Saarbrücken, Univ., Diss., 2001. / Computerdatei im Fernzugriff.

La destruction du compartiment T CD4 induite par le VIH‐1 est essentiellement périphérique. Cependant, l’atteinte des précurseurs lymphocytaires T, pour laquelle existent des arguments, est encore mal connue. L’objectif de ce travail a été d’explorer le rôle de la protéine Nef, hors contexte d’infection virale, dans la différenciation lymphoïde. Nef, produite très tôt après l’infection par le VIH‐1, possède un rôle‐clé dans la pathogénie, comme en témoigne la reproduction, chez la souris transgénique pour Nef, d’une maladie proche de la maladie humaine. Dans les lymphocytes matures infectés, Nef module l’expression du récepteur CD4, des molécules du CMH de classe I et induit un état d’activation T. Nef interagit également avec de nombreux partenaires cellulaires impliqués dans des voies de signalisation cytokinique, de contrôle de l’apoptose et de l’ontogénie T. Au cours de ce travail, nous avons montré que l'expression de Nef en absence d'autres gènes viraux bloquait le potentiel T et NK des précurseurs hématopoïétiques humains par un mécanisme apoptotique indépendant des caspases et lié à une perturbation du potentiel mitochondrial. Grâce à l’utilisation du système de culture OP9‐DL1 permettant l’identification des premiers stades de différenciation des cellules T, nous avons montré que la génération de cellules T à partir de CD34+ est affectée à un stade CD3+CD5+CD1a+ qui a initié le réarrangement D‐J du TCRβ. Les stades suivant du développement T sont aussi affectés, en effet, une réduction quantitative du nombre de CD4 ISP et de DP CD4+CD8+ TCRαβ a été observée. Nef diminue aussi la génération de cellules NK CD56+ alors que la production de cellules B n’est pas affectée. Des analyses par dilution limite montrent une réduction significative de la fréquence des précurseurs T/NK parmi les cellules CD34+ exprimant Nef. Nous avons par ailleurs montré une augmentation de 15 à 25% de cellules apoptotiques dans les cellules exprimant Nef‐WT par rapport aux autres conditions. Cette apoptose n’est pas caspase dépendante et La voie Fas/Fas‐L ne semble pas entrer non plus en jeu. Nous avons par ailleurs pu déterminer que l’atteinte apoptotique des précurseurs passait par une déstabilisation mitochondriale, ceci grâce à un marquage DIOC6. L’ensemble des résultats regroupés dans de ce travail permet d’approfondir les connaissances des mécanismes d’interférence du VIH avec l’hématopoïèse et plus précisément des actions de Nef sur l’hématopoïèse humaine. / HIV-1 infection is characterized by a progressive loss of CD4 T cell leading to a severe immune deficiency. More than 20 years after the identification of HIV, the exact mechanisms by which HIV leads to the depletion of CD4 T cells are not completely understood and remain a matter of cntroversy. The purpose of this work has been to explore out of the viral context, the effect of the HIV-1 Nef protein on the T cell differentiation. The HIV-1Nef gene is essential for AIDS pathogenesis. HIV-1Nef protein is a 27‐kDa protein that is expressed early during cell infection. Nef increases viral replication in vivo and enhances viral infectivity. Nef interferes with the expression of crucial molecules at the surface of lymphocytes such as CD4, MHC class I and II, CD28, DC‐SIGN, and chemokine receptors. Nef also alters T-cell signaling pathways and immunological synapse formation. During this work, we found that Nef expression in hematopoietic precursors interfere by an apoptotic pathway in the differentiation of a T/NK progenitor. In order to study the differenciation, we used a recent model of murine stromal cells engineered to express the Notch ligand delta 1 (OP9‐DL1 system). This system allows the differentiation of hematopoietic progenitors to a DP CD4+CD8+ stage and led us to examine the effects of Nef expression on T‐cell development. For this, Nef was expressed in hematopoietic CD34+ precursors using lentiviral vectors. In this study, we demonstrate that HIV-1Nef expression in the absence of other viral genes hampers the T and NK cell potential of human hematopoietic progenitors. We show that the generation of T cells from CD34+ progenitors is affected at a CD3ε+CD5+CD1a+ precursor stage that has initiated a DJB rearrangement of the TCRB locus. Subsequent stages of T cell development were also affected with a quantitative reduction of CD4 ISP and DP CD4+CD8+ TCRαβ cells. Nef also decreased the generation of CD56+NK cells whereas B cell production was not affected. Limiting dilution analyses demonstrated a significant reduction in the frequency of T/NK progenitors among Nef‐expressing CD34+ cells. Collectively, these data indicate that Nef interferes with the differentiation of a primitive lymphoid precursor with a T/NK potential. This interference was caused by the triggering of an apoptotic pathway which triggered the mitochondrial depolarization. This study allows a better knowledge of the interference mechanisms used by HIV on the T cell hematopoïesis, more accurately on the effect of Nef on human T cell differentiation

Caractérisation de NEF-sp: une exoribonucléase 3'→ 5' spécifique du testicule. Les études biochimiques et génétiques ont révélé que de nombreuses protéines jouent un rôle important dans la voie des ARNpi (ARN interagissant avec Piwi). Néanmoins, certaines caractéristiques mécanistes ne sont pas encore complètement comprises. D’autre part, certaines protéines impliquées dans la voie des ARNpi pourraient ne pas encore être caractérisées. Lorsque ce projet a commencé, le traitement 3’ des ARNpi n'avait pas été complètement identifié. Par contre la directionnalité 3’ à 5’ avait été observée avec une dépendance au Mg2+. Toutefois, la protéine responsable du raccourcissement des ARNpi à leur longueur mature n'était toujours pas connue.NEF-sp devrait être une exo nucléase d'ARN avec une directionnalité de 3' à 5'. Sa prédiction de domaine a révélé que cela se compose d'un domaine de nucléase N-terminal et de deux motifs de reconnaissance d'ARN (RRM). NEF-sp est également prévue comme une nucléase spécifique aux testicules, mais son rôle biologique n'a pas été caractérisé auparavant. Ce projet s'est concentré sur une hypothèse initiale selon laquelle NEF-sp pourrait potentiellement agir comme une nucléase impliquée dans la voie des ARNpi.Globalement, nous avons démontré que NEF-sp humaine est une exoribonucléase avec une directionnalité 3'→ 5'qui est active sur les substrats de l'ARN simple brin. Cette protéine est exprimée exclusivement dans les testicules des souris. En plus, NEF-sp pourrait fonctionner dans le compartiment nucléaire. Notre analyse de la souris Nef-sp mutante n'a révélé aucun phénotype évident. Nous avons observé que les homozygotes des deux sexes sont viables et présentent une fertilité normale. De plus, NEF-sp ne semble pas jouer un rôle dans la voie des ARNpi. Il est possible que le recadrage du/des substrat(s) inconnu(s) ne soit pas important pour la viabilité et fertilité en raison de la compensation potentielle par d'autres nucléases. Néanmoins, notre étude fournit une caractérisation biochimique et génétique de l'exoribonucléase NEF-sp des mammifères. / Genetic and biochemical studies have identified more than twenty different proteins involved in the piRNA pathway. However, some mechanistic features are still not fully understood. When this project started, piRNAs 3' end trimming was not completely characterized. Trimming was observed before in BmN4 cells and an Mg2+-dependent 3′ to 5′ exonuclease was implicated in this process. However, the protein responsible for shortening piRNAs to their mature length was still not known.NEF-sp is predicted to be an RNA exonuclease with 3′ to 5′ directionality. This protein is composed by three domains: a nuclease domain at N-terminal and two RNA binding motifs at C-terminal. NEF-sp is also predicted to be a testis-specific nuclease, however its biological role was not previously characterized. This project was based on the hypothesis that NEF-sp could potentially act as a nuclease involved in the piRNA maturation.We examined the biochemical properties of the uncharacterized mammalian nuclease family member NEF-sp. We show that Nef-sp transcripts are detected exclusively in mouse testes. We demonstrate that hNEF-sp is a 3ʹ→5ʹ exoribonuclease that is active on ssRNA substrates and likely functions in the nucleolar compartment. Our own analysis of the Nef-sp mouse knock-out mutant revealed no obvious phenotype. We observed that homozygous animals of both sexes are viability and display normal fertility. NEF-sp does not seem to play a role in piRNA pathway. It is possible that precise trimming of the unknown substrate(s) may not be important for viability/fertility due to potential complementation by other nucleases. Nevertheless, our study provides a biochemical and genetic characterization of the mammalian NEF-sp exoribonuclease.

L’infection des cellules cibles par le Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1(VIH-1) suit une succession d’étapes finement régulées par de nombreux facteurs cellulaires et viraux. Mon travail de thèse a consisté à étudier certains aspects de cette régulation, en particulier la protéine virale Nef et son impact sur l’infectivité des virus, mais aussi la susceptibilité des cellules cibles à l’infection. Tout d’abord, nous nous sommes intéressés aux mécanismes selon lesquels Nef augmente l’infectivité virale. Pour cela, nous avons identifié les différences entre le protéome des virus sauvages et des virus dépourvus du gène nef (Δnef) grâce à deux méthodes protéomiques, laDIGE et l’iTRAQ. Nous avons pu mettre en évidence que les protéines Ezrine et EHD4 sont impliquées dans des processus qui rendent les virus sauvages plus infectieux que les virusΔnef. L’augmentation de l’infectivité virale par Nef dépend des glycoprotéines d’enveloppes avec lesquelles les particules virales sont pseudotypées. Dans le but d’identifier les bases moléculaires de ce mécanisme, nous avons généré des constructions chimériques entre des glycoprotéines d’enveloppes qui permettent (enveloppes permissives) ou ne permettent pas(enveloppes non permissives) au phénotype Nef de se manifester. Cette approche a permis démontrer que le domaine cytoplasmique de la protéine d’enveloppe est un des déterminants qui dictent l’acquisition du phénotype Nef. Mon travail s’est aussi axé sur le mécanisme de co-infection cellulaire par le VIH-1.Après co-incubation des cellules avec des virus VIH rapporteur GFP et DsRed, nos résultats ont montré que les événements de co-infection sont plus fréquents qu’attendus dans le cas d’une infection stochastique. Nous montrons que ce biais qui semble favoriser la co-infection et qui suggère l’hétérogénéité de la population cible en terme de susceptibilité à l’infection par le VIH-1 provient en fait d’une sous-estimation des fréquences de cellules infectées en raison d’un phénomène de latence post-intégrative. Ainsi, mes études ont permis de mieux comprendre les mécanismes permettant à Nef d’augmenter l’infectivité des particules virales ouvrant de nouvelles perspectives à ce sujet, de même qu’elles ont permis de mettre en évidence que la co-infection était bien un processus aléatoire mais qui permettait de révéler des cellules arborant un provirus silencieux. / Pas de résumé en anglais

Regensburg, Univ., Diss., 2008

La destruction du compartiment T CD4 induite par le VIH‐1 est essentiellement périphérique. Cependant, l'atteinte des précurseurs lymphocytaires T, pour laquelle existent des arguments, est encore mal connue. L'objectif de ce travail a été d'explorer le rôle de la protéine Nef, hors contexte d'infection virale, dans la différenciation lymphoïde. Nef, produite très tôt après l'infection par le VIH‐1, possède un rôle‐clé dans la pathogénie, comme en témoigne la reproduction, chez la souris transgénique pour Nef, d'une maladie proche de la maladie humaine. Dans les lymphocytes matures infectés, Nef module l'expression du récepteur CD4, des molécules du CMH de classe I et induit un état d'activation T. Nef interagit également avec de nombreux partenaires cellulaires impliqués dans des voies de signalisation cytokinique, de contrôle de l'apoptose et de l'ontogénie T. Au cours de ce travail, nous avons montré que l'expression de Nef en absence d'autres gènes viraux bloquait le potentiel T et NK des précurseurs hématopoïétiques humains par un mécanisme apoptotique indépendant des caspases et lié à une perturbation du potentiel mitochondrial. Grâce à l'utilisation du système de culture OP9‐DL1 permettant l'identification des premiers stades de différenciation des cellules T, nous avons montré que la génération de cellules T à partir de CD34+ est affectée à un stade CD3+CD5+CD1a+ qui a initié le réarrangement D‐J du TCRβ. Les stades suivant du développement T sont aussi affectés, en effet, une réduction quantitative du nombre de CD4 ISP et de DP CD4+CD8+ TCRαβ a été observée. Nef diminue aussi la génération de cellules NK CD56+ alors que la production de cellules B n'est pas affectée. Des analyses par dilution limite montrent une réduction significative de la fréquence des précurseurs T/NK parmi les cellules CD34+ exprimant Nef. Nous avons par ailleurs montré une augmentation de 15 à 25% de cellules apoptotiques dans les cellules exprimant Nef‐WT par rapport aux autres conditions. Cette apoptose n'est pas caspase dépendante et La voie Fas/Fas‐L ne semble pas entrer non plus en jeu. Nous avons par ailleurs pu déterminer que l'atteinte apoptotique des précurseurs passait par une déstabilisation mitochondriale, ceci grâce à un marquage DIOC6. L'ensemble des résultats regroupés dans de ce travail permet d'approfondir les connaissances des mécanismes d'interférence du VIH avec l'hématopoïèse et plus précisément des actions de Nef sur l'hématopoïèse humaine.

Ulm, Univ. Diss., 2006.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / HIV-1 infection is one of the greatest public health concerns today. The current HIV/AIDS therapy is effective in halting virus multiplication and has improved the outlook of AIDS; however, high cost, side effects, and the rise of drug-resistant viral strains have posed challenges for long-term treatment and management and mandate development of alternative anti-HIV therapies. Despite the fact that a great deal of progress has been made in our understanding of the infection over the last twenty-seven years, there are many unanswered basic scientific questions and no vaccines. In this study, we focused on two aspects related to the HIV-1 protein Nef: one is development of a Nef-based anti-HIV therapeutic strategy; the other is discovery of a novel mechanism that accounts for Nef-enhanced viral infectivity. We first devised an anti-HIV therapeutic strategy that took advantage of the high virion incorporation of the Nef mutant Nef7 to deliver anti-HIV factors to the virion. We performed a series of proof-of-concept experiments, using the host anti-HIV cellular factor APOBEC3G (A3G). The Nef7.A3G fusion protein retains important properties of Nef7: higher virion incorporation efficiency, lack of PAK2 activation, and reduced CD4 and MHC I downregulation, as well the anti-HIV infectivity function of A3G. Moreover, virus-like particle (VLP)-mediated delivery of Nef7.A3G into infected CD4+ T lymphocytes leads to inhibition of HIV-1 replication in these cells. These results support the use of Nef7 as an anti-HIV therapeutic strategy for the delivery of therapeutic proteins into HIV-1 virions. HIV-1 Nef protein has long been known to enhance viral infectivity. However, the underlying molecular mechanism remained elusive. Here we show that Nef is important for VS formation and VS-mediated virus transmission from cell to cell, especially in primary cells. Nef accomplishes this by inducing the clustering of VS components CD81 and ZAP70 and by inducing formation of actin protrusions, and these functions involve specific and distinct Nef domains. These findings not only yield new insights into the regulatory function of Nef in viral infectivity, but could also lead to development of more effective anti-HIV therapies that work equally well at blocking both VS-mediated and cell-free virus infection.

Submitted by Marlene Aparecida de Souza Cardozo (mcardozo@pucsp.br) on 2016-12-19T15:01:20Z No. of bitstreams: 1 Valdir de Volpato Fornel Junior.pdf: 1540016 bytes, checksum: 62e8a0b033d021090848b92953110606 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-19T15:01:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valdir de Volpato Fornel Junior.pdf: 1540016 bytes, checksum: 62e8a0b033d021090848b92953110606 (MD5) Previous issue date: 2016-03-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Notre recherche de master cible la circonscription de la « Métaphore de la Navigation » dans trois moments distincts du parcours philosophique de M. Foucault (1926-1984). Sans le prétentions de raconter une histoire de la métaphore de la navigation, notre étude balise les usages et les non-usages, les ressemblances et les différences, les personnages et les paysages utilisés par l’auteur à la mesure qu’il se sert de la métaphore. Nous remarquons trois occurences, passages, perspectives, dans lesquelles le penseur fait référence au thème nautique, des situations repérées dans de différentes décennies de sa production philosophique. Le premier passage du thème se trouve dans le premier chapitre, « Sultifera navis », de l’Histoire de la Folie (1961) ; la deuxième apparition se trouve dans les classes du 1er et 8 février 1978, l’année où il donne le cours intitulé Securité, Territoire, Population ; enfin, la troisième apparition que nous mettons en relief est dans l’ensemble des classes du 17 et du 24 février et du 10 mars 1982, du cours L’Hermeneutique du Sujet. Cependant que dans quelques autres moments Foucault s’utilise de la métaphore navale, le choix des textes mentionnés est justifié comme outils de recherche, tout d’abord par l’immensité de possibilités que les écrits de l’auteur nous dévoilent ; deuxièmement, nous remarquons le choix comme une représentation de ses respectives décennies de production ; dernièrement, cela nous indique un chemin qui démarre avec le premier grand livre de l’auteur jusqu’à ses derniers cours au Collège de France. Notre travail est divisé en deux parties : dans la première, nous présentons quelques fragments du parcours philosophique de Foucault, tandis que dans la deuxième partie nous abordons le vaisseau et la folie ; le vaisseau et le pouvoir ; le vaisseau et l’éthique / A nossa pesquisa de mestrado tem como objetivo circunscrever a “Metáfora da Navegação” em três momentos distintos da trajetória filosófica de Michel Foucault (1926-1984). Sem pretensões de contar uma história da metáfora da navegação, o nosso estudo baliza os usos e desusos, as semelhanças e dessemelhanças, os personagens e paisagens que utiliza o autor à medida que se serve da metáfora. Destacamos três ocorrências, passagens, perspectivas, nas quais o pensador refere-se ao tema náutico, situações que localizamos em diferentes décadas de sua produção filosófica. A primeira passagem do tema encontra-se no primeiro capítulo, “Stultifera navis”, de História da Loucura (1961); a segunda aparição localiza-se nas aulas de 1º e 8 de fevereiro de 1978, ano em que ministra o curso intitulado Segurança, Território, População ; por fim, a terceira aparição que realçamos está no conjunto das aulas de 17 e 24 de fevereiro e 10 de março de 1982, do curso A Hermenêutica do Sujeito. Embora em alguns outros momentos Foucault também faça uso da metáfora naval, justifica-se a escolha dos textos mencionados como ferramenta de pesquisa, primeiro pela imensidão de possibilidades que os escritos do autor nos revelam; segundo, destacamos a escolha como representação de suas respectivas décadas de produção; por último, indicam-nos um caminho que se inicia com o primeiro grande livro do autor até o s seus últimos cursos no Collège de France. Nosso trabalho está divido em duas partes: na primeira apresentamos alguns fragmentos da trajetória filosófica de Foucault, já na segunda parte abordamos o navio e a loucura; o navio e o poder; o navio e a ética

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.