Infiltration of myeloid cells in the tumor microenvironment is often associated with enhanced angiogenesis and tumor progression, resulting in poor prognosis in many types of cancer. The polypeptide chemokine PK2 (Bv8, PROK2) has been shown to regulate myeloid cell mobilization from the bone marrow, leading to activation of the angiogenic process, as well as accumulation of macrophages and neutrophils in the tumor site. Neutralizing antibodies against PK2 were shown to display potent anti-tumor efficacy, illustrating the potential of PK2-antagonists as therapeutic agents for the treatment of cancer. In this study we demonstrate the anti-tumor activity of a small molecule PK2 antagonist, PKRA7, in the context of glioblastoma and pancreatic cancer xenograft tumor models. For the highly vascularized glioblastoma, PKRA7 was associated with decreased blood vessel density and increased necrotic areas in the tumor mass. Consistent with the anti-angiogenic activity of PKRA7 in vivo, this compound effectively reduced PK2-induced microvascular endothelial cell branching in vitro. For the poorly vascularized pancreatic cancer, the primary anti-tumor effect of PKRA7 appears to be mediated by the blockage of myeloid cell migration/infiltration. At the molecular level, PKRA7 inhibits PK2-induced expression of certain pro-migratory chemokines and chemokine receptors in macrophages. Combining PKRA7 treatment with standard chemotherapeutic agents resulted in enhanced effects in xenograft models for both types of tumor. Taken together, our results indicate that the anti-tumor activity of PKRA7 can be mediated by two distinct mechanisms that are relevant to the pathological features of the specific type of cancer. This small molecule PK2 antagonist holds the promise to be further developed as an effective agent for combinational cancer therapy. / Dissertation

Η παρούσα εργασία αφορά στη μελέτη της ανταγωνιστικής αλληλεπίδρασης των Α1/D1 υποδοχέων στο επίπεδο έκφρασης του πρώιμου γονιδίου zif/268 (δείκτης νευρωνικής δραστηριότητας) και της in vivo μεταγωγής σήματος των Α1 και Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση στο μυ weaver. Ο μυς weaver αποτελεί ένα γενετικό μοντέλο ντοπαμινεργικής απονεύρωσης, η οποία συμβαίνει σταδιακά, έτσι ώστε το μοντέλο αυτό να προσομοιάζει τη Νόσο Πάρκινσον (ΝΠ) στον άνθρωπο. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης προέκυψε το ενδιαφέρον αποτέλεσμα ότι με την ταυτόχρονη ενεργοποίηση των Α1 και D1 υποδοχέων παρατηρήθηκε η αναμενόμενη ανταγωνιστική αλληλεπίδραση (ενδεχομένως μέσω σχηματισμού του ετεροδιμερούς), ενώ με την ενεργοποίηση μόνο των Α1 υποδοχέων στους weaver μύες παρατηρήθηκε αυξημένη ενεργοποίηση των νευρώνων του ραβδωτού σώματος και συγκεκριμένων περιοχών του εγκεφαλικού φλοιού. Η ενεργοποίηση αυτή ήταν μη αναμενόμενη, δεδομένου ότι οι Α1 υποδοχείς (A1Rs) είναι συζευγμένοι με Gi πρωτεΐνες και καταστέλλουν τη μεταγωγή σήματος που οδηγεί στην επαγωγή του zif/268 μέσω του D1R/Gs/cAMP/PKA/pDARPP-32/pCREB μονοπατιού. Η ακόλουθη διερεύνηση του μηχανισμού έδειξε ότι η Α1R-επαγόμενη ενεργοποίηση του zif/268 καταστέλλεται από τον ειδικό ανταγωνιστή των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης (A2ARs) ZM241385 και από τον ειδικό αγωνιστή των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης Quinpirole, υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση των Α2ΑRs και άρα ενεργοποίηση της έμμεσης οδού. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε, δεδομένου ότι η διέγερση των Α1Rs προκάλεσε αύξηση της έκφρασης του mRNA της εγκεφαλίνης, αλλά όχι της δυνορφίνης, που αποτελούν δείκτες ενεργοποίησης της έμμεσης και της άμεσης οδού, αντίστοιχα. Το γεγονός ότι ο αγωνιστής των Α1Rs δεν προκαλεί στα φυσιολογικά ζώα ενεργοποίηση του zif/268 mRNA υποδεικνύει την υπερευαίσθητη απόκριση των Α2ARs. Η μελέτη της υπερευαίσθητης αυτής απόκρισης στο μυ weaver έγινε με τη διερεύνηση της μεταγωγής σήματος μετά από in vivo ενεργοποίηση των Α2ΑRs: α) του καθιερωμένου μονοπατιού Α2ΑRs/Gs/AC/cAMP/PKA/pDARPP-32/pCREB, το οποίο οδηγεί στη επαγωγή του zif/268 και β) του μονοπατιού των ΜΑΡΚ. Τα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης της DARPP-32 στη θέση Thr-34. Τα αυξημένα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης DARPP-32 πολλαπλασιάζουν τη δράση της ΡΚΑ και άρα διευκολύνουν τη μεταγωγή σήματος μέσω Α2ΑRs/Gs/AC/cAMP/PKA/pDARPP-32/pCREB μονοπατιού. Επομένως, η υπερευαίσθητη απόκριση των Α2ΑRs κάτω από την έλλειψη ντοπαμίνης στο μυ weaver φαίνεται να οφείλεται στα αυξημένα ενδογενή επίπεδα της φωσφορυλιωμένης DARPP-32. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών ERK1/2(MAPK44/42) είναι αυξημένα στον μυ weaver, αλλά μειώνονται σημαντικά μετά από την ενεργοποίηση των Α2ΑRs. Δεν γνωρίζουμε το μηχανισμό μέσω του οποίου αυξάνονται τα ενδογενή επίπεδα των ERK1/2 και πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Το συμπέρασμα όμως που εξάγεται είναι ότι κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση η μεταβίβαση σήματος μέσω των Α2ΑRs δεν ενεργοποιεί την οδό των MAP κινασών. Στην παρούσα in vivo μελέτη αναδεικνύεται ο ρόλος των Α1 και Α2Α υποδοχέων στην λειτουργία των βασικών γαγγλίων κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν ιδιαίτερη σημασία δεδομένου ότι εμφανίζονται σε ένα γενετικό μοντέλο παρκινσονισμού, στο οποίο η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων είναι σταδιακή και προσομοιάζει τη ΝΠ, και όχι οξεία, όπως σε άλλα τοξικά μοντέλα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζουν ενδεχομένως κλινικό ενδιαφέρον, δεδομένου ότι η ενεργοποίηση της έμμεσης οδού μέσω Α1Rs από την ενδογενή αδενοσίνη θα επιδείνωνε περαιτέρω τις κινητικές δυσλειτουργίες της ΝΠ. Η πληροφορία αυτή, καθώς και η γνώση για την ενισχυμένη μεταγωγή σήματος μέσω των Α2Α υποδοχέων ενισχύουν την πρόταση για χρήση των Α2Α ανταγωνιστών ως αντιπαρκινσονικά φάρμακα. Δεδομένου ότι σήμερα το ενδιαφέρον είναι στραμμένο στη δημιουργία διμερών προσδεμάτων (bivalent ligands) που μπορούν να δρουν ταυτόχρονα σε δύο υποδοχείς, η συγκεκριμένη πληροφορία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για μελλοντική δημιουργία φαρμακευτικού σχήματος που να δρα ταυτόχρονα ως αγωνιστής των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης και ως ανταγωνιστής των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης. / The present work studied the antagonistic interaction of A1/D1 receptors at the level of mRNA expression of the immediate early gene zif/268 (used as a marker of neuronal function). In parallel we studied the in vivo signal transduction of A1 and A2A adenosine receptors under dopamine deficiency in weaver mutant. The weaver mutant represents the only genetic animal model of gradual nigrostriatal neuron degeneration, which can be characterized as a pathophysiological phenocopy of Parkinson’s Disease. In the first part of the study, the co-activation of A1 and D1 receptors revealed the well-known antagonistic interaction of these receptors (possibly through the formation of A1/D1 heterodimer) in weaver mutant. An interesting result was that the activation of A1 receptors alone did induce zif/268 mRNA expression in stiatal and specific cortical neurons in weaver mutant. This induction was not expected, since A1 receptors are Gi-coupled and suppress the signal transduction pathway that leads to zif/268 induction through AC/PKA/p-DARPP-32/pCREB cascade. Further study, revealed that the A1 receptor-induced zif/268 mRNA expression is counteracted by the A2A receptor selective antagonist ZM241385 and by the D2 receptor selective agonist Quinpirole, suggesting the activation of A2A receptors and thus the activation of the “indirect pathway”. Moreover, A1 receptors activation induced the expression of enkephalin mRNA, but not of dynorphin, which are considered as marker of neuronal activation of the “indirect” and the “direct” pathway, respectively. The fact that the A1 receptor agonist did not induced zif/268 mRNA expression in +/+ animals indicates that under dopamine deficiency the A2A receptors react with a supersensitive response. This response was analyzed in weaver mouse after in vivo A2A receptor activation: a) by examining the classical signal transduction pathway of A2A receptors/AC/PKA/p-DARPP-32/pCREB, which leads to zif/268 expression and b) by studying the MAPK cascade. Results showed increased basal phosphorylation levels of DARPP-32 (dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein, MW 32kDa) of Thr-34 in weaver compared to control mice. Increased phosphoThr34-DARPP-32 would amplify the effects of the PKA and thus facilitating the signal transduction through A2A receptors/AC/PKA/p-DARPP-32/pCREB. Therefore, the A2A receptors supersensitive response under dopamine deficiency in weaver mutant seems to be due to elevated endogenous phosphorylation levels of DARPP-32. Interestingly, while the basal phosphorylation levels of ERK1/2 (MAPK44/42) are elevated in weaver mutant, they are significantly reduced after A2A receptor activation. Although we do not know the mechanism through which the endogenous ERK1/2 levels are elevated, the conclusion is that, under dopamine deficiency, A2A receptors do not activate MAPK cascade. The present in vivo study demonstrates the role of A1 and A2A adenosine receptors in the function of basal ganglia under dopamine deficiency. Our results are significant since the expreriments were performed in a genetic parkinsonian model, in which the dopaminergic neurons are gradually degenerated and thus simulate the human PD, and not in an acute toxic model. Moreover, these results could be of possible clinical relevance, since the activation of A1 receptors by endogenous adenosine would exaggerate the motor dysfunctions of PD. Furthermore, the enhanced signal transduction pathway through A2A receptors supports the suggestion that the A2A receptor antagonists as antiparkinsonian agents. Given the well-known A2A/D2 antagonistic interaction, new therapeutical prospectives would involve the development of pharmacological bivalent ligands, which can interact with the A2A/D2 receptors and act simultaneously as A2A receptor antagonists and as D2 receptor agonists.

No description available.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Aromatase inhibitors (AIs) are the current standard of care for the treatment of hormone receptor positive breast cancer in postmenopausal women. Nearly one-half of patients receiving AI therapy develop musculoskeletal toxicity that is characterized by joint and/or muscle pain and approximately one-fourth of patients discontinue their therapy as a result of musculoskeletal pain. Since there are no effective strategies for prevention or treatment, insight into the mechanisms of AI-induced pain is critical to improve treatment. However, there are few studies of AI effects in animal models of nociception. To determine whether AIs produce hypersensitivity in animal models of pain, I examined the effects of AI administration on mechanical, thermal, and chemical sensitivity in rats. The results demonstrate that (1) repeated injection of 5 mg/kg letrozole in male rats produces mechanical, but not thermal, hypersensitivity that extinguishes when drug dosing is stopped; (2) administering a single dose of 1 or 5 mg/kg letrozole in ovariectomized (OVX) rats also induces mechanical hypersensitivity, without altering thermal sensitivity and (3) a single dose of 5 mg/kg letrozole or daily dosing of letrozole or exemestane in male rats augments flinching behavior induced by intraplantar ATP injection. To determine whether the effects of AIs on nociceptive behaviors are mediated by activation or sensitization of peptidergic sensory neurons, I determined whether letrozole exposure alters release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from isolated rat sensory neurons and from sensory nerve endings in rat spinal cord slices. No changes in basal, capsaicin-evoked or high extracellular potassium-evoked CGRP release were observed in sensory neuronal cultures acutely or chronically exposed to letrozole. Furthermore, letrozole exposure did not alter the ability of ATP to augment CGRP release from sensory neurons in culture. Finally, chronic letrozole treatment did not augment neuropeptide release from spinal cord slices. Taken together, these results do not support altered release of this neuropeptide into the spinal cord as mediator of letrozole-induced mechanical hypersensitivity and suggest the involvement of other mechanisms. Results from this dissertation provide a new experimental model for AI-induced hypersensitivity that could be beneficial in delineating mechanisms mediating pain during AI therapy.