In order for animals to experience pain and to suffer from it, they have to be capable of conscious perception. Recent evidence suggests that the fetus is maintained in a sleeplike unconscious state and that conscious perception therefore only occurs after birth. The timing of the onset of conscious perception depends on the maturation of underlying neurological processes and is anticipated to be species dependent. Painspecific electroencephalographic (EEG) responses of lightly anaesthetised young of three species born at different levels of neurological development were investigated. The results of the present thesis are in agreement with published data on general neurological, EEG and behavioural development. This information, in addition to the present results, has been used to estimate the approximate time of the onset of conscious perception in tammar wallaby joeys, rat pups and newborn lambs. In wallaby joeys (extremely immature at birth), the EEG remained isoelectric until about 100-120 days of in-pouch age and became continuous by about 150-160 days, with electroencephalographic and behavioural signs of conscious perception apparent by about 160-180 days. In rat pups (immature at birth), the absence of a differentiated EEG suggests that the ability for conscious perception in pups younger than 10-12 days is doubtful. The marginal EEG responses to noxious stimulation in 12-14 day-old pups and the pronounced EEG responses in pups 18-20 days suggest that rats may be capable of conscious perception from 12-14 days onwards. In lambs (mature at birth), full conscious perception is probably not apparent before 5 minutes after birth and may take up to several hours or days to become fully established. Its modulation by the residual neuroinhibitor allopregnanolone, if that occurs, would be highest over the first 12 hours after birth. Overall, the onset of conscious perception does not seem to follow an “on-off phenomenon”, but seems to develop gradually, even in species born neurologically mature. Although conscious perception, and hence pain experience, may be qualitatively different in younger animals, on the basis of the precautionary principle, when significantly invasive procedures are planned, pain relief should be provided from those postnatal ages when pain may first be perceived – i.e. from about 120 days in the tammar wallaby joey, about 10 days in the rat pup and from soon after birth in the lamb.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2004. / Härtill 5 uppsatser.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29 / Introdução: Estudo previamente realizado em nosso laboratório demonstrou que a restrição alimentar intra-uterina (RAIU) provoca um retardo na termorregulação dos recém-nascidos. Em neonatos o tecido adiposo marrom (TAM) é essencial para a termogênese, principalmente devido à presença de proteínas desacopladoras (UCPs), cuja expressão pode ser modificada pela ação de hormônios como os hormônios da tireóide, a leptina e a insulina, que podem ser afetados pela restrição alimentar. A bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA1), presente no músculo e recentemente identificada no TAM, pode contribuir para a produção de calor. Objetivo: Avaliar a expressão das proteínas UCP1, UCP2, UCP3 e da SERCA1 no TAM e da UCP3 e da SERCA1 no músculo esquelético (ME) de animais submetidos a RAIU, bem como o perfil plasmático de insulina, leptina e hormônios tireoidianos destes filhotes. Métodos: Ratos fêmeas Wistar EPM-1 controle (C) receberam ração ad libitum durante todo o período gestacional e o grupo restrito (R) recebeu 50% desta quantidade. Quinze horas após o nascimento (pico de expressão das UCPs), os filhotes foram pesados e decapitados para coleta de sangue (pool) para a dosagem plasmática de insulina, leptina, T3 e T4 por ELISA. Foram coletados TAM e ME, para determinação da expressão das UCPs e da SERCA1 por imuno-histoquímica. Para análise dos resultados, utilizou-se o teste “t” de Student não pareado, com nível de significância de 5%. Resultados: Os animais R (n=16) apresentaram durante a gestação um ganho de peso corporal (g) significantemente inferior quando comparado ao C (n=16), (27,6 ± 3,8 e 109,0 ± 4,1). Os filhotes R (n=172) apresentaram redução significante do peso corporal (g) ao nascimento em relação aos filhotes C (n=169) (4,82 ± 0,05 e 5,83 ± 0,04); entretanto, não houve redução no número de filhotes por ninhada. A RAIU levou a um aumento significante na expressão (pixels) da UCP1 e da UCP2 no TAM da prole R em relação à prole C (em 42% e 53%, respectivamente). Não observamos diferença significante entre os grupos em relação à expressão da UCP3 e da SERCA1 no TAM e no ME. A concentração plasmática de insulina (ng/ml) foi significantemente maior nos filhotes R (n=8) em relação aos C (n=13) (3,34 ± 0,78 e 1,17 ± 0,18) e os níveis plasmáticos de T3 (ng/ml) foram significantemente menores nos filhotes R (n=10) quando comparados aos C (n=14) (0,82 ± 0,06 e 1,09 ± 0,08). Não houve diferenças significantes para as dosagens plasmáticas de leptina (pg/ml) (R (n=8) 987,79 ± 261,08 e C (n=11) 1255,54 ± 392,37) e T4 (ng/ml) (R (n=10) 20,99 ± 3,74 e C (n=12) 16,00 ± 1,68). Conclusão: O atraso no desenvolvimento da termorregulação previamente descritos nesses animais não parece resultar de redução na termogênese, mas de aumento na termólise, pois a RAIU provocou baixo peso dos filhotes ao nascimento, levando a uma maior relação superfície/ volume. A maior expressão da UCP1 e UCP2 no TAM observada nos filhotes restritos possivelmente ocorreu como um mecanismo compensatório para aumentar a termogênese, o que pode ter sido modulado por ação hormonal. / Background: Previous study from our laboratory has shown that intrauterine food restriction (IUFR) delayed thermoregulation of the newborns. In neonates brown adipose tissue (BAT) is essential for thermogenesis mainly due to the presence of uncoupling proteins (UCPs) and their expression can be modified by action of hormones such as thyroid hormone, leptin and insulin, which can be affected by food restriction. The sarcoplasmic reticulum Ca++ ATPase, (SERCA1) recently identified in BAT may contribute to heat production. Aim: The aim of this study was to evaluate the protein expression of UCP1, UCP2, UCP3 and SERCA1 in BAT and UCP3 and SERCA1 in skeletal muscle (SM) and the plasmatic concentration of insulin, leptin, T3 and T4 of newborn rats exposed to IUFR. Methods: Female Wistar EPM-1 control rats received chow ad libitum during pregnancy period (C) and food-restricted rats (R) received 50% of the amount ingested by C. Fifteen hours after birth, newborns were weighted and sacrificed by decapitation. Blood was collected for determination of insulin, leptin, T3 and T4 by ELISA. BAT and SM were used for determination of protein expression (UCPs and SERCA1) by immunohistochemistry. Unpaired Student’s t-test was used for statistical analysis of the results (p<0,05). Results: R animals (n=16) showed a significant lower weight gain (g) during pregnancy when compared to C (n=16) (27,6 ± 3,8 and 109,0 ± 4,1). R pups (n=172) showed a significant reduction in their body weight (g) at birth when compared to C (n=169) (4,82 ± 0,05 and 5,83 ± 0,04); however, there was no reduction in number of pups per litter. IUFR caused a significant increase in the expression (pixels) of UCP1 and UCP2 in BAT of the pups (42% and 53% respectively). UCP3 and SERCA1 expression in BAT and SM showed no significant differences between groups. Plasmatic insulin (ng/ml) was significantly higher in R pups (n=8) when compared to C (n=13) (3,34 ± 0,78 and 1,17 ± 0,18) and T3 levels (ng/ml) was significantly lower in R pups (n=10) when compared to C (n=14) (0,82 ± 0,06 and 1,09 ± 0,08). No differences between groups were found for leptin (pg/ml) (R (n=8) 987,79 ± 261,08 and C (n=11) 1255,54 ± 392,37) and T4 (ng/ml) levels (R (n=10) 20,99 ± 3,74 and C (n=12) 16,00 ± 1,68). Conclusion: The delay in development of thermoregulation previously described in these animals appears not to result from impairment in thermogenesis, but from an increase in heat loss, since IUFR caused low birth weight in pups, leading to greater surface/ volume ratio. The higher expression of UCP1 and UCP2 in BAT showed by R pups possibly occurred as a compensatory mechanism to increase thermogenesis, which may have been modulated by hormonal regulation. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

INTRODUÇÃO: Transplantes parciais de fígado em crianças têm sido realizados com maior freqüência, enfatizando a importância do estudo da regeneração hepática, bem como dos efeitos de drogas imunossupressoras sobre a mesma. A regeneração do parênquima é o resultado do balanço entre multiplicação celular e apoptose, esta última definida como morte celular programada. Neste processo, estão envolvidas expressões de genes pró-apoptóticos (Bak e Bax) e anti-apoptóticos (Bcl-XL e Bcl-2). Dentre as proteínas relacionadas à proliferação hepatocitária, destaca-se a interleucina-6 (IL-6). Embora o modelo de ressecção de 70% da massa hepática de ratos adultos seja amplamente utilizado para estudos de regeneração, não há trabalhos com animais em crescimento. MÉTODOS: Na presente pesquisa, foi padronizado o modelo de hepatectomia parcial em ratos recém-nascidos e em recém-desmamados: realizou-se ligadura com fio de algodão do pedículo dos lobos esquerdo lateral, esquerdo medial e direito medial, seguida da ressecção do parênquima desses lobos. Os fígados remanescentes foram imediatamente pesados e comparados com os pesos dos fígados de animais controles. Para caracterização dos modelos de regeneração, 40 ratos recém-nascidos e 30 recém-desmamados foram submetidos à hepatectomia descrita e mortos nos dias subseqüentes (1, 2, 3, 4 e 7), e o fígado residual submetido a análises de peso e histologia convencional. A seguir, 36 animais (18 recém-nascidos e 18 recém-desmamados) foram divididos nos seguintes grupos: controle, cirurgia simulada e hepatectomia. Um dia após, utilizando métodos moleculares (técnica do RT-PCR), estudou-se a expressão do gene da IL-6, dos genes pró-apoptóticos e anti-apoptóticos nos fígados desses animais e, por meio de métodos imunoistoquímicos, analisou-se a presença de antígenos relacionados à proliferação celular (PCNA) e apoptose (TUNEL) em lâminas preparadas pela técnica do \"tissue microarray\". Em outros 36 ratos (18 recém-nascidos e 18 recém-desmamados), foram administradas drogas imunossupressoras (metilprednisolona, ciclosporina A ou tacrolimus, separadamente) no ato da hepatectomia, e o parênquima hepático remanescente submetido às mesmas análises moleculares e imunoistoquímicas, um dia após. RESULTADOS: A ressecção do parênquima hepático correspondeu a 70% da massa total do fígado. A mortalidade relacionada à hepatectomia nos animais recém-nascidos e recém-desmamados foi 30% e 0% respectivamente. Na análise histológica observou-se maior quantidade de mitoses em hepatócitos no terceiro dia nos recém-nascidos e no segundo dia nos recém-desmamados, com normalização da arquitetura do parênquima até o 7º dia e recuperação total do peso de ambos. No animal recém-nascido, notou-se intensa esteatose associada ao processo regenerativo. A hepatectomia provocou aumento na expressão do gene da IL-6 no fígado residual e diminuição da expressão dos genes pró-apoptóticos em ambos os modelos, além de aumento do anti-apoptótico Bcl-2 nos animais recém-desmamados. O estudo realizado sobre o efeito das drogas imunossupressoras mostrou resultados diferentes daqueles descritos em animais adultos, não havendo alteração no número de células em proliferação (PCNA positivas) ou apoptose (TUNEL positivas). As drogas não tiveram efeito sobre a expressão do gene da IL-6. Metilprednisolona e tacrolimus ocasionaram aumento da expressão do gene anti-apoptótico Bcl-2 em ambos os modelos; metilprednisolona e ciclosporina provocaram aumento na expressão do gene pró-apoptótico Bak nos ratos recém-nascidos. CONCLUSÕES: os modelos de regeneração hepática em ratos recém-nascidos e recém-desmamados foram exeqüíveis e adequados para a pesquisa; a hepatectomia promoveu estímulo da proliferação de hepatócitos com inibição da apoptose; as drogas imunossupressoras utilizadas não exerceram efeito sobre a proliferação de hepatócitos porém provocaram aumento da expressão de genes relacionados a apoptose. / INTRODUCTION: Partial liver transplantation has been performed in children with increasing frequency, and this emphasizes the importance of the studies of hepatic regeneration and the effects of immunosuppressive drugs on this phenomenon. Liver regeneration is controlled by the balance between cell proliferation and apoptosis (defined as a programmed cell death that results from the expression of pro-apoptotic genes - Bax and Bak - and anti-apoptotic genes - Bcl-2 and Bcl-XL). Among proteins related to hepatocyte proliferation, interleukin-6 is an important one. Although the adult rat model of 70% hepatectomy has been widely utilized for studies of liver regeneration, there are no studies using growing animals. METHODS: In the current paper, two experimental models were created utilizing newborn and weaning rats: using a cotton thread, the vascular hilum and the hepatic vein were ligated and the left lateral, left medial and right medial lobes were resected. The remaining liver was immediately harvested and weighted to be compared to control livers. The animals were sacrificed on days 1, 2, 3, 4, and 7 after the operation, the remnant livers were weighted and harvested for histological examinations. Then, 36 animals (18 newborn and 18 weaning animals) were divided into the following groups: control, sham and hepatectomy. One day after, the expressions of IL-6 gene, pro-apoptotic and anti-apoptotic genes were studied in the remnant livers. Immunohistochemical stainings for cell antigens related to cell proliferation (PCNA) and apoptosis (TUNEL) were also performed utilizing tissue microarray sections. In another group of 36 animals (18 newborn and 18 weaning animals), immunosuppressive drugs were administered just after the hepatectomy (methylprednisolone, cyclosporine A or tacrolimus separately), and the remnant liver submitted to the same molecular and immunohistochemical studies. RESULTS: The resected liver corresponded to 70% of the total liver weight. The mortality rates after hepatectomy were 30% and 0% for newborn and weaning rats, respectively. The histological examinations showed a great number of mitoses of hepatocytes on the third day in newborns and on the second day in weaning rats, and normalization of histological aspects by 7 days after hepatectomy and weight recuperation. In the newborn group liver regeneration was related to an intense steatosis. Hepatectomy promoted an increase in the expression of IL-6 gene of the remnant liver, a decreased expression of pro-apoptotic genes in both models, and an increased expression of anti-apoptotic Bcl-2 gene in weaning rats. The study of the effects of immunosuppressants showed different results from those described in adult animals, with no alterations in the number of cells in proliferation (PCNA positive) and apoptosis (TUNEL positive). Drugs had no effect in expression of IL-6 gene. Methylprednisolone and tacrolimus promoted an increased expression of anti-apoptotic gene Bcl-2. In addition, methylprednisolone and cyclosporine promoted an increase in the expression of the pro-apoptotic gene Bak in newborn rats. CONCLUSIONS: The experimental models were feasible and adequate for the current investigations; hepatectomy stimulated hepatocyte proliferation and inhibited hepatic cells apoptosis; the utilized immunosuppressant drugs did not affect hepatocyte proliferation although an increased expression of apoptosis-related genes was verified.

INTRODUÇÃO: Transplantes parciais de fígado em crianças têm sido realizados com maior freqüência, enfatizando a importância do estudo da regeneração hepática, bem como dos efeitos de drogas imunossupressoras sobre a mesma. A regeneração do parênquima é o resultado do balanço entre multiplicação celular e apoptose, esta última definida como morte celular programada. Neste processo, estão envolvidas expressões de genes pró-apoptóticos (Bak e Bax) e anti-apoptóticos (Bcl-XL e Bcl-2). Dentre as proteínas relacionadas à proliferação hepatocitária, destaca-se a interleucina-6 (IL-6). Embora o modelo de ressecção de 70% da massa hepática de ratos adultos seja amplamente utilizado para estudos de regeneração, não há trabalhos com animais em crescimento. MÉTODOS: Na presente pesquisa, foi padronizado o modelo de hepatectomia parcial em ratos recém-nascidos e em recém-desmamados: realizou-se ligadura com fio de algodão do pedículo dos lobos esquerdo lateral, esquerdo medial e direito medial, seguida da ressecção do parênquima desses lobos. Os fígados remanescentes foram imediatamente pesados e comparados com os pesos dos fígados de animais controles. Para caracterização dos modelos de regeneração, 40 ratos recém-nascidos e 30 recém-desmamados foram submetidos à hepatectomia descrita e mortos nos dias subseqüentes (1, 2, 3, 4 e 7), e o fígado residual submetido a análises de peso e histologia convencional. A seguir, 36 animais (18 recém-nascidos e 18 recém-desmamados) foram divididos nos seguintes grupos: controle, cirurgia simulada e hepatectomia. Um dia após, utilizando métodos moleculares (técnica do RT-PCR), estudou-se a expressão do gene da IL-6, dos genes pró-apoptóticos e anti-apoptóticos nos fígados desses animais e, por meio de métodos imunoistoquímicos, analisou-se a presença de antígenos relacionados à proliferação celular (PCNA) e apoptose (TUNEL) em lâminas preparadas pela técnica do \"tissue microarray\". Em outros 36 ratos (18 recém-nascidos e 18 recém-desmamados), foram administradas drogas imunossupressoras (metilprednisolona, ciclosporina A ou tacrolimus, separadamente) no ato da hepatectomia, e o parênquima hepático remanescente submetido às mesmas análises moleculares e imunoistoquímicas, um dia após. RESULTADOS: A ressecção do parênquima hepático correspondeu a 70% da massa total do fígado. A mortalidade relacionada à hepatectomia nos animais recém-nascidos e recém-desmamados foi 30% e 0% respectivamente. Na análise histológica observou-se maior quantidade de mitoses em hepatócitos no terceiro dia nos recém-nascidos e no segundo dia nos recém-desmamados, com normalização da arquitetura do parênquima até o 7º dia e recuperação total do peso de ambos. No animal recém-nascido, notou-se intensa esteatose associada ao processo regenerativo. A hepatectomia provocou aumento na expressão do gene da IL-6 no fígado residual e diminuição da expressão dos genes pró-apoptóticos em ambos os modelos, além de aumento do anti-apoptótico Bcl-2 nos animais recém-desmamados. O estudo realizado sobre o efeito das drogas imunossupressoras mostrou resultados diferentes daqueles descritos em animais adultos, não havendo alteração no número de células em proliferação (PCNA positivas) ou apoptose (TUNEL positivas). As drogas não tiveram efeito sobre a expressão do gene da IL-6. Metilprednisolona e tacrolimus ocasionaram aumento da expressão do gene anti-apoptótico Bcl-2 em ambos os modelos; metilprednisolona e ciclosporina provocaram aumento na expressão do gene pró-apoptótico Bak nos ratos recém-nascidos. CONCLUSÕES: os modelos de regeneração hepática em ratos recém-nascidos e recém-desmamados foram exeqüíveis e adequados para a pesquisa; a hepatectomia promoveu estímulo da proliferação de hepatócitos com inibição da apoptose; as drogas imunossupressoras utilizadas não exerceram efeito sobre a proliferação de hepatócitos porém provocaram aumento da expressão de genes relacionados a apoptose. / INTRODUCTION: Partial liver transplantation has been performed in children with increasing frequency, and this emphasizes the importance of the studies of hepatic regeneration and the effects of immunosuppressive drugs on this phenomenon. Liver regeneration is controlled by the balance between cell proliferation and apoptosis (defined as a programmed cell death that results from the expression of pro-apoptotic genes - Bax and Bak - and anti-apoptotic genes - Bcl-2 and Bcl-XL). Among proteins related to hepatocyte proliferation, interleukin-6 is an important one. Although the adult rat model of 70% hepatectomy has been widely utilized for studies of liver regeneration, there are no studies using growing animals. METHODS: In the current paper, two experimental models were created utilizing newborn and weaning rats: using a cotton thread, the vascular hilum and the hepatic vein were ligated and the left lateral, left medial and right medial lobes were resected. The remaining liver was immediately harvested and weighted to be compared to control livers. The animals were sacrificed on days 1, 2, 3, 4, and 7 after the operation, the remnant livers were weighted and harvested for histological examinations. Then, 36 animals (18 newborn and 18 weaning animals) were divided into the following groups: control, sham and hepatectomy. One day after, the expressions of IL-6 gene, pro-apoptotic and anti-apoptotic genes were studied in the remnant livers. Immunohistochemical stainings for cell antigens related to cell proliferation (PCNA) and apoptosis (TUNEL) were also performed utilizing tissue microarray sections. In another group of 36 animals (18 newborn and 18 weaning animals), immunosuppressive drugs were administered just after the hepatectomy (methylprednisolone, cyclosporine A or tacrolimus separately), and the remnant liver submitted to the same molecular and immunohistochemical studies. RESULTS: The resected liver corresponded to 70% of the total liver weight. The mortality rates after hepatectomy were 30% and 0% for newborn and weaning rats, respectively. The histological examinations showed a great number of mitoses of hepatocytes on the third day in newborns and on the second day in weaning rats, and normalization of histological aspects by 7 days after hepatectomy and weight recuperation. In the newborn group liver regeneration was related to an intense steatosis. Hepatectomy promoted an increase in the expression of IL-6 gene of the remnant liver, a decreased expression of pro-apoptotic genes in both models, and an increased expression of anti-apoptotic Bcl-2 gene in weaning rats. The study of the effects of immunosuppressants showed different results from those described in adult animals, with no alterations in the number of cells in proliferation (PCNA positive) and apoptosis (TUNEL positive). Drugs had no effect in expression of IL-6 gene. Methylprednisolone and tacrolimus promoted an increased expression of anti-apoptotic gene Bcl-2. In addition, methylprednisolone and cyclosporine promoted an increase in the expression of the pro-apoptotic gene Bak in newborn rats. CONCLUSIONS: The experimental models were feasible and adequate for the current investigations; hepatectomy stimulated hepatocyte proliferation and inhibited hepatic cells apoptosis; the utilized immunosuppressant drugs did not affect hepatocyte proliferation although an increased expression of apoptosis-related genes was verified.