Rayons ionisants, dessiccation, ou encore métabolites secondaires exogènes sont autant de facteurs qui peuvent engendrer des dommages à l’ADN chez les bactéries du sol, notamment en provoquant la formation de cassures double-brin (DSB), préjudice majeur pour une cellule. Chez les procaryotes, l’évolution a sélectionné deux principaux mécanismes de réparation des DSB, à savoir la recombinaison homologue (RH) et le non-homologous end joining (NHEJ). La RH est un mécanisme quasi-ubiquiste dans le monde bactérien qui repose sur l’utilisation d’une copie intacte de la molécule endommagée comme matrice pour la réparation de la DSB. Contrairement à la RH, le NHEJ n’est présent que chez 20 à 25% des bactéries et est considéré comme un mécanisme mutagène puisque la réparation de la DSB se fait sans matrice homologue et peut entrainer l’ajout ou la délétion de nucléotides au site de cassure. Chez la bactérie modèle Mycobacterium, seuls deux acteurs sont nécessaires pour la réparation par NHEJ. Ainsi, un dimère de protéine Ku se fixe sur la cassure puis recrute la protéine multifonctionnelle LigD, qui catalyse le traitement puis la ligation des extrémités grâce à ses domaines polymérase, nucléase et ligase. Les mécanismes de réparation des DSB chez les Streptomyces étaient peu connus à l’initiation de ce travail. Cette bactérie présente des caractéristiques génomiques remarquables avec notamment un chromosome linéaire de grande taille (6 à 12 Mb). En ce qui concerne la RH, nous avons focalisé nos recherches sur les étapes tardives (post-synaptiques) et étudié le rôle du complexe RuvABC et de RecG impliqués chez Escherichia coli dans la migration de la croix de Holliday et de sa résolution. La construction de mutants simples et multiples a montré que bien que les gènes codant ces protéines soient très conservés chez les Streptomyces, leur déficience ne se traduit chez Streptomyces ambofaciens que par une faible baisse de la recombinaison suite à un événement de conjugaison. Aucune baisse de l’efficacité de recombinaison intrachromosomique n’a en revanche été observée. Ces résultats suggèrent que des acteurs alternatifs majeurs sont encore à découvrir chez les Streptomyces. Le décryptage du mécanisme de NHEJ chez S. ambofaciens constitue une première dans ce genre bactérien. Une étude génomique exhaustive a permis de révéler la très grande diversité du nombre d’acteurs potentiels de ce mécanisme (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) et de l’organisation des gènes qui les codent.. L’analyse fonctionnelle a révélé que l’ensemble des acteurs étaient impliqués dans la réponse à l’exposition à un faisceau d’électrons accélérés, connus pour induire, entre autre, la formation de DSB. La génération de DSB, par coupure endonucléasique I-SceI, a par ailleurs permis de mettre en évidence au niveau moléculaire des réparations de type NHEJ (délétions ou insertions de quelques nucléotides, intégration de fragments d’ADN). Les cassures dans les régions terminales du chromosome sont accompagnées de grandes délétions (jusqu’à 2,1 Mb) et de réarrangements de grande ampleur incluant circularisations du chromosome et amplifications d’ADN. Les conséquences de la réparation de DSB chez S. ambofaciens sont en tous points similaires aux réarrangements observés spontanément ou par comparaison des génomes des espèces types. Ainsi, il est possible de lier la plasticité du génome à la réparation de DSB. En outre, l’intégration de matériel génétique exogène serait favorisée au cours de la réparation NHEJ ce qui donnerait à ce système de réparation une place importante dans le processus de transfert horizontal, mécanisme d’évolution majeur chez les bactéries / Ionizing radiation, desiccation or exogenous secondary metabolites are all factors that can cause DNA damage in soil bacteria, especially by triggering double strand breaks (DSB), the most detrimental harm for the cell. In prokaryotes, evolution selected two main DSB repair pathways, namely homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). HR is almost ubiquitous in bacteria and relies on an intact copy of the damaged DNA molecule as a template for DSB repair. In contrast to HR, NHEJ is only present in 20 to 25% of bacteria and is considered as a mutagenic pathway since DSB repair is performed without the need of any template and can lead to nucleotide addition or deletion at DSB site. In the bacterial model Mycobacterium, two partners are sufficient for a functional NHEJ pathway. Thus, Ku protein dimer recognizes and binds the DSB and then recruits the multifunctional LigD protein for extremities treatment and ligation thanks to its polymerase, nuclease and ligase domains. At the beginning of this work, few informations on DSB repair in Streptomyces were available. This bacteria exhibits remarkable genomic features including a large linear chromosome (6 to 12 Mb). Regarding HR, we focused on the late stage (post-synaptic step) in studying the role of RuvABC complex and RecG, involved in branch migration and Holliday junction resolution in E. coli. Construction of single and multiple mutants showed that although the genes encoding these proteins are highly conserved in Streptomyces, their deficiency in Streptomyces ambofaciens only results in a mild decrease of recombination after conjugation events. Besides, no decrease of intrachromosomal recombination efficiency could be observed. These results suggest that major alternative factors are still to be discovered in Streptomyces. This work was also the first occasion to decipher a NHEJ pathway in Streptomyces. An exhaustive genomic study revealed a great diversity in the number of factors potentially implicated in this pathway (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) and in the organization of their encoding genes. Functional analyses revealed that all the factors, whatever they are conserved or not between species, were involved in the response to electron beam exposure, known to induce, amongst other things, DSB formation. Generation of DSB by I-SceI endonuclease cleavage was also used to evidence at a molecular level NHEJ type DSB repair (deletions or insertions of several nucleotides, integration of DNA fragments). Targeted breaks in the terminal regions of the chromosome were accompanied by large deletions (up to 2.1 Mb) and major rearrangements including chromosome circularizations and DNA amplifications. Consequences of DSB repair in S. ambofaciens are in all points similar to chromosome rearrangements observed spontaneously or by comparing genomes of different species. Thus, it is possible to link the genome plasticity to DSB repair. In addition, the integration of exogenous genetic material would be favoured during NHEJ repair which would give this repair system a major role in the horizontal transfer process, known to be a main evolution mechanism in bacteria

SETMAR est un gène chimérique constitué d’un domaine SET (codant des fonctions d’histone méthylase) et du domaine MAR (ayant conservé certaines fonctions de la transposase HsMAR1). Des études ont montré que les deux domaines sont biologiquement actifs et sont impliqués dans la stabilité et/ou dans la régulation de l’expression du génome humain. La littérature suggère que l’expression de SETMAR est plus forte dans les cellules cancéreuses que dans les cellules saines. Notre hypothèse de travail est que la protéine SETMAR est surexprimée en conditions pathologiques, permettant aux cellules de franchir les points de contrôle du cycle cellulaire, contribuant ainsi à augmenter l’instabilité génétique. Notre objectif est d’étudier la régulation de l’expression de SETMAR et son implication dans l’oncogenèse, gliale en particulier. / SETMAR is a chimeric gene consisting of a SET domain (encoding methylase histone functions) and a MAR domain (having retained some of the of the HsMAR1 transposase functions). Studies have shown that the two domains are biologically active and are involved in the stability and / or in the regulation of the human genome expression. The literature suggests that SETMAR expression is higher in cancer cells than in normal cells. Our working hypothesis is that SETMAR protein is overexpressed in pathological conditions, allowing cells to overcome the cellular cycle checkpoints, helping to increase the genetic instability. Our goal is to study the regulation of the SETMAR expression and its involvement in oncogenesis, glial in particular.

Les cassures double brin de l’ADN sont des dommages pouvant engendrer la mort cellulaire. Deux mécanismes majeurs sont impliqués dans leur réparation chez les bactéries : la recombinaison homologue et le Non-Homologous End Joining (NHEJ). Streptomyces est une bactérie modèle pour étudier l'impact relatif des mécanismes de recombinaison sur la structure du génome et son évolution ; le chromosome est en effet caractérisé par sa linéarité, son organisation génétique compartimentée et sa plasticité génomique remarquable. L'objectif de cette recherche est d'identifier les acteurs impliqués dans les mécanismes de réparation des cassures double brin qui restent inconnus chez Streptomyces à ce jour. Concernant la recombinaison homologue, la première étape consiste en une maturation des extrémités d’ADN générées par la cassure. Cette première étape est assurée par un complexe à activité hélicase-nuclease : RecBCD (chez Escherichia coli), AddAB (chez Bacillus subtilis) ou AdnAB (chez les mycobactéries). Une analyse in silico des génomes disponibles de Streptomyces a permis d’identifier chez ces organismes, deux gènes conservés et adjacents, nommés adnA et adnB en raison de leur homologie avec les gènes adnAB récemment identifiés chez les mycobactéries. Les tentatives visant à déléter ces gènes chez Streptomyces ambofaciens et Streptomyces coelicolor ont été infructueuses. Cependant, le fait que leur délétion soit rendue possible par l’ajout d’une copie ectopique du locus sauvage nous a amené à conclure au caractère essentiel d’adnA et adnB chez Streptomyces. La trans-complémentation d’un mutant [delta]recB d’E. coli par le locus adnAB de S. ambofaciens restaure l’activité nucléase cellulaire et la survie en présence ou non d’agent génotoxique, suggérant qu’adnAB code l’homologue fonctionnel de RecBCD d’E. coli. Le rôle central d’adnAB dans la recombinaison homologue et la réplication est discuté. Le mécanisme NHEJ montre une distribution sporadique chez les bactéries et implique les deux protéines Ku et LigD. La protéine Ku se fixe sur les extrémités de l’ADN et recrute la ligase LigD. Cette dernière est une protéine multifonctionnelle présentant, outre une activité ligase, une activité polymérase et parfois une activité nucléase. L’analyse des génomes de Streptomyces a révélé un nombre variable d’homologues de ku (1-3) et d’homologues codant pour l’une ou l’autre des trois activités de LigD. Ces différents gènes définissent deux loci conservés entre espèces de Streptomyces. Chez S. ambofaciens, trois homologues de ku (nommés kuA, kuB et kuC) et deux ligases ATP-dépendantes (nommés ligC et ligD) ont été identifiés. L’exposition de souches déficientes pour ces différents gènes aux agents endommageant l’ADN (la mitomycine C, l’irradiation par faisceau d’électrons) a démontré l’implication de kuA et ligC, deux acteurs conservés, mais aussi des gènes variables kuC et ligD, dans la réparation de l’ADN. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour comprendre le rôle du NHEJ dans l'évolution du génome et la biologie Streptomyces. / Double strand breaks (DSB) constitute the most deleterious form of DNA damage that a bacterial cell can encounter. Two major pathways can carry out DSB repair in bacteria: homologous recombination and Non-Homologous End Joining (NHEJ). Streptomyces is a model bacterium to explore the relative impact of these recombination mechanisms on genome structure and evolution; the chromosome is indeed typified by its linearity, its compartmentalized genetic organization and its remarkable genomic plasticity. The objective of this research is to identify actors involved in DSB repair mechanisms which remain mostly elusive in Streptomyces up to now. The first step of DSB repair by homologous recombination is the resection of broken DNA ends by a multisubunit helicase-nuclease complex exemplified by Escherichia coli RecBCD, Bacillus subtilis AddAB and Mycobacterium tuberculosis AdnAB. In silico analysis of Streptomyces genomes allowed to identify homologues for adnA and adnB which constitute a highly conserved locus within the genus. Attempts to disrupt these two genes were unsuccessful in Streptomyces ambofaciens as well as in Streptomyces coelicolor, unless an extra copy of adnAB was inserted in the chromosome. This indicates that AdnA and AdnB are both essential for Streptomyces growth. Complementation of an E. coli [delta]recB mutant by S. ambofaciens adnAB locus restored nuclease activity and cell survival in the presence or absence of DNA damaging agent, strongly suggesting that Streptomyces adnAB encodes a functional homologue of E. coli RecBCD. The key role of adnAB in homologous recombination and DNA replication is discussed. The NHEJ mechanism shows a sporadic distribution in bacteria and is known to involve the two proteins Ku and LigD. The Ku protein binds to the ends of the broken DNA and recruits the ATP-dependent ligase LigD which is a multifunctional protein carrying ligase, polymerase and sometimes nuclease activity. In silico analysis of Streptomyces genomes revealed a complex organization with a variable number of ku homologues (1 to 3) and of homologues encoding one of the three distinct LigD activities. These homologues define two conserved loci. S. ambofaciens possesses 3 ku (named kuA, kuB and kuC) and 2 ATP-dependent ligases (named ligC and ligD). Exposure to DNA damaging agents (mitomycin C, electron beam irradiation) of mutant strains got involved kuA and ligC, two conserved actors, but also variable genes such as kuC and ligD in DNA repair. These results open up new prospects to understand the role of NHEJ in the biology and genome evolution of Streptomyces.

Chez les mammifères, la réparation des CDBs par la voie NHEJ (Non Homologous End Joining) implique plusieurs complexes multi-protéines : (i) de reconnaissance (ADN-Ku70/Ku80), (ii) de maturation et (iii) de ligation comprenant XRCC4, XLF et ligase IV. Si les protéines impliquées dans le NHEJ sont connues, leurs propriétés structurales et fonctionnelles le sont moins. Au cours de ma thèse, j’ai combiné des approches biochimiques, de Microscopies Electronique et à Force Atomique, pour caractériser les propriétés de XRCC4, de XLF et leurs interactions avec le complexe de reconnaissance en particulier Ku. J’ai montré que la protéine complète XRCC4 est capable de polymériser et former des filaments alors qu’elle ne peut pas en faire en absence de la région C-terminale. Par Microscopies Electronique et à Force Atomique; nous avons montré que le filament XRCC4 forme une structure hélicoidale de chiralité gauche. XLF seule ne forme pas de filament mais peut être incorporé dans le filament XRCC4, ce que nous avons montré par immunomarquage. L’analyse d’images réalisé en collaboration et avec l’algorithme d’Edward Egelman (Université de Virginie-USA) a permis d’obtenir une reconstruction 3 D du filament XRCC4. Il est composé de 2 filaments enroulés l’un autour de l'autre avec un pas de 54 nm. Des Etudes sont en cours afin d’obtenir une structure 3D en CryoEM à haute résolution. L’étude des propriétés physicochimiques de l’assemblage du filament en fonction de la concentration, la température et le temps d’incubation a permis de montrer la dynamique du filament avec une stabilisation à basse température, et une concentration située entre 50 et 250 nM. L’ADN avec ou sans extrémités interagit avec les filaments. Cette interaction stabilise et promeut l’extension du filament. L’incorporation de XLF stabilise aussi le filament XRCC4. L’analyse des complexes formés entre l’ADN et XRCC4 ou XLF à l’état oligomérique montre des événements de pontage intra ou intermoléculaires. Parallèlement, nous avons étudié les propriétés de reconnaissance de l’ADN par l’hétérodimère Ku70/Ku80 et avons montré que le domaine KBM de XLF interagit avec Ku80 au sein de l’hétérodimère. En conclusion, nous montrons que le filament XRCC4 pourrait jouer un rôle d’architecture en maintenant les extrémités physiquement proches. Le recrutement de XLF dans le filament XRCC4 permettrait d’assembler le complexe de ligation avec le complexe de reconnaissance grâce aux interactions entre Ku et XLF. / In mammals, DSBs repair by the Non Homologous End Joining (NHEJ) pathway involves several multi-protein complexes : (i) the recognition complex (the Ku70 / Ku80 heterodimer), (ii) the maturation complex and (iii) the ligation complex comprising XRCC4, XLF, PAXX and ligase IV. If the proteins involved in NHEJ are identified and characterized, their structural and functional properties are often poorly understood. During my thesis I combined biochemical approaches, and molecular microscopies (Electron Microscopy and Atomic Force Microscopy), to characterize the properties of XRCC4, XLF and their interactions with the recognition complex (Ku-DNA). I have shown that the full length XRCC4 forms oligomers in solution (dimers and tetramers) and it polymerize into filaments whereas it can’t do it when the C-terminal region is absent. We initially characterized the structure of this filament in Electron Microscopy and Atomic Force Microscopy. XRCC4 filament forms a helicoidal structure of left chirality. XLF alone does not forms a filament but can be incorporated into the XRCC4 filament, which we have shown by immunostaining with gold beads. In collaboration with Edward Egelman (University of Virginia-USA), the image analysis performed using his algorithm allowed us to obtain a 3D reconstruction of the XRCC4 filament. It consists of 2 filaments wound around each other in a helical manner with a pitch of 54 nm. Studies in CryoEM are in progress to obtain a 3D high resolution structure. The study of the physicochemical properties of the filament assembly as a function of the concentration, the temperature and the incubation time allowed to show the dynamics of the filament with stabilization at low temperature, and a concentration between 50 and 250 nM. DNA with or without ends interacts with the filaments. This interaction stabilizes and promotes the extension of the filament. Similarly, incorporation of XLF stabilizes the Xrcc4 filament. Analysis of complexes formed between DNA and XRCC4 or XLF in the oligomeric state shows intra- or intermolecular bridging events. In parallel, we have studied the DNA recognition properties of the Ku70/Ku80 heterodimer and we have shown that KBM domain of XLF interacts with Ku80 within the heterodimer. In conclusion, we show that the XRCC4 filament could play an architectural role favoring repair events by keeping the ends physically close. The recruitment of XLF into XRCC4 filaments ans its interaction with Ku allow the link between ligation and recognition complexes.

Au cours de son cycle sexuel, le cilié Paramecium tetraurelia procède à de massifs réarrangements programmés de son génome (RPG). Ils consistent, entre autres choses, en l’excision de 45 000 séquences précisément délimitées, appelées IES (Internal Eliminated Sequences). La transposase domestiquée Piggymac (Pgm) introduit les cassures double-brin (CDB) à l’extrémité des IES. La réparation très précise de ces dommages est réalisée par la voie de réparation des extrémités non-homologues (NHEJ). Un des acteurs de cette voie est l’hétérodimère Ku70/Ku80. Suite à des duplications globales du génome, la paramécie possède trois gènes KU80, Un seul de ces gènes est induit lors des RPG (KU80c) et une expérience d’ARN interférence (ARNi) contre KU80c montre une complète inhibition de l’introduction des CDB. De plus, des expériences de Co-IP en système hétérologue montrent que Ku70/Ku80c interagit avec Pgm. Ces résultats prouvent le rôle essentiel de Ku dans l’introduction des CDB lors des RPG et soulèvent la question du mécanisme impliqué. Au cours de ma thèse j’ai caractérisé le couplage entre Ku et Pgm en analysant des expériences d’immunofluorescence avec ou sans pré-extraction, permettant de déterminer les interdépendances de ces protéines pour leur localisation et pour leur stabilité nucléaire. Ces approches ont permis de démontrer que Pgm requiert la présence de Ku pour être stablement localisé dans les noyaux lors des RPG. Ku80c partage 74% de sa séquence protéique avec Ku80a. Des expériences de complémentations fonctionnelles surexprimant Ku80a lors des RPG ont montré que Ku80a n’est pas capable ni de se localiser stablement dans les noyaux ni de participer à la stabilisation nucléaire de Pgm. De plus, les RPG sont inhibés. Ces résultats montrent que Ku80c s’est spécialisé dans le couplage avec Pgm pour l’introduction des CDB lors des RPG. L’utilisation de protéines chimériques a permis de déterminer que la spécialisation de Ku80c est portée par son domaine N-terminal ∝-β. / During its sexual cycle, the ciliate Paramecium tetraurelia undergoes massive Programmed Genome Rearrangements (PGR). They consist, among others, in excision of 45,000 precisely delimited sequences, called IES (Internal Eliminated Sequences). A domesticated transposase, PiggyMac (Pgm), introduces double-strand DNA breaks (DSB) at IES ends. The Non Homologous End Joining pathway (NHEJ) handles highly precise repair of DSB. One of the actors of this pathway is the heterodimer Ku70/Ku80. In P. tetraurelia, the KU80 gene is present in three paralogous copies. Only KU80c is specifically expressed during PGR and RNA interferences against KU80c showed a complete inhibition of DNA cleavage. Furthermore, a Co-IP experiment in a heterologous system showed that both Ku70/Ku80c interact with Pgm. These results provide evidence that Ku is an essential partner of Pgm for DSB introduction; raising the question of the activating mechanism involved. During my PhD, I characterized the coupling between Ku and Pgm by analyzing immunofluorescence experiments, with or without pre-extraction, allowing the determination of inter-dependencies between those proteins for their nuclear localization and stability. Those methods demonstrated that Pgm requires the presence of Ku for a stable nuclear localization during the PGR. Ku80c shares 74% of the protein sequence with Ku80a. Functional complementation assays overexpressing Ku80a during the PGR showed that Ku80a is not capable to stably localize in nuclei nor to participate in Pgm nuclear stability. Furthermore, PGR are inhibited. Those results show that Ku80c has specialized for the DSB introduction during PGR. The use of chimeric proteins allowed to determine that Ku80c specialization was carried out by its N terminal domain.

Clustered damage to DNA is a signature mark of radiation-induced damage, which involves damage to the nucleobases and/or DNA backbone. Double-strand breaks created by damaging agents are detrimental to cell survival leading to chromosomal translocations. Normal cells employ Non-homologous end-joining because of its faster kinetics, to suppress chromosomal translocations. However, the presence of complex DNA ends constitutes a significant challenge to NHEJ. Location of Thymine glycol (Tg) at DSB ends was a potential hindrance to end joining. The substrate with Tg at the third position (Tg3) from the DSB joined better than when present at the fifth position (Tg5). However, hNTH1 assay showed Tg5 to be a better substrate than Tg3 for BER, potentially explaining the increased Tg removal and decreased end joining of Tg5 in extracts. Nonetheless, there appeared to be no preference in the susceptibility of 5’-Tg substrates with Tg at the second and third positions from DSB ends. Polynucleotide kinase phosphatase is crucial in restoring the 3′ hydroxyl, and 5′ phosphate ends at strand breaks. No other enzyme is known to possess PNKP’s activity in mammalian cells at DSBs. Experiments done with PNKP knockout cells have shown some activity similar to PNKP, which appeared to be a part of NHEJ and was not pharmacologically inhibited by PNKP inhibitor. Additionally, core NHEJ factors XRCC4 and XLF influenced the activities of PNKP. Overall, these experiments suggest that Tg repair is dependent on the position from DSB and an alternative enzyme processes 3′- PO, and 5′-OH ends.

En réponse aux dommages de son génome, le choix par la cellule de la voie de réparation de l'ADN est un crucial par ses conséquences en termes de mutagénèse et de survie. Pour faire face aux cassures double-brin de l'ADN (CDB), les cellules humaines possèdent deux voies principales qui consistent soit à rejoindre les extrémités de la cassure par jonction d'extrémités non-homologues (voie conventionnelle C-NHEJ), soit à reconstituer par recombinaison homologue la séquence clivée en copiant son double non endommagé présent après la réplication (voie RH). La RH nécessite de dégrader l'un des brins d'ADN de part et d'autre de la cassure. Cette dégradation produit de courts fragments d'ADN simple-brin, connus pour aider à signaler le dommage à la cellule. Dans ce travail, nous avons évalué directement l'effet de ces fragments d'ADN simple brin sur la réparation des CDB dans des expériences biochimiques et cellulaires. Nous montrons que de courts fragments d'ADN simple-brin inhibent la C-NHEJ en inactivant sa protéine clef Ku, tout en stimulant une forme minoritaire de jonction des cassures dite NHEJ alternative (A-EJ). Ces travaux permettent de mieux comprendre comment la réparation par la voie peu connue A-EJ peut s'exprimer dans les cellules mais aussi d'envisager des stratégies pour piloter la réponse des cellules cancéreuses aux thérapies induisant des CDB. / In response to DNA damage, the choice made by the cells between DNA repair mechanisms is crucial for mutagenic and survival outcomes. In humans, DNA double-strand breaks are repaired by two mutually-exclusive mechanisms, homologous recombination or end-joining. Among end-joining mechanisms, the main process is classical non-homologous end-joining (C-NHEJ) which relies on Ku binding to DNA ends and DNA Ligase IV (Lig4)-mediated ligation. Mostly under Ku- or Lig4-defective conditions, an alternative end-joining process (A-EJ) can operate and exhibits a trend toward microhomology usage at the break junction. Homologous recombination relies on an initial MRN-dependent nucleolytic degradation of one strand at DNA ends. This process, named DNA resection generates 3' single-stranded tails necessary for homologous pairing with the sister chromatid. While it is believed from the current literature that the balance between joining and recombination processes at DSBs ends is mainly dependent on the initiation of resection, it has also been shown that MRN activity can generate short single-stranded DNA oligonucleotides (ssO) that may also be implicated in repair regulation. In this work, we evaluate the effect of ssO on end-joining at DSB sites both in vitro and in cells. Under both conditions, we report that ssO inhibit C-NHEJ through binding to Ku and favor repair by the Lig4-independent microhomology-mediated A-EJ process. Our data bring new clues in the understanding of the cellular response to DNA double-strand breaks.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第24805号 / 医科博第150号 / 新制||医科||10(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 上野 英樹, 教授 濵﨑 洋子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La leucémie aiguë myéloïde est une hémopathie maligne génétiquement hétérogène caractérisée par de fréquents réarrangements impliquant la bande chromosomique 21q22 et le gène RUNX1. Dans ce groupe d’anomalies, les translocations t(8;21)(q22;q22) et t(3;21)(q26;q22), associées respectivement à un pronostic favorable et défavorable, sont les mieux étudiées. Or, plus de la moitié des réarrangements ciblant RUNX1 ne sont toujours pas caractérisés au niveau clinique et moléculaire. Les principaux objectifs de cette thèse sont de caractériser quatre nouvelles translocations ciblant RUNX1 et d’étudier la dérégulation transcriptionnelle associée à ces anomalies au niveau de cibles plus spécifiques ayant un rôle dans l’auto-renouvellement ou dans la différenciation hématopoïétique. À l’aide des techniques de cytogénétique et de biologie moléculaire, deux nouveaux partenaires de RUNX1, soit CLCA2 et SV2B, ont été identifiés au sein des t(1;21)(p22.3;q22) et t(15;21)(q26.1;q22) et la récurrence des partenaires USP42 et TRPS1 a été démontrée suite à l’étude des t(7;21)(p22.1;q22) et t(8;21)(q23.3;q22). Ce travail a permis de confirmer l’existence de divers modes de dérégulation de RUNX1 dans les leucémies aiguës. L’expression présumée de protéines chimériques et/ou d’isoformes tronquées de RUNX1, un dosage aberrant des transcrits de RUNX1 et la surexpression des gènes partenaires sont des conséquences révélées par l’étude de ces fusions. Le séquençage et l’analyse des jonctions génomiques des fusions récurrentes RUNX1-USP42/USP42-RUNX1 et RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 ont démontré la présence de signatures moléculaires caractéristiques du mode de recombinaison non-homologue de type NHEJ. En raison de la structure et de la composition différente des jonctions, l’implication de composantes distinctes du mécanisme NHEJ a été proposée. Enfin, des analyses par PCR quantitative en temps réel nous ont permis de démontrer l’existence de cibles de dérégulation partagées par les fusions récurrentes et plus rares de RUNX1. Nous avons démontré que CEBPA est moins exprimé dans la majorité des spécimens étudiés présentant une fusion de RUNX1 par rapport aux spécimens avec un caryotype normal alors que JUP, une composante effectrice de la voie Wnt, est plutôt surexprimé. Malgré l’activation transcriptionnelle de JUP dans l’ensemble de ces spécimens, certaines cibles de la voie Wnt telles que CCND1 et MYC sont différemment exprimées dans ces cellules, appuyant l’hétérogénéité décrite dans ce groupe de leucémies. Malgré l’implication de partenaires variés, nos données d’expression démontrent que les chimères et les protéines tronquées de RUNX1 partagent des cibles communes d’activation et de répression transcriptionnelle et établissent, pour la première fois, des évidences moléculaires suggérant l’existence de similitudes entre la fusion récurrente RUNX1-RUNX1T1 et quatre fusions plus rares de RUNX1. Puisque des rechutes surviennent fréquemment dans ce groupe génétique, l’inhibition de JUP pourrait être une option thérapeutique intéressante et ceci est appuyé par les bénéfices observés lors de l’inhibition de la voie Wnt dans d’autres groupes génétiques de leucémies aiguës. / Acute myeloid leukemia (AML) is a genetically heterogeneous disease characterized by frequent rearrangements of the RUNX1 gene located at chromosomal band 21q22. In this subtype of leukemias, t(8;21)(q22;q22) and t(3;21)(q26;q22) translocations are among the most studied rearrangements, being respectively associated with a favourable and poor prognosis. However, approximately half of RUNX1 translocations remain uncharacterized at the clinical and molecular levels at the present time. The main objectives of this thesis are to characterize four novel RUNX1 translocations in adult patients with acute leukemias and to study the expression profiles of specific transcriptional targets of RUNX1 fusions involved in self-renewal or differentiation of hematopoietic cells. Using molecular techniques, we identified CLCA2 and SV2B genes as novel fusion partners of RUNX1 in t(1;21)(p22;q22) and t(15;21)(q26;q22) translocations. We also described the recurrence of the USP42 and TRPS1 genes involved in t(7;21)(p22;q22) and t(8;21)(q23.3;q22) translocations. Chimeric fusion proteins, truncated isoforms of RUNX1, alteration of RUNX1 transcripts expression and overexpression of the fusion partner were possible outcomes of these various fusions, thus demonstrating the diversity of RUNX1 alterations in acute leukemias. Genomic breakpoints of the recurrent RUNX1-UPS42/USP42-RUNX1 and RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 fusions were cloned and analyzed revealing typical signatures of the non-homologous end joining recombination mechanism at fusion junctions. Since variation in the structure and composition of these junctions was observed, we proposed that distinct cellular machineries would be involved in the genesis of these abnormalities. Quantitative real-time PCR was performed on primary leukemic cells expressing these rare RUNX1 fusions. We demonstrated, for the first time, that similar downregulation of CEBPA and upregulation of JUP, an effector of the Wnt pathway, are detected in most samples studied presenting either recurrent or rare RUNX1 fusions. Despite an overexpression of JUP detected in each RUNX1 positive sample studied, other targets of the Wnt pathway like CCND1 and MYC genes were differently expressed in these cells, thus confirming the heterogeneity of this group of leukemias. Our expression data show that similar transcriptional targets, activated or repressed, are detected in cells expressing either chimeric or truncated RUNX1 proteins and establish the first molecular evidences suggesting that the recurrent RUNX1-RUNX1T1 and four rare RUNX1 fusions share common molecular deregulations. As relapse frequently occurs in RUNX1 positive leukemias, JUP overexpression could be of particular interest with regard to targeted-therapy, as demonstrated by previous work showing potential benefits of inhibiting the Wnt pathway in other genetic groups of acute leukemias.

La leucémie aiguë myéloïde est une hémopathie maligne génétiquement hétérogène caractérisée par de fréquents réarrangements impliquant la bande chromosomique 21q22 et le gène RUNX1. Dans ce groupe d’anomalies, les translocations t(8;21)(q22;q22) et t(3;21)(q26;q22), associées respectivement à un pronostic favorable et défavorable, sont les mieux étudiées. Or, plus de la moitié des réarrangements ciblant RUNX1 ne sont toujours pas caractérisés au niveau clinique et moléculaire. Les principaux objectifs de cette thèse sont de caractériser quatre nouvelles translocations ciblant RUNX1 et d’étudier la dérégulation transcriptionnelle associée à ces anomalies au niveau de cibles plus spécifiques ayant un rôle dans l’auto-renouvellement ou dans la différenciation hématopoïétique. À l’aide des techniques de cytogénétique et de biologie moléculaire, deux nouveaux partenaires de RUNX1, soit CLCA2 et SV2B, ont été identifiés au sein des t(1;21)(p22.3;q22) et t(15;21)(q26.1;q22) et la récurrence des partenaires USP42 et TRPS1 a été démontrée suite à l’étude des t(7;21)(p22.1;q22) et t(8;21)(q23.3;q22). Ce travail a permis de confirmer l’existence de divers modes de dérégulation de RUNX1 dans les leucémies aiguës. L’expression présumée de protéines chimériques et/ou d’isoformes tronquées de RUNX1, un dosage aberrant des transcrits de RUNX1 et la surexpression des gènes partenaires sont des conséquences révélées par l’étude de ces fusions. Le séquençage et l’analyse des jonctions génomiques des fusions récurrentes RUNX1-USP42/USP42-RUNX1 et RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 ont démontré la présence de signatures moléculaires caractéristiques du mode de recombinaison non-homologue de type NHEJ. En raison de la structure et de la composition différente des jonctions, l’implication de composantes distinctes du mécanisme NHEJ a été proposée. Enfin, des analyses par PCR quantitative en temps réel nous ont permis de démontrer l’existence de cibles de dérégulation partagées par les fusions récurrentes et plus rares de RUNX1. Nous avons démontré que CEBPA est moins exprimé dans la majorité des spécimens étudiés présentant une fusion de RUNX1 par rapport aux spécimens avec un caryotype normal alors que JUP, une composante effectrice de la voie Wnt, est plutôt surexprimé. Malgré l’activation transcriptionnelle de JUP dans l’ensemble de ces spécimens, certaines cibles de la voie Wnt telles que CCND1 et MYC sont différemment exprimées dans ces cellules, appuyant l’hétérogénéité décrite dans ce groupe de leucémies. Malgré l’implication de partenaires variés, nos données d’expression démontrent que les chimères et les protéines tronquées de RUNX1 partagent des cibles communes d’activation et de répression transcriptionnelle et établissent, pour la première fois, des évidences moléculaires suggérant l’existence de similitudes entre la fusion récurrente RUNX1-RUNX1T1 et quatre fusions plus rares de RUNX1. Puisque des rechutes surviennent fréquemment dans ce groupe génétique, l’inhibition de JUP pourrait être une option thérapeutique intéressante et ceci est appuyé par les bénéfices observés lors de l’inhibition de la voie Wnt dans d’autres groupes génétiques de leucémies aiguës. / Acute myeloid leukemia (AML) is a genetically heterogeneous disease characterized by frequent rearrangements of the RUNX1 gene located at chromosomal band 21q22. In this subtype of leukemias, t(8;21)(q22;q22) and t(3;21)(q26;q22) translocations are among the most studied rearrangements, being respectively associated with a favourable and poor prognosis. However, approximately half of RUNX1 translocations remain uncharacterized at the clinical and molecular levels at the present time. The main objectives of this thesis are to characterize four novel RUNX1 translocations in adult patients with acute leukemias and to study the expression profiles of specific transcriptional targets of RUNX1 fusions involved in self-renewal or differentiation of hematopoietic cells. Using molecular techniques, we identified CLCA2 and SV2B genes as novel fusion partners of RUNX1 in t(1;21)(p22;q22) and t(15;21)(q26;q22) translocations. We also described the recurrence of the USP42 and TRPS1 genes involved in t(7;21)(p22;q22) and t(8;21)(q23.3;q22) translocations. Chimeric fusion proteins, truncated isoforms of RUNX1, alteration of RUNX1 transcripts expression and overexpression of the fusion partner were possible outcomes of these various fusions, thus demonstrating the diversity of RUNX1 alterations in acute leukemias. Genomic breakpoints of the recurrent RUNX1-UPS42/USP42-RUNX1 and RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 fusions were cloned and analyzed revealing typical signatures of the non-homologous end joining recombination mechanism at fusion junctions. Since variation in the structure and composition of these junctions was observed, we proposed that distinct cellular machineries would be involved in the genesis of these abnormalities. Quantitative real-time PCR was performed on primary leukemic cells expressing these rare RUNX1 fusions. We demonstrated, for the first time, that similar downregulation of CEBPA and upregulation of JUP, an effector of the Wnt pathway, are detected in most samples studied presenting either recurrent or rare RUNX1 fusions. Despite an overexpression of JUP detected in each RUNX1 positive sample studied, other targets of the Wnt pathway like CCND1 and MYC genes were differently expressed in these cells, thus confirming the heterogeneity of this group of leukemias. Our expression data show that similar transcriptional targets, activated or repressed, are detected in cells expressing either chimeric or truncated RUNX1 proteins and establish the first molecular evidences suggesting that the recurrent RUNX1-RUNX1T1 and four rare RUNX1 fusions share common molecular deregulations. As relapse frequently occurs in RUNX1 positive leukemias, JUP overexpression could be of particular interest with regard to targeted-therapy, as demonstrated by previous work showing potential benefits of inhibiting the Wnt pathway in other genetic groups of acute leukemias.