris TAC). Ces analyses ont permis d’identifier 41 sites de phosphorylation sur le canal Nav1.5, ainsi que 9 sites sur sa protéine partenaire FGF13 (Fibroblast Growth Factor 13). Parmi ces sites, la sérine en position 671, seule ou en combinaison avec les sérines 664 ou 667, sont plus phosphorylées chez les souris TAC, comparées aux souris Sham. Ces nouveaux résultats ont permis de développer deux objectifs de thèse. Le premier objectif a consisté à caractériser les rôles de la phosphorylation des sites du canal Nav1.5, et en particulier des sérines 671, 664 et 667, dans la régulation de l’expression et/ou du fonctionnement des canaux Nav1.5 dans les cellules HEK293. Le deuxième objectif de thèse a été d’étudier les mécanismes de régulation du canal Nav1.5 cardiaque par la phosphorylation de sa protéine partenaire FGF13. L’ensemble de ces travaux a contribué à une meilleure compréhension de la régulation et du fonctionnement du canal Nav1.5 cardiaque dans des conditions basales et pathologiques. / Voltage-gated Na+ (Nav) channels are key determinants of myocardial excitability and defects in Nav channel functioning or regulation, in the context of inherited or acquired cardiac disease, increase the risk of life-threatening arrhythmias. In particularly, heart failure is associated with defects in expression or functioning of Nav channels, although the mechanisms of these alterations are still in debate. Phosphoproteomic analyses in the laboratory were undertaken to identify the phosphorylation sites of the Nav1.5 channel and associated proteins purified from left ventricles from control (sham) and failing (TAC, Transverse Aortic Constriction) mice. These analyses allowed the identification of 41 phosphorylation sites on the Nav1.5 protein and 9 sites on the FGF13 (Fibroblast Growth Factor 13) associated protein. Among these sites, the serine at position 671, alone or in combination with serines 664 or 667, are more phosphorylated in the TAC, compared with the Sham, ventricles. These results allowed us to develop two thesis objectives. The first objective consisted in characterizing the roles of Nav1.5 channel phosphorylation sites, and particularly of serines 671, 664 and 667, in regulating the expression and the functioning of Nav1.5 channels in HEK293 cells. The second objective was to characterize the regulation of Nav1.5 channels by the phosphorylation of the FGF13 associated protein. Altogether, this work contributed to better understanding the regulation and functioning of cardiac Nav1.5 channels in both health and disease.

In coordination with the New York City Medical Examiner's Office, we received the sequence of a mutated SCN5A gene that was found in a five-week-old girl who died in her sleep. SCN5A codes for the voltage-gated cardiac sodium channel alpha subunit (Nav1.5) and is responsible for the fast depolarization in phase zero of the cardiac action potential. The mutations that were present in the girl's SCN5A gene were a missense mutation, Q1832E, and a truncation mutation, R1944X. In order to gain an understanding of the conditions that led to the patient's death, we carried out a functional analysis on the mutant channels and measured how their properties differed from wild type Nav1.5 properties. For our functional analysis we carried out mutagenesis reactions to produce three experimental constructs in order to examine independent effects of Q1832E or R1944X, and to examine their interaction (mutant Nav1.5 that contains both Q1832E or R1944X; as was found in the genetic screen). These constructs were transfected into HEK 293 cells and studied using the patch clamp analysis using the whole cell configuration. Experiments were carried out to test the Nav1.5 current voltage relationships, the recovery from inactivation properties, and steady state inactivation properties. The data demonstrated that each of the three constructs resulted in a significantly reduced current density when compared to wild type Nav1.5 currents. The gating properties of the mutant channels were similar to those of wild type Nav1.5, though Nav1.5-R1944X did show a statistically significant slower recovery from inactivation than the wild type channel. Though more experimentation is needed to determine the mechanism behind the reduced current in the mutant channels, our data shows that each of the mutations is sufficient to produce a severely dysfunctional channel and this is likely the cause of the patient's death.

Le récepteur sigma-1 est une protéine chaperonne active dans des tissus lésés. Le récepteur sigma-1 est principalement exprimé dans le cerveau et joue un rôle neuroprotecteur dans l’ischémie ou les maladies neurodégénératives. Le récepteur sigma-1 est également exprimé dans des lignées cellulaires cancéreuses et des travaux récents suggèrent sa participation dans la prolifération et l’apoptose. Cependant, son rôle dans la carcinogenèse reste à découvrir. Les canaux ioniques sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques (rythme cardiaque, influx nerveux, …). Ces protéines membranaires émergent actuellement comme une nouvelle famille de cibles thérapeutiques dans les cancers. Au cours de ma thèse, j’ai montré que le récepteur sigma-1 régule l’activité du canal potassique voltage-dépendent hERG et du canal sodique voltage-dépendent Nav1.5 respectivement dans des cellules leucémiques et des cellules issues de cancer du sein. J’ai également montré que le récepteur sigma-1, à travers son action sur l’adressage du canal hERG, augmente l’invasivité des cellules leucémiques en favorisant leur interaction avec le microenvironnement tumoral. Ces résultats mettent en évidence le rôle du récepteur sigma-1 sur la plasticité électrique des cellules cancéreuses et suggèrent l’intérêt de cette protéine chaperonne comme cible thérapeutique potentielle pour limiter la progression tumorale. / The sigma-1 receptor is a chaperone protein active in damaged tissues. The sigma-1 receptor is mainly expressed into brain and have a neuroprotective role in ischemia and neurodegenerative diseases. The sigma-1 receptor is also expressed into cancer cell lines and recent investigations suggest its involvement into proliferation and apoptosis. However, its role in carcinogenesis remains to delineating. Ion channels are involved in numerous physiological processes (heart beating, nervous influx, …). These membrane proteins currently emerge as a new class of therapeutic targets in cancer. During my thesis, I observed that the sigma-1 receptor regulates voltage-dependent potassium channel hERG and voltage-dependent sodium channel Nav1.5 activities respectively into leukemic and breast cancer cell lines. I also demonstrated that the sigma-1 receptor, through its action on hERG channel, increases leukemia invasiveness by promoting interaction with tumor microenvironment. These results highlight the role of the sigma-1 receptor on cancer cell electrical plasticity and suggest this chaperone protein as a potential therapeutic target to limit tumor progression.

Le syndrome de Brugada (BrS) est une cardiopathie héréditaire à transmission autosomique dominante, se manifestant par une anomalie de l'ECG et un risque accru de mort subite. Les mutations retrouvées dans la sous-unité α du canal sodique cardiaque Nav1.5 chez certains patients entraînent un défaut d'adressage membranaire de ces canaux. Ceux-ci restent alors séquestrés dans des compartiments intracellulaires. L'étude de ces mutants se réduisant souvent à l'utilisation de traitements correcteurs, les mécanismes de rétention impliqués restent encore méconnus. L'objectif de ce travail est d'étudier des mutants Nav1.5 présentant un défaut d'adressage en tenant compte non seulement de l'hétérozygotie des patients BrS mais également de la présence de la sous unité régulatrice β1 prédominante dans le cœur. Des études fonctionnelles et biochimiques mettent en évidence un effet dominant négatif exercé par les mutants R1432G, L325R et S910L sur la densité de courant INa sauvage (WT). Cet effet nécessite la présence de la sous-unité β1 et passe par l'altération de l'adressage membranaire des formes WT. Ceci est la conséquence d'une interaction physique entre des sous-unités α mutantes et WT. D'autre part, les mutants étudiés présentent un profil de maturation lié aux N-glycosylations qui différent de celui des canaux WT. Nos données suggèrent que ces canaux peuvent emprunter (i) la voie classique d'adressage dans leur forme mature (ii) la voie dite non conventionnelle lorsqu'ils sont partiellement glycosylés. En conclusion, ces travaux mettent en évidence le rôle de la sous-unité β1 ainsi que l'implication des N-glycosylations dans la modulation de l'adressage des canaux Nav1.5 / Brugada syndrome (BrS) is an inherited autosomal dominant cardiac channelopathy characterized by abnormal ECG pattern and an increased risk of sudden cardiac death. Several mutations on the cardiac sodium channel Nav1.5 which are responsible for BrS lead to misfolded proteins that do not traffic properly to the plasma membrane and are instead retained in intracellular compartments. Although pharmacological rescue is commonly used to characterize misfolded mutants, underlying cellular retention mechanisms remain unclear. The aim of this work is to investigate trafficking defective Nav1.5 mutants considering BrS patient heterozygosity and the presence of the regulatory β1-subunit which is largely expressed in cardiac tissue. By combining electrophysiology and biochemical approaches, we show that three distinct mutants, R1432G, L325R and S910L, exert a strong dominant negative effect upon wild-type (WT) sodium current density. Our data indicate that this effect requires the presence of the β1-subunit and is mediated by disruption of membrane trafficking of WT channels. Co-immunoprecipitation experiments demonstrate a physical interaction between mutant and WT α-subunits occurring only when the β1-subunit was present. Furthermore, we investigate the maturation pattern of Na channels. Our data show distinct N-glycosylated states between WT and mutant channels, suggesting that Nav1.5 α-subunits traffic (i) via unconventional secretion pathway as a partially glycosylated product, (ii) through the classical secretory pathway for mature fully-glycosylated form. This work highlights that β1-subunit and N-linked glycosylation process play key roles in modulating Nav1.5 trafficki

Les mutations du gène SCN5A, codant la sous-unité ? du canal Na+ cardiaque Nav1.5, sont responsables d'arythmies cardiaques héréditaires. La pénétrance incomplète observée dans ces maladies suggère l'existence d'autres facteurs modulant le phénotype associé à ces mutations. Dans ce travail de thèse, nous avons caractérisé deux mutations identifiées dans SCN5A. Le mutant R104W, identifié chez un patient atteint du syndrome de Brugada, est retenu dans le réticulum endoplasmique (RE), dégradé par le protéasome et abolit le courant Na+. Co-exprimé avec le canal sauvage, R104W conduit à la rétention de celui-ci dans le RE, résultant en un effet dominant négatif sur les canaux sauvages. Nous avons démontré que ce nouveau mécanisme mettait en jeu une interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5. La mutation R1860Gfs*12 a été identifiée dans une famille présentant des arythmies auriculaires. Dans un système d'expression hétérologue, ce mutant induit à la fois une perte et un gain de fonction de Nav1.5. La modélisation informatique nous a permis de montrer que la perte de fonction était plus prononcée dans les cellules auriculaires que ventriculaires. De plus, nous avons montré que la présence de polymorphismes en amont du gène PITX2 dans cette famille pouvait expliquer la variabilité des phénotypes observés. En conclusion, l'interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5, les propriétés électriques différentes entre oreillette et ventricule et la présence de polymorphismes chez les patients porteurs de mutations SCN5A sont des facteurs importants dans l'interprétation des effets fonctionnels de ces mutations, contribuant à la variabilité phénotypique des canalopathies Na+. / Mutations in the SCN5A gene, which encodes the α-subunit of the cardiac sodium channel Nav1.5, are implicated in different inherited cardiac arrhythmias. The incomplete penetrance observed in these diseases suggests the existence of other factors modulating the phenotype of these mutations. In this thesis work, we characterized two mutations identified in SCN5A. The R104W mutant identified in a patient with Brugada syndrome is retained in the endoplasmic reticulum (ER), degraded by the proteasome and abolishes the sodium current. Co-expressed with wild type (WT) channels, R104W leads to WT channels ER retention, causing a dominant-negative effect. We demonstrated that interaction between Nav1.5 α-subunits is responsible for the retention and the dominant-negative effect. The R1860Gfs*12 mutation was identified in a family with atrial arrhythmias. In a heterologous system, this mutant induces both loss- and gain-of-function effects on Nav1.5. Computer-model simulation showed that the loss-of-function was more pronounced in atrial than in ventricular cells. In addition, we showed that the presence of polymorphisms upstream of the PITX2 gene could explain the observed phenotypic variability in this family. In conclusion, the interaction between the α-subunits of Nav1.5, the different electrical properties between atria and ventricles and the presence of polymorphisms in patients with SCN5A mutations, are important factors in the interpretation of the functional effects of these mutations, which could explain the phenotypic variability of sodium channelopathies.

Sodium ion (Na+) channels play an important role in excitable cells, as they are responsible for the initiation of action potentials. Understanding the electrical characteristics of sodium channels is essential in predicting their behavior under different physiological conditions. We investigated several Markov models for the human cardiac sodium channel (NaV1.5) to derive a minimal mathematical model that can describe the reported experimental data obtained using major voltage-clamp protocols. We obtained simulation results for current-voltage relationships, steady-state inactivation, the voltage dependence of normalized ion channel conductance; activation and deactivation, fast and slow inactivation and recovery from inactivation kinetics. Good agreement with the experimental data provides us with the mechanisms of the fast and slow inactivation of the human sodium channel and the coupling of its inactivation states to the closed and open states in the activation pathway.

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Le syndrome de Brugada (SBr) est une arythmie cardiaque héréditaire à pénétrance partielle. Cette pathologie est caractérisée par une élévation du segment ST dans les dérivations précordiales droites (V1 à V3) sur l'ECG et un risque important de mort subite et de syncope par fibrillation ventriculaire. Les mutations dans le gène SCN5A, qui code le canal sodique cardiaque Nav1.5, sont mises en cause dans 20% des cas. Le canal sodique cardiaque est responsable de l'initiation et de la propagation du potentiel d'action dans le myocarde. Ainsi, la perte de fonction de ce canal joue un rôle important dans le SBr. Ce travail permet de mieux comprendre les conséquences des mutations de la région N-terminale très conservée au cours de l'évolution, dans le SBr et le rôle de cette dernière dans la fonction du canal Nav1.5. Nous avons montré que certaine mutation de la région la région N-terminale mène à la rétention du canal mutant dans le réticulum endoplasmique précédant sa dégradation par le protéasome. En conséquence ces mutations semblent bien être responsables du SBr. Par ailleurs, cette région joue un rôle important dans la capacité d'ouverture du canal sodique cardiaque. Nous avons mis en évidence que la présence de canaux mutants peut altérer le transport à la membrane du canal sauvage menant à un effet dominant négatif. Mais aussi la capacité du canal non fonctionnel R878C-Nav1.5, qui est capable d'atteindre la membrane plasmique, à restaurer partiellement le courant sodique de mutants retenus dans des compartiments intracellulaires. Ce phénomène de transcomplémentation montre que les canaux sodiques sont capables de coopérer.

Les mutations du gène SCN5A, codant la sous-unité ? du canal Na+ cardiaque Nav1.5, sont responsables d'arythmies cardiaques héréditaires. La pénétrance incomplète observée dans ces maladies suggère l'existence d'autres facteurs modulant le phénotype associé à ces mutations. Dans ce travail de thèse, nous avons caractérisé deux mutations identifiées dans SCN5A. Le mutant R104W, identifié chez un patient atteint du syndrome de Brugada, est retenu dans le réticulum endoplasmique (RE), dégradé par le protéasome et abolit le courant Na+. Co-exprimé avec le canal sauvage, R104W conduit à la rétention de celui-ci dans le RE, résultant en un effet dominant négatif sur les canaux sauvages. Nous avons démontré que ce nouveau mécanisme mettait en jeu une interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5. La mutation R1860Gfs*12 a été identifiée dans une famille présentant des arythmies auriculaires. Dans un système d'expression hétérologue, ce mutant induit à la fois une perte et un gain de fonction de Nav1.5. La modélisation informatique nous a permis de montrer que la perte de fonction était plus prononcée dans les cellules auriculaires que ventriculaires. De plus, nous avons montré que la présence de polymorphismes en amont du gène PITX2 dans cette famille pouvait expliquer la variabilité des phénotypes observés. En conclusion, l'interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5, les propriétés électriques différentes entre oreillette et ventricule et la présence de polymorphismes chez les patients porteurs de mutations SCN5A sont des facteurs importants dans l'interprétation des effets fonctionnels de ces mutations, contribuant à la variabilité phénotypique des canalopathies Na+.