Title: Functional assessment after experiemantally induced focal cerebral ischemia in rat. Objectives: The aim of this diploma thesis was to design and test a set of motor tests, which provide an effective assessment of motor deficit, which forms after small ischemic lesion of primary motor cortex. Methods: Experiment was performed in 16 Long Evans rats from breeding in Institute of Physiology, Academy of Sciences of the Czech Republic. Rats were devided into two groups (experimental and control). Ischemic lesion was induced by a photothrombotic stroke model to affect a small area - a motor cortex. For functional assessment we used five motor tests - Reaching test, Bar holding test, Rotarod test, Ladder rung walking test and Oper field test. For data analysis we used program Sigma Stat3.5®SPSS and Microsoft Excel 2010. Results: Our findings demonstrate that a small lesion of motor cortex is objectively measurable by Reaching test, which focuses on grip and fine motor skills. Other tests assess mainly gross motor skills and there we did not find a significant difference between experimental and control group. Our findings show that functional deficit manifests mostly in funkction of upper limb. During the time of the experiment we can see an improvement and increasing success in Reaching test and...

En raison de la complexité de sa pathogenèse, le traumatisme crânien (TC) entraîne de nombreuses lésions cérébrales pour lesquelles il n’existe aucun traitement neuroprotecteur. Il est aujourd’hui clairement établi que la neuro-inflammation est fortement impliquée dans les conséquences post-traumatiques. Cette neuro-inflammation se manifeste entre autres par l’induction de la cyclo-oxygénase de type 2 (COX-2). Bien que plusieurs données soient en faveur d’un rôle délétère de cette enzyme au cours de ce processus dévastateur, l’implication de la COX-2 dans les lésions induites par le TC reste encore controversée. Dans un modèle du TC par percussion mécanique chez la souris, nous avons mis en évidence une augmentation précoce et transitoire du contenu cérébral en COX-2 à 6 et 12 heures après le trauma. Cette induction protéique était à l’origine d’une production accrue de la prostacycline. Cependant, l’inhibition préférentielle de COX-2 était sans effet sur l’œdème cérébral et le déficit neurologique, deux indicateurs de pertinence clinique. Ces données montrent que la COX-2 ne peut pas constituer à elle seule une cible intéressante pour le traitement des conséquences post-traumatiques malgré son induction et son activité après le trauma. Par ailleurs, nous avons montré un effet bénéfique induit par l’indométacine au niveau fonctionnel, ce qui est en faveur d’un rôle délétère des COXs dans le déficit neurologique post-traumatique. Cet effet bénéfique peut impliquer uniquement la COX-1 ou en association avec la COX-2. Ces données constituent un argument supplémentaire qui s’ajoute à plusieurs preuves récentes fournies par la littérature en faveur d’un rôle délétère de COX-1 dans la neuro-inflammation. Malheureusement, ce rôle ne pourra pas être confirmé dans notre modèle car les inhibiteurs sélectifs de COX-1 disponibles à ce jour sont inexploitables dans nos conditions expérimentales. Ce travail constitue une nouvelle piste pour évaluer l’intérêt de l’inhibition des COXs au cours de la phase précoce de la prise en charge du patient traumatisé crânien. La bonne tolérance de l’usage à court terme des inhibiteurs de COX, leur disponibilité sur le marché, leur prix abordable, leur simplicité d’administration, leurs caractéristiques pharmacocinétiques et pharmacodynamiques bien connus sont des facteurs suscitant un intérêt croissant d’élargir le spectre de leurs utilisations en clinique et de la mise en place de nouveaux essais thérapeutiques dans les années à venir. / Because of its complex pathology, Traumatic Brain Injury (TBI) leads to numerous cerebral lesions for which there is no neuroprotective treatment. It is clearly known nowadays that neuro-inflammation is highly involved in post-traumatic consequences. This devastating process is manifested among others by the induction of cyclo-oxygenase type 2 (COX-2). Although many data are in agreement with a deleterious role of COX-2 in neuro-inflammation, the implication of this isoform in the TBI-induced lesions is still controversial. In a mouse model of TBI induced by mechanical percussion, we have shown an early and a transitory increase in the cerebral content of COX-2 at 6 and 12 hours after trauma. This protein induction was the source of an increased production of prostacyclin. However, the preferential inhibition of COX-2 had no effect against cerebral œdema and neurological deficit, two indicators of high clinical relevance. These data show that COX-2 cannot be considered by itself as an interesting target for the treatment of post-traumatic consequences despite its induction and activity after trauma. Besides, we have shown a beneficial effect that was induced by indomethacin at the functional level. This effect highly suggests a deleterious role of COXs in the post-traumatic neurological deficit. This neuroprotection could solely involve COX-1 or both COX isoforms. In accordance with several proofs that were recently supplied by literature, our data constitute an additional argument suggesting a deleterious role of COX-1 in neuro-inflammation. Unfortunately, this hypothesis cannot be confirmed in our model of TBI because the selective inhibitors of COX-1 available this day cannot be exploited in our experimental conditions. This experimental work is a new indication to evaluate the potential interest of COXs inhibition during the early phase of clinical management of patients with TBI. The good tolerance of the short-term intake of COX inhibitors, their availability on the market, their affordable price, their simple way of administration, their well-known pharmacokinetic and pharmacodynamic characteristics increase the need to widen the spectrum of their therapeutic indications and to design new clinical trials during the upcoming years.

Die Pathogenese der verzögerten ischämischen Defizite (VIND) nach Subarachnoidalblutung wird mit Produkten der Hämolyse in Zusammenhang gebracht. Topische Hirnsuperfusion mit einer artifiziellen cerebrospinalen Flüssigkeit (ACSF), die L-NA, einen NOS-Inhibitor, in Kombination mit einer erhöhten Kaliumkonzentration erhielt, hat bei der Ratte zu Ischämien geführt. Dieses Phänomen wurde als Cortical spreading ischemia (CSI) bezeichnet. Dabei scheint es während der neuronalen Depolarisation zu einer gestörten Kopplung zwischen cerebralem Metabolismus und Blutfluß zu kommen, die zu einer Vasokonstriktion und schließlich zur Ischämie führt. Die vorliegenden Arbeit beschäfftigte sich zum einen mit der Frage, ob Hämoglobin und hoch Kalium (35 mmol/l) auch zu CSIs führt,und ob es in Folge der CSIs zu cerebralen Parenchymschäden kommt. Methode: 24 Tieren wurde eine ACSF in den künstlich geschaffenen Subarachnoidalraum perfundiert. Diese ACSF enthielt eine erhöhte Kaliumkonzentration (K+ ) von 35 mmol/l und 2 mmol/l freies Hämoglobin (Hb). Unter dieser Versuchsanordnung kam es, als Antwort auf die neuronale Depolarisation, zu einem langandauernden massiven Abfall des rCBF in ischämische Bereiche, der sogenannten cortical spreading ischaemia (CSI). Zum Nachweis eines möglichen cerebralen Parenchymschadens durch die CSI wurden die Gehirne von 11 Versuchstieren histologisch untersucht. Von den 11 histologisch sowie immunhistochemisch gefärbten Hirnpräparaten wiesen 9 Hirne eine ausgeprägte cortikale Zellnekrose auf. Bei den Kontrolltieren, denen entweder nur die erhöhte K+ oder Hämoglobin in der ACSF superfundiert wurde, kam es nicht zum Auftreten von CSIs. und Anzeichen von nekrotischem Zelluntergang waren nicht zu sehen. Schlussfolge: Subarachnoidales Hb kombiniert mit hoch K+ fürt zur cortical spreading ischemia und in weiterer Folge zu ausgedehnten corticalen Infarkten. / The pathogenesis of delayed ischemic neurological deficits after subarachnoid hemorrhage has been related to products of hemolysis. Topical brain superfusion of artificial cerebrospinal fluid (ACSF) containing L-NA a NOS-inhibitor and high concentration of K+ has shown to induce ischemia in rats. Superimposed on a slow vasospastic reaction, the ischemic events represent spreading depolarisation of the neuronal-glial network that trigger acute vasoconstriction. The purpose of the present study was to investigate whether such spreading ischemias in the cortex could be caused also by the hemolysis products hemoglobin and K+ and whether such spreading cortical ischemias lead to brain damage. Methods: A cranial window was implanted in 24 rats. Cerebral blood flow (CBF) was measured using laser Doppler flowmetry, and direct current(DC)potentials were recorded. The ACSF was superfused topically over the brain. Rats were assigned to three groups representing ACSF composition. Analysis included classical histochemical and immunhistochemical studies. Superfusion of ACSF containing Hb combined with high concentration of K+ (35 mmol/L) reduced CBF gradually. Spreading ischemia in the cortex appeared when CBF reached 40 to 70% compared to baseline (which was 100%). This cortical spreading ischemia was characterized by sharp negative shift in DC, which preceded a steep CBF decrease that was followed by a slow recovery. In 9 of the surviving animals widespread cortical infarction was observed at the site of the cranial window and neighbouring areas in contrast to the findings in the two control groups. Conclusion: Subarachnoid Hb combined with high K+ causes cortical spreading ischemia and leads to widespread necrosis of the cortex.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un problème majeur de santé publique, puisqu’ils représentent la 3ème cause de mortalité dans les pays industrialisés. À l’heure actuelle, l’activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rt-PA) est le seul traitement pharmacologique à la phase aiguë des AVC ischémiques. Il s’agit d’un thrombolytique dont l’utilisation reste très limitée (<2% des patients). En effet, quand le rt-PA est administré au-delà de 4h30, aucune récupération fonctionnelle n’est observée chez le patient. De plus, les données cliniques et expérimentales ont montré que l’administration du rt-PA augmente fortement la survenue de transformations hémorragiques. Il apparaît donc indispensable de développer des stratégies permettant, d’une part, de s’opposer à ces transformations hémorragiques, et d’autre part, d’augmenter la fenêtre thérapeutique du rt-PA. Au vu de ces données, mon travail a consisté à préciser l’intérêt thérapeutique d’inhiber une enzyme, la poly(ADP-ribose)polymérase (PARP) pour s’opposer aux effets délétères du rt-PA au niveau vasculaire. Ces études ont été menées sur un modèle d’ischémie cérébrale thromboembolique réalisé chez la souris, consistant en une injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne. Dans un 1er temps, nous avons caractérisé ce modèle, récemment décrit dans la littérature (2007) et nouveau dans notre laboratoire. Nos travaux ont montré pour la première fois que, dans ce modèle, le rt-PA à la dose de 0,9 mg/kg (dose utilisée chez l’homme) reproduit fidèlement les « 2 visages » du thrombolytique en clinique : la thrombolyse précoce (30 min après l’ischémie) est associée à des effets bénéfiques, en réduisant le déficit neurologique, le volume de la lésion et l’œdème cérébral, alors que l’administration tardive de rt-PA (4h après l’ischémie) entraîne une aggravation des transformations hémorragiques et une perte de l’amélioration fonctionnelle. Dans un 2ème temps, nous avons étudié l’implication de la PARP dans les transformations hémorragiques induites par l’administration tardive de rt-PA. Le traitement par le PJ34(1 et 3 mg/kg), un puissant inhibiteur de cette enzyme, réduit la dégradation des protéines de jonction de la barrière hémato-encéphalique et les transformations hémorragiques induites par le rt-PA. De plus, le PJ34 s’oppose non seulement à la toxicité vasculaire du rt-PA, mais réduit également le déficit neurologique, le volume de la lésion et l’œdème cérébral. En conclusion, l’ensemble de ce travail montre que l’inhibition de la PARP prolonge la fenêtre thérapeutique du rt-PA et permet une thrombolyse « sécurisée ». Cette stratégie pourrait être mise en place de manière précoce après l’ischémie (avant même l’arrivée du patient à l’hôpital) et augmenter le nombre de patients pouvant bénéficier d’une thrombolyse. / Stroke is the third leading cause of death worldwide and a major cause of disability. Tissue plasminogen activator (rt-PA) is the only approved treatment in the United States and Europe for acute ischemic stroke. Clinical data show that beyond its therapeutic time window (4.5 hours after stroke onset), rt-PA exerts no more neuroprotective effects. Furthermore, clinical data showed that rt-PA increases the hemorrhagic transformations. Therefore, there is a critical need to develop a novel drug that can reduce rt-PA’s deleterious effects and extend its therapeutic window. The aim of the present study was to examine whether Poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) mediates the hemorrhagic transformations induced by rt-PA administration. We used a mouse model of thromboembolic stroke, which consists of a microinjection of thrombin in the middle cerebral artery. First, we showed that in the mouse thrombin stroke model, the "human" dose of rt-PA exhibits effects close to those observed in clinic. Later, we showed PARP is implicated in the vascular toxicity of rt-PA after cerebral ischemia. PJ34, a PARP inhibitor, preserves the blood brain barrier integrity, reduces rt-PA-induced hemorrhagic transformations, improves neurological outcomes and reduces brain infarction and edema. In conclusion, this work showed that PARP inhibitors could be relevant candidates to extend the therapeutic time window of rt-PA after stroke without increasing the risk of hemorrhagic transformations.

Le stress oxydant (SO) est un mécanisme commun à l’ischémie cérébrale et au traumatisme crânien qui entraîne notamment l’hyperactivation délétère de la poly(ADP-ribose)polymérase (PARP), une enzyme NAD+-dépendante. Cette dernière est impliquée dans le déficit neurologique et la lésion cérébrale consécutifs à ces pathologies. In vitro, l’hyperactivation de la PARP diminue le taux cérébral de NAD+, son substrat, et l’activité de la sirtuin 1 (SIRT1), une enzyme également NAD+-dépendante. L’activation de la SIRT1 est bénéfique au cours d’un SO in vitro. Si les effets bénéfiques de l’inhibition de la PARP ont été démontrés in vivo au cours d’un SO cérébral, l’implication de la SIRT1 ainsi que son rôle dans les effets de l’inhibition de la PARP n’ont pas été explorés. Dans la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence qu’un modèle de SO cérébral induit in vivo chez le rat par une injection intrastriatale de malonate entraîne un SO prolongé, un déficit neurologique et une activation de la PARP associée à une diminution du NAD+. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons montré que le 3-aminobenzamide (3AB), un inhibiteur de la PARP, ne permet pas de s’opposer à la chute du NAD+ dans ce modèle, ce qui suggère que le NAD+ pourrait être consommé par d’autres enzymes NAD+-dépendantes, dont la SIRT1. L’inhibition de la PARP par le 3AB a permis d’augmenter le rapport activité/expression nucléaire de la SIRT1 et a entraîné sa translocation cytoplasmique au cours du SO. Un prétraitement par le SRT1720, un activateur spécifique de la SIRT1, diminue le déficit neurologique et la lésion striatale 6 heures après le SO cérébral, ce qui suggère que l’activation de la SIRT1 est bénéfique dans les conséquences d’un SO cérébral in vivo. L’association de l’inhibiteur de la PARP avec l’activateur de la SIRT1 (3AB+SRT1720) n’a pas potentialisé les effets protecteurs de chaque monothérapie. L’EX527, un inhibiteur de la SIRT1, ne modifie pas le déficit et la lésion. En revanche, l’association de l’inhibiteur de la PARP avec l’inhibiteur de la SIRT1 (3AB+EX527) supprime la récupération neurologique ainsi que la réduction de la lésion, induites par l’inhibition de la PARP seule (3AB). Ces données suggèrent que l’activation de la SIRT1 est impliquée dans les effets bénéfiques de l’inhibition de la PARP in vivo au cours d’un SO cérébral. En conclusion, l’ensemble de ce travail a permis une meilleure caractérisation de la PARP et de la SIRT1 au cours d’un SO cérébral in vivo. La SIRT1 pourrait constituer une cible pharmacologique pour le traitement des pathologies cérébrales au cours desquelles un SO est présent. De plus, nous avons montré que les effets bénéfiques de l’inhibition de la PARP sur les conséquences fonctionnelles et histologiques induites par le SO cérébral sont liés à l’activation de la SIRT1. / Oxidative stress (OS) is involved in cerebral ischemia and traumatic brain injury and results in deleterious activation of poly(ADP-ribose)polymerase (PARP), an NAD+-dependant enzyme. PARP is implicated in neurological deficit and brain injury post-ischemia and post-trauma. In vitro, PARP overactivation reduced both brain NAD+ levels, its substrate, and activity of sirtuin 1 (SIRT1), an other NAD+-dependant enzyme. SIRT1 activation is beneficial during in vitro OS. Even if the beneficial effects of PARP inhibition have been demonstrated, SIRT1 involvement during in vivo cerebral OS and its role in the beneficial effects of PARP inhibition have not been studied.In the first part, we demonstrated that in vivo cerebral OS induced by intrastriatal injection of malonate in rat promoted prolonged OS, neurological deficit, PARP activation and NAD+ decrease. In the second part, we showed that 3-aminobenzamide (3AB), a PARP inhibitor, did not reduce NAD+ loss, suggesting that NAD+ could be consumed by other NAD+-dependant enzymes, including SIRT1. The PARP inhibitor increased the nuclear SIRT1 activity/expression ratio and induced its cytoplasmic translocation during OS. SRT1720, a specific SIRT1 activator, reduced both neurological deficit and striatal lesion 6 hours after cerebral OS, suggesting that SIRT1 activation is beneficial on in vivo OS consequences. The combination of the PARP inhibitor with the SIRT1 activator (3AB + SRT1720) did not potentiate the neuroprotective effects of each strategy. EX527, a SIRT1 inhibitor, did not affect OS-induced deficit and lesion. However, association of the PARP inhibitor with the SIRT1 inhibitor (3AB + EX527) suppressed the neurological recovery and the reduction of lesion induced by 3AB alone. Our data suggested that SIRT1 activation is involved in the neuroprotective effects of PARP inhibition during in vivo cerebral OS. In conclusion, our work led to a better characterization of PARP and SIRT1 during in vivo cerebral OS. SIRT1 is a potential pharmacological target for the treatment of brain pathologies in which OS is present. In addition, SIRT1 activation is involved in the beneficial effects of PARP inhibition on functional and histological cerebral OS consequences