A genética forense vem se desenvolvendo cada vez mais, com novas tecnologias e implementação de novos conjuntos de marcadores de DNA com maiores níveis de informatividade. Os marcadores genéticos são amplamente usados na identificação humana, pois permitem distinguir indivíduos com alta acurácia. Duas classes de marcadores muito utilizadas atualmente são os STRs (Short Tandem Repeats) e os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Os STRs são altamente informativos e, portanto, úteis para a prática forense. Kits mais novos como GlobalFiler (Thermo Fisher Scientific) e PowerPlex Fusion System (Promega) apresentam a análise de mais de 20 loci STRs de uma só vez. Já os SNPs, por possuírem sua informatividade mais reduzida (necessita de mais loci analisados), são menos utilizados, porém apresentam vantagem em amostras degradadas de DNA; assim, conjuntos de identificação como o 52-plex desenvolvido pelo consórcio SNPforID e o conjunto IISNPs, vêm sendo estudados em várias populações do mundo. Com o desenvolvimento de técnicas de sequenciamento de nova geração (NGS Next Generation Sequencing) para análise de DNA, a obtenção de perfis de DNA se tornou mais acurada. Algumas plataformas permitem gerar perfis de até 96 indivíduos simultaneamente. Este estudo tem por objetivo principal analisar 171 marcadores genéticos (Amelogenina, Y-INDEL, 30 STRSs e 139 SNPs) em 340 indivíduos miscigenados da região da cidade de Ribeirão Preto (SP) utilizando a plataforma de sequenciamento de nova geração MiSeq Personal Sequencer (Illumina Inc.), bem como calcular as frequências alélicas e genotípicas, verificar a aderência ao equilíbrio de HardyWeinberg e estimar parâmetros forenses para os diferentes conjuntos de marcadores. Análises de ancestralidade foram realizadas para os conjuntos de SNPs. Para o preparo das bibliotecas de amostras a serem sequenciadas, foi utilizado o kit HaloPlex (Agilent Technologies, Inc), onde foram incluídos os marcadores dos kits GlobalFiler e PowerPlex Fusion System, e os SNPs existentes no conjunto do consórcio SNPforID (52-plex) e IISNPs (92 SNPs). De todos os marcadores incluídos no ensaio, apenas um SNP (rs763869) presente no conjunto SNPforID não pôde ser analisado devido a questões técnicas. Dos 139 SNPs analisados apenas seis apresentaram desvios significativos em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg,número este esperado devido ao acaso. Os conjuntos de SNPs apresentam elevada informatividade com Probabilidade de Match de 6,48 x 10-21 (52-plex) a 4,91 x 10-38 (IISNP), e Poder de Exclusão de 0,9997 (52-plex) e 0,99999997 (IISNP). De modo geral, as inferências de ancestralidade obtida utilizando estes conjuntos, indicaram elevada contribuição europeia (superior a 70%) e baixa contribuição ameríndia (inferior a 10%) na população, enquanto que as análises de mistura individual se mostraram consistentes, com a maioria dos indivíduos apresentando elevada ancestralidade europeia. Os resultados dos marcadores relativos ao sexo (Amelogenina, Y-INDEL e DYS391) foram consistentes com o sexo dos doadores das amostras. As frequências alélicas e parâmetros forenses foram calculados para os STRs, revelando uma alta informatividade. A Probabilidade de Match combinada e o Poder de Exclusão combinado foram de 1,19 x 10-36 e 0,999999999997 respectivamente. Dos 29 STRs autossômicos presentes, seis apresentaram desvios ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, refletindo possíveis falhas no sequenciamento e genotipagem destes marcadores / The field of forensic genetics has developed increasingly with the implementation of new sets of DNA markers with higher levels of informativeness. The genetic markers are widely used in human identification as they allow distinguishing individuals with high accuracy. Two of the most commonly used markers are the Short Tandem Repeats (STRs) and the Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Newer kits such as GlobalFiler (Thermo Fisher Scientific) and PowerPlex Fusion System (Promega) can analyze more than 20 STRs loci at once. When comparing with STRs, the SNPs are less informative and many more loci are needed to reach the same informativeness of STR kits. However, they are advantageous when using degraded DNA samples. The identification sets such as the 52-plex developed by the SNPforID Consortium and the IISNPs have been analyzed in many worldwide populations. With the development of next generation sequencing techniques (NGS Next Generation Sequencing), obtaining DNA profiles has become more accurate and some platforms allow generating profiles of up to 96 individuals simultaneously. The main goal of this study is to analyze 171 markers (Amelogenin, Y-INDEL, 30 STRs and 139 SNPs) in 340 admixed individuals from Ribeirão Preto, SP, using the NGS platform MiSeq Personal Sequencer (Illumina Inc.). This will allow the calculation of allele and genotype frequencies, the verification of adherence to Hardy-Weinbergs equilibrium and the estimation of forensic parameters for each set of marker. Ancestry analysis was performed for the sets of SNPs. The HaloPlex kit (Agilent Technologies, Inc) was used for library preparation including the STRs from the kits GlobalFiler and PowerPlex Fusion System and the SNPs from the SNPforID consortium (52-plex) and IISNPs (92 SNPs) identification sets. A single SNP (rs763869) from the SNPforID set was not analyzed due to technical issues. Only six of the 139 analyzed SNPs presented significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium expectations, which is expected by chance alone. The SNPs sets exhibited high informativeness, with matchprobability ranging from 6.48 x 10-21 (52-plex) to 4.91 x 10-38 (IISNPs) and exclusion power of 0.9997 (52-plex) and 0.99999997 (IISNPs). In general, ancestry estimates obtained using these sets indicated a high European contribution (higher than 70%) and low Amerindian contribution (less than 10%) in the population sample, while the individual admixture analyses exhibited were highly consistent, with the majority of individuals presenting high European ancestry. The results of the sex markers (Amelogenin, Y-INDEL and DYS391) were in agreement with the reported sexes from sample donors. The allele frequencies and forensic parameters calculated for the STRs revealed high informativeness. The combined match probability and the combined exclusion power were 1.19 x 10-36 and 0.999999999997 respectively. Six of the 29 autosomal STRs presented significant deviations from the HardyWeinberg equilibrium expectations, reflecting possible failures in sequencing and genotyping of these markers

Au cours de ma thèse, j’ai développé et mis en place de nouvelles méthodes utilisant les récentes technologies du séquençage à très haut débit, des outils bioinformatiques et du «reciprocal allele-specifique RNA interference » (rasRNAi) dans l’objectif d’identifier les facteurs génétiques et non génétiques responsables de la résistance du moustique Anopheles gambiae aux parasites du paludisme murin Plasmodium berghei. J’ai mis en place une stratégie d’identification des polymorphismes dans les lignées résistantes et sensibles afin de sélectionner des marqueurs génétiques pour de futures analyses génétiques et lister les gènes polymorphiques. J’ai contribué à l’élaboration de nouvelles sondes ARN double-brin (dsRNAs) allèle spécifique pour la méthode du rasRNAi en identifiant le processus de découpage du dsRNA injecté chez des moustiques par l’analyse des petits ARNs séquencés issus du dsRNA injecté. J’ai élaboré un pipeline pour identifier la composition du microbiote des lignées sensibles et résistantes dans le but de les comparer. / During my PhD, I developed and implemented new methods and tools using the latest technologies of the Next Generation Sequencing, bioinformatics tools and the « reciprocal allele-specific RNA interference » (rasRNAi) method with the aim of identifying genetic and non-genetic factors responsible for the resistance of the mosquito Anopheles gambiae to the mouse malaria parasites Plasmodium berghei. I have implemented a strategy for identifying polymorphisms in the resistant and susceptible lines to (1) select genetic markers for future genetic analysis and (2) list the polymorphicgenes. I contributed to the development of a new allele-specific dsRNA probe for the rasRNAi method by identifying how mosquitoes process the injected dsRNA by the analysis of sequenced small RNAs from the injected dsRNA. I developed a pipeline to identify the microbiota composition in susceptible and resistant lines in order to compare them.

Surdez e perda auditiva são termos utilizados para designar distúrbios da audição, o tipo de deficiência sensorial mais frequente em humanos e decorrente de alterações genéticas em cerca de 50% dos casos. A heterogeneidade de lócus, de alelos e de manifestações fenotípicas na surdez é impressionante. O lócus DFNB1, que contém os genes GJB2 e GJB6, é responsável por cerca de 40% dos casos de surdez não-sindrômica de origem genética, porém, variantes patogênicas em cerca de 150 genes são descritas como causa de surdez, que pode ser sindrômica ou não-sindrômica. Por permitirem o sequenciamento simultâneo de diversos genes em uma mesma análise, as técnicas de sequenciamento de nova geração têm sido empregadas para o diagnóstico molecular de condições geneticamente heterogêneas, incluindo a surdez. O objetivo desse estudo foi contribuir para o estudo da heterogeneidade genética da surdez por meio do sequenciamento de nova geração de um painel com 99 genes relacionados à perda auditiva. Indivíduos não aparentados de 91 famílias brasileiras, com provável causa genética de surdez, foram avaliados com o intuito de identificar as causas moleculares da surdez, detectar novas variantes e promover aconselhamento genético das famílias participantes do estudo. Variantes provavelmente causais foram detectadas em 41 dos 91 probandos analisados (45,1%), dos quais 34 (37,4%) apresentaram variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas. Nos outros 7 casos, foram detectadas variantes de efeito desconhecido com elevado potencial de explicar a perda auditiva dos probandos. As taxas de detecção nos casos de provável surdez sindrômica foram de 44,4% no grupo com suspeita de síndrome de Waardenburg (4 de 9 casos) e de 61,5% no grupo com suspeita de síndrome de Usher (8 de 13 casos). Nos casos de surdez não-sindrômica, as taxas de detecção foram de 53,9% no grupo com provável surdez autossômica dominante, 35,1% no grupo com provável surdez autossômica recessiva e de 45,0 % no grupo com mais de um mecanismo de herança possível. Das 43 variantes classificadas como patogênicas ou provavelmente patogênicas detectadas nesse estudo, 15 nunca haviam sido descritas. Contribuições científicas importantes foram obtidas com a identificação de uma nova variante de perda de função no gene CEACAM16 como causa de surdez não-sindrômica autossômica recessiva e com a confirmação de uma variante no gene MYO3A como causa de surdez não-sindrômica autossômica dominante recém-descrita em famílias brasileiras. Os resultados obtidos permitiram concluir que o sequenciamento de nova geração de paineis multigênicos é uma estratégia eficaz para o estudo da heterogeneidade genética da surdez, contribuindo para a detecção de novas variantes, ampliando o conhecimento científico a respeito dos genes analisados, e para o aconselhamento genético dos indivíduos estudados e seus familiares / Deafness and hearing loss are terms used to describe hearing disorders, the most common type of sensory impairment in humans, which occurs due to genetic alterations in about 50% of cases. The heterogeneity of locus, alleles and phenotypic manifestations of deafness is striking. The DFNB1 locus, which contains the genes GJB2 and GJB6, is responsible for about 40% of cases of non-syndromic genetic hearing loss, but pathogenic variants in near 150 genes are described as causing deafness, which may be syndromic or non-syndromic. By allowing the simultaneous sequencing of several genes in the same analysis, next-generation sequencing techniques have been employed for the molecular diagnosis of genetically heterogeneous conditions, including deafness. The aim of this study was to contribute to the study of the genetic heterogeneity of deafness employing the next-generation sequencing of a panel with 99 genes related to hearing loss. Individuals from 91 unrelated Brazilian families, with a probable genetic cause for deafness, were evaluated with the purpose of identifying the molecular causes of deafness, to detect new variants and to provide genetic counseling to the families enrolled in the study. Probably causal variants were detected in 41 of the 91 probands analyzed (45.1%), of which 34 (37.4%) had pathogenic or likely pathogenic variants. In the other 7 cases, variants of unknown significance with high potential to explain the hearing loss were detected. Detection rates in cases of probable syndromic deafness were 44.4% in the group with suspected Waardenburg syndrome (4 of 9 cases) and 61.5% in the group with suspected Usher syndrome (8 of 13 cases). In cases of non-syndromic deafness, detection rates were 53.9% in the group with probable autosomal dominant inheritance, 35.1% in the group with probable autosomal recessive inheritance and 45.0% in the group with more than one possible mechanism of inheritance. Among the 43 variants classified as pathogenic or probably pathogenic detected in this study, 15 had never been described. Important scientific contributions were obtained such as the identification of a novel loss-of-function variant in the CEACAM16 gene as causing autosomal recessive non-syndromic deafness and the confirmation of a recently described variant in the MYO3A gene as causing autosomal dominant non-syndromic deafness in Brazilian families. The results obtained allowed us to conclude that next-generation sequencing of multigenic panels is an effective strategy for the study of the genetic heterogeneity of deafness, contributing to the detection of new variants, expanding scientific knowledge about the genes analyzed, and also to the genetic counseling of the individuals studied and their relatives

A mastite bovina é considerada a doença de maior impacto nos rebanhos leiteiros, exercendo efeito econômico negativo sobre a produtividade e perdas significativas à indústria de laticínios. Tendo em vista os impactos na sanidade animal e os prejuízos econômicos acarretados, o objetivo deste estudo foi caracterizar de forma mais abrangente a comunidade microbiana presente em rebanhos leiteiros com mastite subclínica utilizado o sequenciamento parcial do gene 16S ribossomal RNA (rRNA). Especificamente, foram caracterizadas as comunidades bacterianas presentes em amostras de leite vindas de três fazendas comerciais, sendo que cada fazenda contribuiu com amostras com alta contagem de células somáticas (CCS > 200.000 cel./mL) e com baixa contagem (CCS < 200.000 cel./mL) perfazendo um total de 57 animais. O DNA total foi extraído e amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores da região V3 e V4 do gene 16S rRNA. O sequenciamento foi realizado utilizando a tecnologia de sequenciamento de nova geração através do equipamento MiSeq (Illumina - San Diego, EUA). Para efeito de comparação, alíquotas de todas as amostras foram destinadas ao cultivo microbiológico para identificação de bactérias causadoras da mastite. Os fragmentos amplicons de todas as amostras foram submetidos a uma série de análises computacionais utilizando o programa QIIME. Após a avaliação adicional das sequências em nível de espécie, verificou-se que em geral as bactérias diagnosticadas por cultura geralmente não corresponderam com as sequências mais abundantes detectadas pelo sequenciamento. A análise da composição da microbiota de amostras de leite provenientes de animais saudáveis revelou a presença de uma grande diversidade de espécies bacterianas, mesmo que nenhuma bactéria tenha sido detectada por técnica de cultura. A espécie bacteriana mais abundante em todas as amostras foi Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus também foi detectada na grande maioria das amostras As diferenças na composição microbiana foram observadas entre as amostras quando a comparação foi feita de forma individual. Estas diferenças foram notórias em composição taxonômica e foram refletidas por intermédio das estimativas de alfa e beta diversidade. Quando a comparação foi realizada por separação de grupos com alta e baixa CCS, essa diferença não foi tão evidente. Com este estudo será possível compreender a diversidade dos microrganismos presentes na glândula mamária de animais saudáveis e com mastite subclínica. Essas informações podem ser úteis podendo contribuir no planejamento de medidas terapêuticas e preventivas mais eficazes da doença. / Bovine mastitis is considered the most impact disease in dairy herds, exerting negative economic effect on productivity and significant losses to the dairy industry. In view of the impact on animal health and carted economic losses, the objective of this study was to characterize more comprehensively the microbial community present in dairy herds with subclinical mastitis using the partial sequencing of 16S ribosomal RNA gene (rRNA). Specifically, the bacterial communities present in samples of milk coming from three commercial farms were identified, and each farm contributed samples with high somatic cell count (SCC> 200,000 cel./mL) and low count (SCC <200,000 cel./ml) for a total of 57 animals. Total DNA was extracted and amplified with primers of the V3 and V4 region of the 16S rRNA gene. Sequencing was performed using the new generation of sequencing technology through MiSeq equipment (Illumina - San Diego, USA). For comparison, aliquots of all samples were intended for microbiological culture for identification of bacteria which cause mastitis. The amplicon fragments of all samples were subjected to a series of computer analyzes using the QIIME program. After further evaluation of the sequences at the species level, it was found that in general the bacteria do not generally diagnosed by culture corresponded to the most abundant sequences identified by sequencing. The analysis of milk samples from microbial composition from healthy animals revealed the presence of a diversity of bacterial species, even though no bacteria have been detected by culture technique. The most abundant bacterial species in all samples was Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus was also detected in most samples differences in microbial composition were found between the samples when a comparison was made individually. These differences were noticeable in taxonomic composition and were reflected by means of the estimates of alpha and beta diversity. When comparison was performed by separation of high and low groups with CCS, this difference was not so evident. This study will be possible to understand the diversity of microorganisms present in the mammary gland of healthy animals and with subclinical mastitis. This information can be useful and can contribute in the planning of more effective therapeutic and preventive measures of the disease.

A Amazônia inclui uma grande proporção da biodiversidade encontrada atualmente na Terra. Apesar disso, nosso conhecimento sobre a biodiversidade Amazônica ainda é limitado, dificultando nosso entendimento dos padrões de diversidade nesta região. Entender os processos que levaram à diversidade encontrada na Amazônia representa um grande desafio para a biologia evolutiva. Este estudo foca em Pachyptera (Bignonieae, Bignoniaceae), um pequeno gênero de lianas neotropicais, centrado na Amazônia. Pachyptera tem uma história taxonômica complicada, incluindo problemas na circunscrição genérica e específica. Este estudo visa: (i) reconstruir o parentesco filogenético entre espécies do gênero, (ii) produzir uma revisão taxonômica, incluindo nova circunscrição genérica e específica, (iii) entender a história biogeográfica do grupo e, (iv) desenvolver marcadores microssatélites (SSRs) para futuros estudos filogeográficos. Em primeiro lugar, reconstruímos a filogenia do gênero usando uma ampla amostragem de taxa e uma combinação de marcadores de cpDNA (ndhF and rpl32-trnL) e nDNA (PepC). Em segundo lugar, analisamos a filogenia de Pachyptera utilizando análises de coalescência (GMYC e *BEAST) e morfologia para esclarecer limites específicos dentro do complexo P. kerere. Em terceiro lugar, produzimos uma filogenia datada de Pachyptera, a qual foi utilizada como base para reconstruir a história biogeográfica do gênero utilizando BSSVS e RASP. Por fim, desenvolvemos SSRs utilizando sequenciamento de próxima geração, os quais serão utilizados para guiar estudos filogeográficos futuros com o grupo. Nosso estudo indica que P. ventricosa é mais proximamente relacionada à Mansoa do que Pachyptera, levando ao reestabelecimento de M. ventricosa. Além disso, nossos estudos moleculares e morfológicos sustentam o reconhecimento de P. kerere var. incarnata como uma espécie separada e a descrição de uma espécie nova (P. linearis). Desta forma, reconhecemos um gênero com cinco espécies: (i) P. aromatica, (ii) P. erythraea, (iii) P. incarnata, (iv) P. kerere, e (v) P. linearis. Estas espécies são tratadas em uma revisão taxonômica do gênero. As análises biogeográficas indicam que Pachyptera surgiu durante o Eoceno Tardio, e diversificou durante o Mioceno, um período de intensas perturbações provocadas na América do Sul (i.e., soerguimento dos Andes, eventos de incursões marinhas, e formação de sistemas florestais secos e úmidos). Vinte-e-um SSRs foram desenvolvidos para Pachptera e servirão como base para estudos filogeográficos futuros com este grupo. Esta dissertação faz parte de um projeto multi-disciplinar que visa compreender a evolução da biota amazônica e seu ambiente (FAPESP 2012/50260-6) / The Amazon houses a large proportion of the overall biodiversity currently available on Earth. Despite that, our knowledge of Amazonian biodiversity is still limited, complicating our understanding of diversity patterns within this region. Understanding the drivers of Amazonian biodiversity represents a major challenge in evolutionary biology. This study focuses on Pachyptera (Bignonieae, Bignoniaceae), a small genus of neotropical lianas centered in the Amazon. Pachyptera has a complicated taxonomic history, including problematic generic and species circumscriptions. This study aims to: (i) reconstruct phylogenetic relationships among species of the genus (ii) produce a taxonomic revision, including clear generic and species circumscriptions, (iii) understand the biogeographic history of the group, and (iv) develop microsatellite markers (SSRs) for future phylogeographic and population genetic studies. First, we inferred phylogenetic relationships within a broad sampling of taxa and a combination of cpDNA (ndhF and rpl32-trnL) and nuclear (PepC) markers. Second, we analyzed the phylogeny of Pachyptera using coalescent approaches (GMYC and *BEAST) and morphology to clarify species limits within the P. kerere species complex. Third, we produced a time-calibrated phylogeny of Pachyptera that was used as basis to reconstruct the biogeographical history of the genus using BSSVS and RASP. Lastly, we developed SSRs using next-generation sequencing (NGS) that will be used to guide future phylogeographic studies within this group. Our study indicates that P. ventricosa is more closely related to Mansoa than Pachyptera, leading to the reestablishment of Mansoa vetricosa. Furthermore, our molecular and morphological analyses support the recognition of P. kerere var. incarnata as a separate species, and the description of a new taxon (P. linearis). As such, we here recognize a genus with five species: (i) P. aromatica, (ii) P. erythraea, (iii) P. incarnata, (iv) P. kerere, and (v) P. linearis. These species are treated in a taxonomic revision of Pachyptera. The biogeographical analyses indicate that Pachyptera originated during the Late Eocene, and diversified during the Miocene, a time of intense perturbations in South America (e.g., uplift of the Andes, marine incursions, and formation of dry and wetland systems). Twenty-one SSRs were developed for P. kerere and will serve as basis for future phylogeographic studies. This dissertation is part of a multidisciplinary project that aims to understand the evolution of the Amazonian biota and its environment (FAPESP 2012/50260-6)

A compensação da dosagem gênica entre fêmeas XX e machos XY em mamíferos é adquirida através de um complexo mecanismo epigenético que resulta na inativação de grande parte de um dos cromossomos X nas células femininas. O processo de inativação do cromossomo X (XCI) se inicia cedo durante a embriogênese, concomitantemente à diferenciação celular, e envolve a aquisição de modificações epigenéticas características do cromossomo X inativo (Xi). Uma estabelecido, o padrão de inativação é estavelmente mantido através de todas as mitoses celulares subsequentes e por toda a vida do organismo (exceto para células germinativas que sofrem reativação do Xi). Os mecanismos envolvidos na iniciação e estabelecimento da XCI foram extensivamente estudados, especialmente em camundongos. Embora algumas características epigenéticas associadas à manutenção da XCI tenham sido descritas, a identidade e modo específico de ação de fatores envolvidos durante essa fase da XCI são aspectos ainda não bem compreendidos. Além disso, o processo de XCI apresenta diferenças importantes entre humanos e camundongos e estudos direcionados para a identificação de novos componentes envolvidos na manutenção da XCI em humanos tornam-se de fundamental importância. Triagens funcionais genômicas por bibliotecas de shRNAs constituem uma ferramenta poderosa para a identificação de genes envolvidos em diferentes mecanismos celulares e vias bioquímicas. Sendo assim, utilizamos essa ferramenta para triar genes envolvidos na manutenção da XCI em humanos. Células somáticas femininas primárias HPRT+/-/HPRT- foram transduzidas com uma biblioteca lentiviral de shRNAs e posteriormente tratadas em meio de cultura contendo a droga HAT para seleção de células HPRT+ nas quais esperava-se que o cromossomo Xi presente tivesse sofrido reativação em decorrência do knockdown de genes envolvidos na manutenção da XCI. Essa estratégia nos permitiu identificar 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da XCI. Esses candidatos deverão ser avaliados individualmente para confirmar seu papel no processo de controle epigenético do cromossomo X / Transcriptional dosage compensation between mammalian XX females and XY males is acquired through a complex epigenetic mechanism that leads to the inactivation of most part of one of the X chromosomes in the female cells. The X chromosome inactivation (XCI) process takes place early during embryogenesis and involves the acquisition of epigenetic modifications that are characteristic of the inactive X chromosome (Xi). Once silencing is established, the inactivation pattern is maintained in through all the subsequent mitosis and the same X chromosome remains stably silenced in all the descendant cells and throughout the life of the organism (except for the germ line cells that undergo X chromosome reactivation). The initiation of XCI has been studied extensively, especially in mice. Although some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have already been described, the identity and specific mode of action of the factors involved in this phase of XCI are largely unknown. Moreover, the XCI process presents important differences between mice and humans, and studies directed to the identification of new players involved in the maintenance of human XCI are fundamentally important. Functional genome-wide screens using multiplex shRNA libraries are a powerful tool for the identification of genes involved in different cellular mechanisms and biochemical pathways. In order to screen for genes involved in the maintenance of XCI in humans, a population of HPRT+/-/HPRT- primary somatic female cells were transduced with a multiplex lentiviral shRNA library and subsequently treated in HAT medium to select for HPRT+ cells in which we expected that the Xi would undergo reactivation as a result of the knockdown of genes involved in the maintenance of XCI. As a result, we identified 20 new candidate genes that could potentially be involved in the maintenance of XCI. These candidates should be individually evaluated in order to confirm their role in the epigenetic control of the X chromosome

A genética forense vem se desenvolvendo cada vez mais, com novas tecnologias e implementação de novos conjuntos de marcadores de DNA com maiores níveis de informatividade. Os marcadores genéticos são amplamente usados na identificação humana, pois permitem distinguir indivíduos com alta acurácia. Duas classes de marcadores muito utilizadas atualmente são os STRs (Short Tandem Repeats) e os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Os STRs são altamente informativos e, portanto, úteis para a prática forense. Kits mais novos como GlobalFiler (Thermo Fisher Scientific) e PowerPlex Fusion System (Promega) apresentam a análise de mais de 20 loci STRs de uma só vez. Já os SNPs, por possuírem sua informatividade mais reduzida (necessita de mais loci analisados), são menos utilizados, porém apresentam vantagem em amostras degradadas de DNA; assim, conjuntos de identificação como o 52-plex desenvolvido pelo consórcio SNPforID e o conjunto IISNPs, vêm sendo estudados em várias populações do mundo. Com o desenvolvimento de técnicas de sequenciamento de nova geração (NGS Next Generation Sequencing) para análise de DNA, a obtenção de perfis de DNA se tornou mais acurada. Algumas plataformas permitem gerar perfis de até 96 indivíduos simultaneamente. Este estudo tem por objetivo principal analisar 171 marcadores genéticos (Amelogenina, Y-INDEL, 30 STRSs e 139 SNPs) em 340 indivíduos miscigenados da região da cidade de Ribeirão Preto (SP) utilizando a plataforma de sequenciamento de nova geração MiSeq Personal Sequencer (Illumina Inc.), bem como calcular as frequências alélicas e genotípicas, verificar a aderência ao equilíbrio de HardyWeinberg e estimar parâmetros forenses para os diferentes conjuntos de marcadores. Análises de ancestralidade foram realizadas para os conjuntos de SNPs. Para o preparo das bibliotecas de amostras a serem sequenciadas, foi utilizado o kit HaloPlex (Agilent Technologies, Inc), onde foram incluídos os marcadores dos kits GlobalFiler e PowerPlex Fusion System, e os SNPs existentes no conjunto do consórcio SNPforID (52-plex) e IISNPs (92 SNPs). De todos os marcadores incluídos no ensaio, apenas um SNP (rs763869) presente no conjunto SNPforID não pôde ser analisado devido a questões técnicas. Dos 139 SNPs analisados apenas seis apresentaram desvios significativos em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg,número este esperado devido ao acaso. Os conjuntos de SNPs apresentam elevada informatividade com Probabilidade de Match de 6,48 x 10-21 (52-plex) a 4,91 x 10-38 (IISNP), e Poder de Exclusão de 0,9997 (52-plex) e 0,99999997 (IISNP). De modo geral, as inferências de ancestralidade obtida utilizando estes conjuntos, indicaram elevada contribuição europeia (superior a 70%) e baixa contribuição ameríndia (inferior a 10%) na população, enquanto que as análises de mistura individual se mostraram consistentes, com a maioria dos indivíduos apresentando elevada ancestralidade europeia. Os resultados dos marcadores relativos ao sexo (Amelogenina, Y-INDEL e DYS391) foram consistentes com o sexo dos doadores das amostras. As frequências alélicas e parâmetros forenses foram calculados para os STRs, revelando uma alta informatividade. A Probabilidade de Match combinada e o Poder de Exclusão combinado foram de 1,19 x 10-36 e 0,999999999997 respectivamente. Dos 29 STRs autossômicos presentes, seis apresentaram desvios ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, refletindo possíveis falhas no sequenciamento e genotipagem destes marcadores / The field of forensic genetics has developed increasingly with the implementation of new sets of DNA markers with higher levels of informativeness. The genetic markers are widely used in human identification as they allow distinguishing individuals with high accuracy. Two of the most commonly used markers are the Short Tandem Repeats (STRs) and the Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Newer kits such as GlobalFiler (Thermo Fisher Scientific) and PowerPlex Fusion System (Promega) can analyze more than 20 STRs loci at once. When comparing with STRs, the SNPs are less informative and many more loci are needed to reach the same informativeness of STR kits. However, they are advantageous when using degraded DNA samples. The identification sets such as the 52-plex developed by the SNPforID Consortium and the IISNPs have been analyzed in many worldwide populations. With the development of next generation sequencing techniques (NGS Next Generation Sequencing), obtaining DNA profiles has become more accurate and some platforms allow generating profiles of up to 96 individuals simultaneously. The main goal of this study is to analyze 171 markers (Amelogenin, Y-INDEL, 30 STRs and 139 SNPs) in 340 admixed individuals from Ribeirão Preto, SP, using the NGS platform MiSeq Personal Sequencer (Illumina Inc.). This will allow the calculation of allele and genotype frequencies, the verification of adherence to Hardy-Weinbergs equilibrium and the estimation of forensic parameters for each set of marker. Ancestry analysis was performed for the sets of SNPs. The HaloPlex kit (Agilent Technologies, Inc) was used for library preparation including the STRs from the kits GlobalFiler and PowerPlex Fusion System and the SNPs from the SNPforID consortium (52-plex) and IISNPs (92 SNPs) identification sets. A single SNP (rs763869) from the SNPforID set was not analyzed due to technical issues. Only six of the 139 analyzed SNPs presented significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium expectations, which is expected by chance alone. The SNPs sets exhibited high informativeness, with matchprobability ranging from 6.48 x 10-21 (52-plex) to 4.91 x 10-38 (IISNPs) and exclusion power of 0.9997 (52-plex) and 0.99999997 (IISNPs). In general, ancestry estimates obtained using these sets indicated a high European contribution (higher than 70%) and low Amerindian contribution (less than 10%) in the population sample, while the individual admixture analyses exhibited were highly consistent, with the majority of individuals presenting high European ancestry. The results of the sex markers (Amelogenin, Y-INDEL and DYS391) were in agreement with the reported sexes from sample donors. The allele frequencies and forensic parameters calculated for the STRs revealed high informativeness. The combined match probability and the combined exclusion power were 1.19 x 10-36 and 0.999999999997 respectively. Six of the 29 autosomal STRs presented significant deviations from the HardyWeinberg equilibrium expectations, reflecting possible failures in sequencing and genotyping of these markers

Le corps humain compte plus de 200 types cellulaires différents possédant une copie identique du génome mais exprimant un ensemble différent de gènes. Le contrôle de l'expression des gènes est assuré par un ensemble de mécanismes de régulation agissant à différentes échelles de temps et d'espace. Plusieurs maladies ont pour cause un dérèglement de ce système, notablement les certains cancers, et de nombreuses applications thérapeutiques, comme la médecine régénérative, reposent sur la compréhension des mécanismes de la régulation géniques. Ce travail de thèse propose, dans une première partie, un algorithme d'annotation (GABI) pour identifier les motifs récurrents dans les données de séquençage haut-débit. La particularité de cet algorithme est de prendre en compte la variabilité observée dans les réplicats des expériences en optimisant le taux de faux positif et de faux négatif, augmentant significativement la fiabilité de l'annotation par rapport à l'état de l'art. L'annotation fournit une information simplifiée et robuste à partir d'un grand ensemble de données. Appliquée à une base de données sur l'activité des régulateurs dans l'hématopoieïse, nous proposons des résultats originaux, en accord avec de précédentes études. La deuxième partie de ce travail s'intéresse à l'organisation 3D du génome, intimement lié à l'expression génique. Elle est accessible grâce à des algorithmes de reconstruction 3D à partir de données de contact entre chromosomes. Nous proposons des améliorations à l'algorithme le plus performant du domaine actuellement, ShRec3D, en permettant d'ajuster la reconstruction en fonction des besoins de l'utilisateur. / The human body has more than 200 different cell types each containing an identical copy of the genome but expressing a different set of genes. The control of gene expression is ensured by a set of regulatory mechanisms acting at different scales of time and space. Several diseases are caused by a disturbance of this system, notably some cancers, and many therapeutic applications, such as regenerative medicine, rely on understanding the mechanisms of gene regulation. This thesis proposes, in a first part, an annotation algorithm (GABI) to identify recurrent patterns in the high-throughput sequencing data. The particularity of this algorithm is to take into account the variability observed in experimental replicates by optimizing the rate of false positive and false negative, increasing significantly the annotation reliability compared to the state of the art. The annotation provides simplified and robust information from a large dataset. Applied to a database of regulators activity in hematopoiesis, we propose original results, in agreement with previous studies. The second part of this work focuses on the 3D organization of the genome, intimately linked to gene expression. This structure is now accessible thanks to 3D reconstruction algorithm from contact data between chromosomes. We offer improvements to the currently most efficient algorithm of the domain, ShRec3D, allowing to adjust the reconstruction according to the user needs.

Next-generation sequencing technology provides high-resolution data for epidemiological surveillance of bacterial pathogens on local and global scales. This approach has been used for many species including Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA). In this thesis I demonstrate the utility of these data for understanding the spread of the globally disseminated clone MRSA ST239. I focus both on local and national-level epidemiology through sequence data of 71 isolates recovered from four hospitals representing three cities in Turkey; Istanbul (x2). Ankara and Izmir. I analyse whole genome sequence data from a further 33 ST239 isolates from global sources. These data were combined with previously published data for phylogenetic analysis based only on the core genome. I demonstrate how transmission events can be inferred from this approach on multiple levels; within hospital, between hospitals and between countries. The data pointed to a European origin of ST239, and independent introductions from Europe to Turkey, South America and East Asia. I also demonstrate how whole genome sequence data can be used to develop bespoke PCR assays, based on phage variation, for rapid local epidemiology. Finally, I consider how the sequence data might be used to explain variation in virulence potential, and describe the distribution and transfer of an important phage-borne virulence determinant, sasX, within Europe. Finally, I identified a single isolate with very strong biofilm forming ability likely due to the over-expression of the important adhesion SasG.

Orientador: Camila Marconi / Resumo: A microbiota vaginal normal é composta predominantemente por Lactobacillus spp. que conferem proteção contra infecções por patógenos, por meio da produção de ácido lático, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas. Diferentemente, a vaginose bacteriana (VB) é caracterizada pela substituição da microbiota de Lactobacillus spp. por bactérias anaeróbias em sua maioria. A VB é a alteração de microbiota vaginal mais comum em mulheres de idade reprodutiva, acometendo aproximadamente 30% dessa população. Além disso, a VB é fator de risco para aquisição de infecções sexualmente transmissíveis (IST). Diversas características da população já foram associadas à VB, como idade, etnia, comportamentos sexual e de higiene. Entretanto, a real composição da microbiota vaginal só foi possível em 2011 com estudo utilizando o sequenciamento de nova geração do gene bacteriano RNA ribossômico 16S. Foi demonstrado que o microbioma vaginal pode ser classificado em cinco tipos de comunidades bacterianas (community-state types, CST). Quatro dessas CSTs tem predomínio de Lactobacillus: L. crispatus (CSTI), L. gasseri (CST II), L. iners (CST III) e L. jensenii (CST V), enquanto que a CST IV apresenta grande diversidade bacteriana e engloba a maioria dos casos de VB. Apesar de quatro CSTs apresentarem predomínio de Lactobacillus, o papel protetor da CST III, dominada por L. iners, contra aquisição de IST tem se demonstrado menor que os demais. Embora os estudos de microbioma tenham possibilitado conhecer me... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The normal vaginal microbiota is predominantly composed of Lactobacillus spp. which confer protection against pathogen infections through the production of lactic acid, hydrogen peroxide and bacteriocins. Differently, bacterial vaginosis (BV) is characterized by the replacement of the microbiota of Lactobacillus spp. by anaerobic bacteria for the most part. BV is the most common vaginal microbiota alteration in women of reproductive age, affecting approximately 30% of this population. In addition, BV is a risk factor for the acquisition of sexually transmitted infections (STIs). Several characteristics of the population have already been associated with BV, such as age, ethnicity, sexual and hygiene behaviors. However, the actual composition of the vaginal microbiota was only possible in 2011 with study using the new generation sequencing of the bacterial 16S ribosomal RNA gene. It has been shown that the vaginal microbiome can be classified into five types of community-state types (CST). Four of these CSTs have a predominance of Lactobacillus: L. crispatus (CSTI), L. gasseri (CST II), L. iners (CST III) and L. jensenii (CST V), while CST IV shows great bacterial diversity and involve most cases of BV. Although four CSTs have a predominance of Lactobacillus, the protective role of CST III, dominated by L. iners, against IST acquisition has been shown to be lower than the others are. Although microbiome studies have made it possible to know better the relationship between bact... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre