Dans le but d'obtenir des composés originaux ayant une activité inhibitrice envers la NE, des triazoles et des 2-aminofuranes diversement substitués ont été synthétisés. Une réaction de "click chemistry" catalysée par le cuivre entre un azide et un alcyne a été appliquée pour la synthèse des triazoles. La synthèse des composés de type 2-aminofuranes est basée sur l'attaque nucléophile d'un isonitrile sur un γ-oxo butynoate d'alkyle en présence d'un aldéhyde aromatique.Les tests biologiques ont été réalisés tout au long de la thèse. Les composés présentant les meilleures IC50 envers la NE ont été sélectionnées pour une évaluation en terme de sélectivité vs les autres sérines protéases du PN (la cathepsine G et la protéinase 3). Enfin, les meilleurs inhibiteurs ont subi une évaluation de leur activité anti-oxydante selon deux méthodes: méthode au DPPH (1,1-diphényl-2-picryl-hydrazyl) et méthode au thiocyanate ferrique. / To prepare new compounds with an inhibitory activity towards NE, diversely substituted triazoles and 2-aminofuranes were synthesized. Triazoles were obtained using the copper catalyzed "click chemistry" between an azide and an alkyne. The synthesis of 2-aminofuranes is based on the nucleophilic attack of an isonitrile on an alkyl γ-oxo-butynoate in the presence of an aromatic aldehyde.Biological assays were carried out throughout the thesis. Compounds owning the best IC50 towards NE were selected for evaluation in terms of selectivity vs the two other serine-proteases of the PN (cathepsin G and proteinase 3). Finally, evaluation of antioxidant activity of the best compounds was achieved using by two approachs: DPPH (1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl) method and ferric thiocyanate method.

Neutrophile Granulocyten wirken als einer der ersten Abwehrmechanismen gegen invasive Mikroorganismen im angeborenen Immunsystem von Mammalia. Aktiviert durch inflammatorische Signale verlassen diese Granulocyten das vaskuläre System und migrieren durch das Gewebe zum Infektionsherd. Dort binden sie die Mikroorganismen, phagozytieren und eliminieren diese schließlich mit hoher Effizienz. Humane Neutrophile Elastase (NE) ist Bestandteil der neutrophilen Granula und spielt eine entscheidende Rolle im Abbau von Virulenzfaktoren enteroinvasiver Bakterien, einschließlich der Shigella Virulenzfaktoren IpaB (invasion antigen plasmid B) und IcsA (intracellular spread A). NE gehört zu der Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, die sich durch Sequenz- und Strukurähnlichkeit auszeichnen, jedoch sehr unterschiedliche biologische Funktionen aufweisen. Cathepsin G (CG) ist wie NE eine Chymotrypsin-ähnliche Serinprotease und ebenfalls in neutrophilen Granula lokalisiert. Allerdings zeigt CG keine Aktivität gegenüber Virulenzfaktoren von Shigella. Obwohl die Kristallstrukturen von CG und NE fast identisch sind, konnten einzelne oder mehrere Aminosäuren in der Substratbindungsspalte identifiziert werden, die zwischen den beiden Enzymen differieren. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Spezifität von NE gegenüber Virulenzfaktoren in diesen Unterschieden codiert sein könnte. Daher wurden diese Aminosäuren durch die analogen CG Aminosäuren oder durch Alanin ersetzt. Der Vergleich der funktionellen Eigenschaften der NE Mutanten mit wildtyp NE zeigte, dass die Aminosäuren an den Positionen 98 und 216-224 entscheidend für die Substratspezifität von NE sind. Die NE Mutanten N98A, 216-218 und 216-224 waren nicht mehr in der Lage, die Virulenzfaktoren IcsA und IpaB sowie das NE Peptidsubstrat abzubauen. Stattdessen haben diese Mutanten die Fähigkeit erlangt, das CG Peptidsubstrat abzubauen. Zusammenfassend konnten wir Aminosäuren in NE identifizieren, die sowohl die Spezifität von NE für das Peptidsubstrat als auch für die Virulenzfaktoren von Shigella flexneri determinieren. / Neutrophil granulocytes are one of the first lines of defense of the mammalian innate immune system against invading microorganisms. In response to inflammatory stimuli, neutrophils migrate from the blood stream to infected tissues where they bind, engulf and inactivate microorganisms efficiently. Human neutrophil elastase (NE), a neutrophil granule component, is a key host defense protein that rapidly destroys virulence factors of enteroinvasive pathogens including IpaB (invasion plasmid antigen B) and IcsA (intracellular spread A) from Shigella. NE belongs to the family of chymotrypsin-like serine proteases with sequence and structural similarity but with very different biological functions. Cathepsin G (CG) is another abundant chymotrypsin-like serine protease in neutrophil granules. However, in contrast to NE, CG does not cleave virulence factors of Shigella. The crystallographic structures of NE and CG are very similar but we identified single or multiple residues in the substrate-binding cleft to differ in these two enzymes. We hypothesized that NE specificity for bacterial virulence factors resides within these structural differences. Therefore these specific residues in NE were replaced with the analogous amino acids of CG or with alanine. By comparing the functional properties of these NE mutants to wildtype NE we were able to show that the amino acids at position 98 and 216-224 are crucial for the substrate specificity of NE. The NE mutants N98A, 216-218 and 216-224 did not cleave the virulence factors IcsA and IpaB as well as the NE peptide substrate but cleaved the CG peptide substrate. In summary, we identified residues in NE that determine the specificity of NE for the peptide substrate and for the Shigella flexneri virulence factors.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase (EC 3.4.21.37) durch wässrige und Dichlormethan-Extrakte von 15 Basidiomyceten festgestellt. Durch aktivitätsgeleitete Fraktionierung (mehrfache SC, GC-MS) der Dichlormethan-Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurden Fraktionen freier langkettiger Fettsäuren als ein wirksames Prinzip der Elastase-Hemmung und auch der Kollagenase-Hemmung (Clostridium histolyticum Kollagenase, EC 3.4.24.3) isoliert und identifiziert. Das Screening von 17 freien langkettigen Fettsäuren zeigte, dass einfach ungesättigte Fettsäuren eine stärkere Hemmung der Elastase-Aktivität bewirkten als ihre gesättigten bzw. mehrfach ungesättigten Homologa: Ölsäure (C18:1 cis-9): IC50 5µM; Stearin-(C18:0), Linolsäure (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; alpha- (C18:3 cis-9,12,15), gamma-Linolensäure (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. Inhibitorisch am stärksten wirksam war Erucasäur! e (C22:1 cis-13): IC50 450nM. Für Kollagenase wurde hingegen gezeigt, dass die gesättigten Fettsäuren eine erheblich stärkere Hemmaktivität als ihre ungesättigten Homologa aufwiesen. Aktivste Verbindungen waren Palmitin- (C16:0), Heptadecan- (C17:0), Stearin- und Nonadecansäure (C19:0) mit IC50-Werten von 20-45µM. Die Untersuchung von 9 ausgewählten Fettsäuren bezüglich der Hemmung der Aktivität der MMP-9 (EC 3.4.24.35) zeigte als aktivste Verbindungen Palmitolein- (16:1 cis-9), alpha- und gamma-Linolensäure. Die wirksamen Konzentrationen (250µM) lagen jedoch sehr hoch. Zytotoxizitätsuntersuchungen (ECV-304) der Extrakte von H. annosum und L. deterrimus sowie der freien Fettsäuren schlossen sich ebenso wie Untersuchungen zur Proteaseaktivität der Zelllinien ECV-304, MCF-7 und MDA-MB 231 an. Die Proteaseaktivität der Zellen nahm in der Reihenfolge ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231 zu. Die einzig untersuchte Fettsäure gamma-Linolensäure zeigte keine reproduzierbare Beeinflussung d! er Proteaseaktivität. / In the present paper it was established that the activity of humane neutrophil elastase (EC 3.4.21.37) is affected by aqueous and dichloromethane extracts of 15 basidiomycetes. Bioassay-guided fractionation (repeated CC, GC-MS) of dichloromethane extracts of Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. and Lactarius deterrimus Grög. led to isolation and identification of fractions of free fatty acids as one active principle of elastase inhibition as well as collagenase inhibition (Clostridium histolyticum collagenase, EC 3.4.24.3). By testing 17 free fatty acids for elastase inhibition it was shown that the inhibition rate of unsaturated acids was much higher than the rate of the saturated ones: oleic acid (C18:1 cis-9): IC50 5µM; stearic acid (C18:0), linoleic acid (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; linolenic acid (C18:3 cis-9,12,15), gamma-linolenic acid (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. The highly active erucic acid with an IC50 value of 450nM is remarkable. As a result for collagenase we can assume that the saturated fatty acids were more potent than the unsaturated ones. Palmitic acid (C16:0), heptadecanoic acid (C17:0), stearic acid, and nonadecanoic acid (C19:0) were the most potent fatty acids with IC50 values of 20-45µM. 9 selected fatty acids were investigated for their ability to inhibit the activity of MMP-9 (EC 3.4.24.35). Palmitoleic acid (16:1 cis-9), linolenic acid, and gamma-linolenic acid were the most potent fatty acids but their inhibiting concentrations were very high (250µM). Investigation of cytotoxicity of the extracts of H. annosum, L. deterrimus, and free fatty acids as well as investigation of protease activity of ECV-304, MCF-7, and MDA-MB 231 cells followed. Protease activity of cells increased in the following manner: ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231. The only investigated fatty acid gamma-linolenic acid did not influence protease activity reproducibly.