Tübingen, Univ., Diss., 2006.

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La formation des neurites constitue une étape cruciale dans le processus de différenciation neuronale. Cependant, les mécanismes qui permettent de déterminer comment et à quelle position les neurites émergent sont toujours largement méconnus. Nous avons postulé qu'une marque moléculaire pouvait préfigurer la différenciation morphologique. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à identifier de nouvelles molécules capables de s'accumuler aux sites d'initiation des neurites et d'en contrôler la protrusion. De manière intéressante, chez la levure, la marque moléculaire qui contrôle le site de protrusion du bourgeon a été caractérisée. Parmi les centaines de protéines contrôlant le site d'initiation chez la levure, les Septines constituent une famille de protéines bien conservée chez les vertébrés. Ces GTPases forment des filaments qui agissent comme barrière de diffusion ou « échafaudage » moléculaire. Au cours de ma thèse, je me suis donc intéressée au rôle des Septines lors de l'initiation axonale dans le modèle des neurones sensoriels de DRG chez l'embryon de poulet. Nous avons pu démontrer qu'aux stades précoces de leur développement, ces neurones formaient deux axones, un au pôle ventral et l'autre au pôle dorsal, indiquant que le nombre et la position des sites d'initiation des axones sont bien contrôlés dans ces neurones. Nous avons, ensuite, démontré que les Septines étaient bien exprimées dans les DRG aux stades précoces du développement. Mes analyses en vidéo-microscopie de la localisation de la septine 7 au cours de la différentiation des neurones de DRG montrent que les Septines s'accumulent au site d'émergence de l'axone, juste avant ou lors de sa formation. L'inhibition des Septines induite par une construction dominant-négative (DN) ou par ajout d'un inhibiteur pharmacologique bloque la formation des axones. De plus, cette inhibition entraine une modification précoce de la morphologie, qui se traduit par l'apparition de cellules multipolaires complexes et de cellules rondes sans prolongement suggérant que, conformément à notre hypothèse, les Septines sont impliquées dans l'initiation des neurites. L'ensemble de ces résultats montre que les Septines régulent la différenciation morphologique précoce des neurones sensoriels / Neurite formation is a crucial step of neuronal differentiation. However, the mechanisms that determine how and at which position neurites emerge in the soma are still poorly understood. We postulated that a molecular polarity could prefigure the morphological differentiation, with some molecules that could accumulate at the future site of axon initiation. Interestingly, such molecular polarity has been evidenced in the contest of yeast budding, with bud forming at specific position relatively to the previous bud site. Genome-wide screen identified hundreds of proteins that control bud site location. Among the vertebrate molecules homologous to those involved in budding site selection, we selected the Septins as promising candidates. These GTP-ases form filaments that act as diffusion barriers and molecular scaffolds. We investigated the contribution of Septins to axon initiation using the chick dorsal root ganglion (DRG) neurons as a model. Monitoring of cell morphology in nascent ganglia indicates that DRG neurons form a single axon at the ventral pole and a second one at the dorsal pole and that these axons seem to emerge directly after their last division. This suggests that two initiation sites are selected at opposite pole of the soma.We found that Septins homologous with those controlling budding are expressed in the early DRG developmental stages. My analyses by time-lapse video-microscopy showed that Septin7 accumulate at the site of axon emergence, just before or during its formation.We observed that a pharmacological inhibitor and a dominant-negative construct block axon formation both in vitro and in vivo respectively. Furthermore, blocking Septin function leads to the appearance of uncommon round or sea urchin-like neurons. Thus, Septins appear to regulate early step of morphological differentiation of DRG neurons, possibly by controlling axon initiation site selection

Le vieillissement croissant de la population mondiale augmente les risques d’incidence de maladies dégénératives comme la maladie d’Alzheimer (AD). L’AD représente la forme de démence la plus commune. C’est plus de 40 millions de personnes qui sont affectés à l’échelle mondiale, créant ainsi un lourd fardeau économique annuel de plusieurs centaines de milliards de dollars. L’AD est une maladie dégénérative du cerveau qui se traduit par une perte graduelle de la mémoire et des fonctions cognitives. Cette dernière se caractérise par trois symptômes pathophysiologiques intimement reliés qui sont : (1) un système cholinergique défectueux, (2) une accumulation excessive de plaques séniles toxiques composées de peptides β–amyloïdes et (3) une hyperphosphorylation de la protéine Tau qui résulte en des enchevêtrements neurofibrillaires. Il n’existe à ce jour aucune cure contre l’AD et les traitements actuellement retrouvés sur le marché n’ont qu’un effet transitoire. En revanche, il y a de plus en plus d’indices qui suggèrent que l’utilisation de certains facteurs de croissance comme l’IGF-2, le bFGF et les neurotrophines pourraient agir à titre de traitement. Parmi ces derniers, la protéine morphogénétique osseuse 9 (BMP-9) a montré un fort potentiel thérapeutique. Cette dernière est toutefois coûteuse à produire en plus d’être volumineuse, ce qui limite fortement son acheminement au cerveau en raison de la barrière hématoencéphalique. Dans cette optique, nous avons développé deux peptides de 23 acides aminés dérivés de l’épitope knuckle de la BMP-9, pBMP-9 et SpBMP-9, 300 fois moins chers à produire. Les travaux de ce projet de doctorat portent sur le développement d’un système de libération du SpBMP-9, le plus efficace des deux peptides, comme stratégie de traitement contre l’AD. Tout d’abord, il a été montré que le SpBMP-9 permettait d’induire la différenciation neuronale de cellules humaines SH-SY5Y de façon plus efficace que la protéine native par la présence d’une croissance plus importante des neurites et l’expression de marqueurs de différenciation neuronaux. De plus, le SpBMP-9 pouvait agir sur au moins deux symptômes de l’AD en orientant la différenciation vers le phénotype cholinergique et en inactivant la GSK3β, une Tau kinase. Ensuite, un système de libération sous forme de nanoparticules à base de chitosane et d’alginate a été développé, puis caractérisé. Ce système de libération a permis d’encapsuler efficacement le SpBMP-9. Le suivi et la modélisation des cinétiques de libération à l’aide d’un modèle mathématique prenant en considération la distribution de taille des particules a permis d’identifier que la libération était principalement diffusive, mais qu’il existait de fortes interactions entre le peptide et l’alginate. Les tests de viabilité ont montré que les nanoparticules n’étaient pas toxiques sur des cellules SH-SY5Y. Enfin, le SpBMP-9 libéré à partir des nanoparticules était toujours bioactif et permettait une différentiation neuronale. Finalement, une étude exploratoire a permis de mettre en évidence que le SpBMP-9 pouvait agir en synergie avec le bFGF et le NGF. La combinaison du SpBMP-9 avec le bFGF ou le NGF a montré la présence d’une différenciation neuronale accrue mise en évidence par la présence d’une croissance de neurites supérieure, par l’expression de plusieurs marqueurs de différenciation ainsi que par un niveau de calcium intracellulaire plus important. Pour conclure, ces travaux de recherche suggèrent que le SpBMP-9 possède un fort potentiel thérapeutique dans le contexte de l’AD. Une étude plus approfondie de ses mécanismes d’action est requise ainsi que la validation de son effet in vivo sur modèle animal.

Die vorliegende Diplomarbeit vergleicht statistische Verfahren und neuronale Netze als Instrumente der Vorhersage von Zeitreihen und zeigt Stärken und Schwächen beider Modelle auf. Der Nachweis wird anhand von Daten aus der Produktionsplanung von Industrieunternehmen sowie aus dem Bereich der Kieferorthopädie geführt. Ausgehend von den Ergebnissen werden Möglichkeiten zur Verbesserung der Vorhersage im Bezug auf die Datenmodellierung sowie die Architektur und die Eigenschaften neuronaler Netze diskutiert, sowie ein Vergleich der prinzipiellen implementierten Netztypen untereinander hinsichtlich der Vorhersagequalität und die Vorhersage betreffender Charakteristika durchgeführt. Im praktischen Teil der vorliegenden Arbeit wurden weitergehend die zur Vorhersage verwendeten neuronalen Netze in einer universell verwendbaren Bibliothek implementiert. Für den obig erwähnten Anwendungsbereich der Produktionsplanung mit Hilfe neuronaler Netze wurde ein kommerziell verwendbares Programmodul entwickelt. In diesem Zusammenhang werden Probleme diskutiert, die insbesondere im praktischen Einsatz neuronaler Netze auftreten können.

Die Zellmembran dient der Zelle nicht nur als äußere Hülle, sondern ist auch an einer Vielzahl von lebenswichtigen Prozessen wie Signaltransduktion oder Zelladhäsion beteiligt. Wasser als integraler Bestandteil von Zellen und der extrazellulären Matrix hat sowohl einen großen Einfluss auf die Struktur von Biomolekülen, als auch selbst besondere Merkmale in eingschränkter Geometrie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Effekte an Modellmembranen untersucht: Erstens der Einfluss des Gegenions an kationischen Lipiden (DODAX, X = F, Cl, Br, I) auf die Eigenschaften des Grenzflächenwassers und zweitens das Vermögen durch Viskositätsänderungen das Wachstum von Nervenzellen anzuregen sowie die einzelnen Stadien der Bildung von neuronalen Netzwerken und deren Optimierung zu charakterisieren. Lipidmultischichten und darin adsorbiertes Grenzflächenwasser wurden mittels Infrarotspektroskopie mit abgeschwächter Totalreflexion untersucht. Nach Charakterisierung von Phasenverhalten und Wasserkapazität der Lipide wurden die Eigenschaften des Wassers durch kontrollierte Hydratisierung bei einem Wassergehalt von einem Wassermolekül pro Lipid verglichen. Durch die geringe Wasserkapazität können in diesem besonderen System direkte Wechselwirkungen zwischen Lipiden und Wasser aus der ersten Hydratationsschale beobachtet werden. Bemerkenswert strukturierte OH-Streckschwingungsbanden in Abhängigkeit des Anions und niedrige IR-Ordnungsparameter zeigen, dass stark geordnete, in ihrer Mobilität eingeschränkte Wassermoleküle an DODAX in verschiedenen Populationen mit unterschiedlich starken Wasserstoffbrückenbindungen existieren und sich vermutlich in kleinen Clustern anordnen. Die zweite Fragestellung hatte zum Ziel, das Wachstum von Nervenzellen auf Membranen zu beleuchten. Auf der Ebene einzelner Zellen wurde untersucht, ob sich in Analogie zu den bisher verwendeten elastischen Substraten, die Viskosität von Membranen als neuartiger physikalischer Stimulus dafür eignet, das mechanosensitive Verhalten von Neuronen zu modulieren. Das Wachstum der Neuronen wurde auf substrat- und polymergestützten Lipiddoppelschichten mittels Phasenkontrastmikroskopie beobachtet. Die Quantifizierung der Neuritenlängen, -auswuchsgeschwindigkeiten und -verzweigungen zeigten kaum signifikante Unterschiede. Diffusionsmessungen (FRAP) ergaben, dass entgegen der Erwartungen, die Substrate sehr ähnliche Fluiditäten aufweisen. Die Betrachtung der zeitlichen Entwicklung des kollektiven Neuronenwachstums, also der Bildung von komplexen Netzwerken, offenbarte robuste „Kleine-Welt“-Eigenschaften und darüber hinaus unterschiedliche Stadien. Diese wurden durch graphentheoretische Analyse beschrieben, um anhand typischer Größen wie dem Clusterkoeffizienten und der kürzesten Pfadlänge zu zeigen, wie sich die Neuronen in einem frühen Stadium vernetzen, im Verlauf eine maximale Komplexität erreichen und letztlich das Netzwerk durch effiziente Umstrukturierung hinsichtlich kurzer Pfadlängen optimiert wird.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die nanoskopische Analyse struktureller Differenzierung und Plastizität präsynaptischer aktiver Zonen (AZs) an der NMJ von Drosophila melanogaster mittels hochauflösender, lichtmikroskopischer Bildgebung von Bruchpilot (Brp). In erster Linie wurde das lokalisationsmikroskopische Verfahren dSTORM angewendet. Es wurden neue Analyse-Algorithmen auf der Basis von HDBSCAN entwickelt, um eine objektive, in weiten Teilen automatisierte Quantifizierung bis auf Ebene der Substruktur der AZ zu ermöglichen. Die Differenzierung wurde am Beispiel phasischer und tonischer Synapsen, die an dieser NMJ durch Is- und Ib-Neurone gebildet werden, untersucht. Phasische Is-Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit zeigten kleinere, kompaktere AZs mit weniger Molekülen und höherer molekularer Dichte mit ebenfalls kleineren, kompakteren Brp-Subclustern. Akute strukturelle Plastizität wurde am Beispiel präsynaptischer Homöostase, bei der es zu einer kompensatorisch erhöhten Neurotransmitterfreisetzung kommt, analysiert. Interessanterweise zeigte sich hier ebenfalls eine kompaktere Konfiguration der AZ, die sich auch auf Ebene der Subcluster widerspiegelte, ohne Rekrutierung von Molekülen. Es konnte demonstriert werden, dass sich eine höhere Moleküldichte in der Lokalisationsmikroskopie in eine höhere Intensität und größere Fläche in der konfokalen Mikroskopie übersetzt, und damit der Zusammenhang zu scheinbar gegensätzlichen Vorbefunden hergestellt werden. Die Verdichtung bzw. Kompaktierung erscheint im Zusammenhang mit der Kopplungsdistanz zwischen VGCCs und präsynaptischen Vesikeln als plausibles Muster der effizienten Anordnung molekularer Komponenten der AZ. Die hier eingeführten Analysewerkzeuge und molekularbiologischen Strategien, basierend auf dem CRISPR/Cas9-System, zur Markierung von AZ-Komponenten können zukünftig zur weiteren Klärung der Bedeutung der molekularen Verdichtung als allgemeines Konzept der AZ-Differenzierung beitragen. / The aim of this work was a nanoscopic analysis of structural differentiation and plasticity of presynaptic active zones (AZs) at the NMJ of Drosophila melanogaster using super-resolution light microscopy of Bruchpilot (Brp). The localization microscopy technique dSTORM was primarily used. New analysis algorithms based on HDBSCAN were developed to ensure objective and largely automatized quantification including the substructure of the AZ. Differentiation was assessed using the model of phasic and tonic neurons that are represented by type Is and type Ib neurons at this NMJ. Phasic Is synapses with higher release probability displayed smaller, more compact AZs with less molecules and an enhanced molecular density with smaller, more compact Brp subclusters. For acute structural plasticity the model of presynaptic homeostasis, which is accompanied by a compensatory increase of neurotransmitter release, was used. Interestingly, this again showed a more compact arrangement of the AZ, that was also found in Brp subclusters, without addition of molecules. It could be demonstrated that a higher molecular density in localization microscopy translates into a higher intensity and area in confocal microscopy and, thus, the apparent discrepancy to earlier studies could be explained. With respect to the coupling distance between VGCCs and presynaptic vesicles compaction appears to be a plausible mechanism for an efficient remodeling of AZ components. The analysis tools and molecular biology strategies, based on the CRISPR/Cas9-System, introduced here will be useful to further clarify the importance of molecular compaction as a general concept of AZ differentiation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La douleur ainsi que l’apprentissage moteur sont deux éléments importants à considérer en contexte de réadaptation. Même s’ils sont souvent abordés de manière isolée, des interactions ont été identifiées entre ces deux phénomènes. En effet, de nombreuses études montrent que les exercices de réadaptation musculaire pourraient réduire le développement de douleur pathologique. D’autre part, il semble que l’activité nociceptive pourrait altérer la plasticité du système moteur, une composante essentielle dans l’apprentissage d’une tâche motrice. Des recherches récentes ont aussi montré que la douleur pouvait interférer avec la plasticité du système moteur, même après que les signaux de douleurs se soient dissipés. Toutefois, ces observations ont été faites chez l’animal à la suite d’une lésion de la moelle épinière. De ce fait, la compréhension de cette interaction entre le système nociceptif et la plasticité motrice est assez limitée. Dans ce mémoire, l’effet d’un épisode de douleur passé sur la capacité d’apprentissage d’une tâche motrice a été évalué, chez le rat intact. Pour ce faire, nous avons élaboré une tâche dans laquelle les rats devaient apprendre à se déplacer d’un côté à l’autre d’un couloir sur des barres métalliques dont l’espacement pouvait être modifié. L’injection de substances inflammatoires à différentes durées d’action a permis d’identifier l’impact d’un épisode de douleur récent sur la capacité d’apprentissage d’une tâche motrice. Nos résultats montrent que, tout comme chez l’animal ayant une lésion de la moelle épinière, la douleur peut interférer avec l’apprentissage d’une tâche motrice même lorsque le système nerveux est intact. De plus, il semble que les déficits d'apprentissage moteur puissent également être influencés par la durée de l'épisode douloureuse antérieure. / Pain and motor learning are two important elements in rehabilitation context. Despite being mostly studied independently, important interactions exist between them in the context of spinal cord injury. Indeed, many studies show that rehabilitation exercises could reduce the development of pathological pain. On the other hand, it seems that the nociceptive activity could alter motor system plasticity. Recent studies have also shown that pain can interfere with motor plasticity, even when the acute pain signals have dissipated. However, these observations have mostly been made in animals following a spinal cord injury. As a result, this interaction between the nociceptive system and motor plasticity is poorly understood. In this master’s thesis, the effect of a prior pain episode on the motor learning ability was evaluated in neurologically intact rats. To do this, we trained rodents to walk on a custommade horizontal ladder. After initial training, the rats underwent a week-long rest, during which they were randomly assigned to a control group, or one out of two pain conditions. Nociceptive stimuli were then used to identify the impact of a prior pain episode on the motor learning ability. Our results show that pain can interfere with motor learning even in neurologically intact animals. Motor learning deficits also appear to be influenced by the duration of the previous pain episode. Taken together, these results suggest that previous pain episodes may negatively influence motor learning, and that the amplitude and duration of the learning disability is proportional to the duration of the prior pain episode.