El glioblastoma multiforme és una de les neoplàsies més agressives de l’adult, malgrat els esforços realitzats en millorar el seu tractament, la supervivència dels pacients continua sent dolenta. L’objectiu global d’aquesta tesi ha estat l’estudi dels mecanismes moleculars implicats en la inducció de mort, parada de cicle pels inhibidors de MDM2 i els inhibidors de survivina en el glioblastoma multiforme humà, a més ha permès l’establiment de cultius primaris de glioblastoma humà. L’efecte dels compostos s’ha estudiat ex vivo en els cultius primaris i línies cel•lulars de glioblastoma multiforme humà. Les Nutlines són antagonistes de MDM2 que actuen, amb una gran especificitat, desplaçant la unió de la proteïna p53 del seu inhibidor MDM2 a un rang de dosi nanomolar, el qual comporta l’estabilització de la molècula de p53 i la posterior activació de la seva via de senyalització. Els resultats del tractament de cultius primaris i línies cel•lulars de glioblastoma demostren que la Nultina-3a és capaç de induir parada de cicle cel•lular (p21), apoptosi (Noxa i Puma), a més de induir senescència (marcatge amb SA-βGal) en aquelles cèl•lules amb un p53 funcional. Per el contrari, les línies cel•lulars i cultius primaris amb un p53 no funcional, són resistents al tractament degut a l’incapacitat de aquestes cèl•lules per activar la via de p53. El pretractament amb Nutlina-3a sensibilitza la línia cel•lular U87-MG enfront la radioteràpia. Això suggereix que la utilització de inhibidors de MDM2 podria ser una nova estratègia terapèutica, ja sigui de forma individual o combinada amb radioteràpia en el tractament de pacients amb glioblastoma multiforme amb una proteïna p53 funcional. YM155 (1-(2-metoxietil)-2-metil-4,9-dioxo-3-(piracina-2 ymetil)-4,9-dihidro-1H-nafto[2,3-d ]bromuro de imidazolium), és una petita molècula inhibidora de la proteïna antiapoptòtica Survivina. YM155 va ser seleccionat mitjançant un cribratge d’alt rendiment com supressor específic de l'expressió de survivina per inhibició del seu promotor. La survivina es troba sobreexpressada en la majoria dels tumors. La survivina es troba altament expressada en gliomes a més està associada amb una menor supervivència i amb un augment de la recurrència tumoral. En aquest apartat de la tesi es va estudiar l’efecte de YM155 en línies cel•lulars i un cultiu primari de glioblastoma humà. Els resultats obtinguts mostren que el tractament amb YM155 provoca una disminució de la viabilitat cel•lular, així com inducció d’apoptosi, que s’acompanya d’una disminució dels nivells proteics de survivina en totes les línies cel•lulars de glioma avaluades. La incubació de les línies cel•lulars i del cultius primari mostra canvis en el patró de cicle cel•lular, provocant aturada tant en fase G0/G1 o en fase S depenent de la línia cel•lular avaluada. El pretractament amb YM155 abans de la radioteràpia indueix un augment en el nombre de focus de γ-H2AX. Els resultats de aquest apartat de la tesis suggereixen que la inhibició de la Survivina podria ser una nova eina terapèutica que permetria augmentar la sensibilitat a la radioteràpia en pacients amb glioblastoma multiforme. / Glioblastoma multiforme is the most common and aggressive primary brain tumor in adults, despite efforts to improve their treatment, patients survival remains poor. The purpose of this thesis is the study of molecular mechanism involved in the induction of apoptosis, cells cycle arrest as a consequence of the treatment with MDM2 and Survivin inhibitors in human glioblatoma multiforme. This effect has been studied ex vivo in glioma cell lines and primary cultured glioblastoma. Nutlins small-molecule antagonist of MDM2, have been developed to inhibit p53-MDM2 interaction and activate p53 signaling in cancer cells. Nutlin-3a can induce cell cycle arrest (p21), apoptosi (PUMA and Noxa) in those cells with a functional p53 protein. In addiction Nutlin can induce cellular senescence (SA-βGal). In primary cultures and cells lines with a mutated p53 protein, Nutlin-3a fails to induce apoptosis and cell cycle arrest. Moreover Nutlin-3a pre-treatment in U87 cells sensitizes to radiotherapy. YM155 is a small molecule inhibitor of antiapoptotic protein survivin. Survivin is overexpressed in glioma and is associated with decreased survival and increases tumor recurrence. YM155 treatment induces a decrease in cell viability, as well as an apoptosis induction. This is accompanied by a decreased in survivin protein levels in all glioma cell lines tested. Glioma cell line and primary culture incubation show changes in the cell cycle pattern, causing arrest either in G0/G1 or S depending of the cell line tested.

El linfoma difuso de células grandes (LDCGB) es la neoplasia linfoide agresiva más frecuente en el mundo occidental. Sin embargo, es una entidad nosológica heterogénea de difícil caracterización por técnicas convencionales. Por otro lado, desde los años ochenta sabemos que es una enfermedad con potencial curativo. La introducción de la inmunoquimioterapia con rituximab (IQTR) ha supuesto el mayor avance en el tratamiento de este tipo de linfoma, incrementando las tasas de remisión y de forma más importante la supervivencia de los pacientes. No obstante, un 25-30% de los pacientes serán refractarios al tratamiento o recaerán. En este grupo de pacientes es prioritaria la identificación de factores pronósticos clínicos y biológicos que permitan caracterizar grupos de riesgo y establecer posibles dianas terapéuticas. Esta tesis doctoral ha permitido profundizar un poco más en la caracterización biológica, clínica y pronostica del LDCGB. El primer trabajo ha contribuido a estudiar los LDCGB de origen primario extraganglionar como una variante particular con características diferentes de las formas ganglionares. Así estos pacientes presentan con mayor frecuencia características pronosticas favorables al diagnóstico (estadio temprano, niveles séricos bajos de LDH, e IPI de bajo riesgo), así como en la evolución (tasa de RC, SLP y SG superior). La segunda contribución del primer trabajo yace en cuestionar el papel de la inmunoquimioterapia en el tratamiento de los LDCGB extraganglionares. En esta entidad, quizás por las características iniciales de buen pronóstico, no observamos un incremento significativo de la supervivencia en aquellos pacientes tratados con IQTR. Ello podría suponer una ausencia de beneficio en estos pacientes, o simplemente que el número de pacientes para las diferentes localizaciones extraganglionares no es suficiente para detectar las diferencias que existen. En el segundo trabajo hemos estudiado la reproducibilidad de la caracterización molecular del LDCGB mediante técnicas de inmunohistoquímica. En la actualidad, los estudios de expresión genotípica (GEP) han permitido dividir al LDCGB en dos subgrupos centrogerminal (CGB) y activado (ABC) con impacto en el pronóstico, teniendo este último una menor supervivencia. Sin embargo, estas técnicas no son aplicables a la práctica clínica habitual dada su complejidad y elevado coste. Por ello, se han realizado intentos de remedar esta información utilizando diferentes algoritmos inmunohistoquímicos (Hans, Colomo, Muris, Choi y Tally) basados en la información extraída de los GEP. Estos algoritmos han establecido dos grupos inmunofenotípicos centrogerminal (CGB) y no-CGB. Sin embargo, nuestros resultados cuestionan el valor de los estudios de inmunohistoquímica como remedo de los perfiles de expresión genotípica. Aunque se encontró una correlación significativa entre los GEP y los diferentes algoritmos inmunohistoquímicos los valores predictivo negativo y positivo fueron relativamente bajos para los cinco algoritmos utilizados. De hecho, 30-50% de los LDCGB de origen CGB y 15-25% de los ABC fueron incorrectamente localizados por la inmunohistoquímica. Además, en términos de supervivencia global ninguno de los 5 algoritmos fue capaz de definir grupos con impacto en el pronóstico. / Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), although considered a single category in the WHO classification, most likely includes different clinicopathologic entities difficult to separate with the standard techniques. From the clinical standpoint, the introduction of the immunochemoterapy in the treatment of DLBCL has dramatically improved the outcome of these patients with respect to chemotherapy alone. However, a significant proportion of these patients (20-30%) is refractory or eventually relapses. Nowadays, the identification of factors, either biological or clinical, that could recognize poor risk patients is a priority. Different prognostic factors for response and survival have been described in DLBCL, but in the rituximab era, the role of the biological prognostic factors is yet to be determined. In this sense, the first paper studies the main characteristics of the DLBCL extranodal primary origin. These patients more frequently show favorable prognostic features at diagnosis (early stage, low serum LDH and IPI low risk), as well as in evolution. Moreover, this paper questions the role of the immunochemotherapy in the extranodal DLBCL treatment. We observed lack of benefit in these patients, or simply the number of patients for different extranodal sites is not sufficient to detect differences. In the second paper we studied the reproducibility of the DLBCL molecular characterization by means of immunohistochemical studies. Currently, gene expression profiling studies (GEP) have allowed to separated the DLBCL in two subgroups, germinal centre (GCB) and activated (ABC) with the latter having a poorer outcome. However, molecular techniques are not applicable to the routine clinical practice because of its complexity and high cost. Therefore, attempts have been made to mimic this information using different algorithms immunohistochemical (Hans, Colomo, Muris, Choi and Tally) based on information extracted from the GEP. Nevertheless, in the present study none of the five immunohistochemical algorithms were able to accurately predict the GEP subtype or to separate molecular groups with prognostic value. In summary, this study allows to characterize the DLBCL-EN as a variant of good prognosis with a limited benefit of the immunochemotherapy. On the other hand, the DLBCL stratification based on immunohistochemical algorithms (GCB and non-GCB) should be viewed very cautiously.