L'hétérochromatine, de nature compacte et répétitive, limite l’accès à l'ADN et fait de la réparation des DSBs un processus difficile que les cellules doivent surmonter afin de maintenir leur intégrité génomique. Pour y étudier la réparation des DSBs, nous avons conçu un système CRISPR / Cas9 dans lequel les DSB peuvent être efficacement et spécifiquement induites dans l'hétérochromatine de fibroblastes de souris NIH3T3. En développant un système CRISPR / Cas9 hautement spécifique et robuste pour cibler l'hétérochromatine péricentrique, nous avons montré que les DSB en G1 sont positionnellement stables et réparés par NHEJ. En S / G2, ils se déplacent vers la périphérie de ce domaine pour être réparés par HR. Ce processus de relocalisation dépend de la résection et de l'exclusion de RAD51 du domaine central de l'hétérochromatine. Si ces cassures ne se relocalisent pas, elles sont réparées dans le cœur du domaine de l'hétérochromatine par NHEJ ou SSA. D'autre part, les DSBs dans l'hétérochromatine centromérique activent NHEJ et HR tout au long du cycle cellulaire. Nos résultats révèlent le choix de la voie de réparation différentielle entre l'hétérochromatine centromérique et péricentrique, ce qui régule également la position des DSBs. / Heterochromatin is the tightly packed form of repetitive DNA, essential for cell viability. Its highly compacted and repetitive nature renders DSB repair a challenging process that cells need to overcome in order to maintain their genome integrity. Developing a highly specific and robust CRISPR/Cas9 system to target pericentric heterochromatin, we showed that DSBs in G1 are positionally stable and repaired by NHEJ. In S/G2, they relocate to the periphery of this domain to be repaired by HR. This relocation process is dependent of resection and RAD51 exclusion from the core domain of heterochromatin. If these breaks fail to relocate, they are repaired within heterochromatin by NHEJ or SSA. On the other hand, DSBs in centromeric heterochromatin activate both NHEJ and HR throughout the cell cycle. Our results reveal the differential repair pathway choice between centromeric and pericentric heterochromatin that also regulates the DSB position.

L'hétérochromatine est une caractéristique conservée des chromosomes eucaryotes, avec des rôles centraux dans la régulation de l'expression des gènes et le maintien de la stabilité du génome. Comment la réparation de l'ADN est régulée par l'hétérochromatine reste mal compris. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe SIR (Silent Information Regulator) assemble une fibre de chromatine compacte. La chromatine SIR limite la résection aux cassures double-brin (DSB) protégeant les extrémités chromosomiques endommagées contre la perte d'informations génétiques. Toutefois, lesquels des trois complexes de résection redondants, MRX-Sae2, Exo1 et Sgs1-Dna2 sont inhibés et par quel(s) mécanisme(s) reste à decouvrir. Nous montrons que Sir3, le facteur de fixation des histones de l’hétérochromatine de Saccharomyces cerevisiae, interagit physiquement avec Sae2 et inhibe toutes ses fonctions. Cette interaction limite notamment la résection médiée par Sae2, stabilise MRX à la DSB et augmente le Non-Homologous End Joining (NHEJ). De plus, la chromatine répressive SIR inhibe partiellement les deux voies de résection extensive médiées par Exo1 et Sgs1-Dna2 par des mécanismes distincts. L'inhibition par les SIR de la résection extensive et de Sae2 favorise la NHEJ et limite le Break-Induced Replication (BIR), prévenant ainsi de la perte d'hétérozygotie au niveau des subtélomères. / Heterochromatin is a conserved feature of eukaryotic chromosomes, with central roles in regulation of gene expression and maintenance of genome stability. How DNA repair occurs in heterochromatin remains poorly described. In Saccharomyces cerevisiae, the Silent Information Regulator (SIR) complex assembles a compact chromatin fibre. SIR-mediated repressive chromatin limits Double Strand Break (DSB) resection protecting damaged chromosome ends against the loss of genetic information. However, which of the three redundant resection complexes, MRX-Sae2, Exo1 and Sgs1-Dna2 are inhibited and by which mechanism remains to be deciphered. We show that Sir3, the histone-binding factor of yeast heterochromatin, physically interacts with Sae2-mediated resection and inhibits all its functions. Notably, this interaction limits Sae2-mediated resection, delays MRX removal from DSB ends and promotes Non-Homologous End Joining (NHEJ). In addition, SIR-mediated repressive chromatin partially inhibits the two long range resection pathways mediated by Exo1 and Sgs1-Dna2 by distinct mechanisms. Altogether SIR mediated inhibition of extensive resection and of Sae2 promotes NHEJ and limits Break-Induced Replication (BIR) preventing loss of heterozygosity at subtelomeres.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / DNA double strand breaks (DSB) are among the most lethal forms of DNA damage and can occur as a result of ionizing radiation (IR), radiomimetic agents, endogenous DNA-damaging agents, etc. If left unrepaired DSB’s can cause cell death, chromosome translocation and carcinogenesis. In humans, DSB are repaired predominantly by the non-homologous end joining (NHEJ) pathway. Ku, a heterodimer consisting of Ku70 and Ku80, functions in the recognition step of this pathway through binding DNA termini. Ku recruits the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) to create the full DNA-PK heterotrimer. Formation of DNA-PK results in autophosphorylation as well as phosphorylation of downstream proteins of the NHEJ pathway. Previous work shows that the extreme C-terminus of Ku80 stimulates the kinase activity of DNA-PKcs, and Ku DNA binding is regulated as a function of redox via stimulation of a conformational change when oxidized resulting in a decrease in DNA binding activity. To further understand these methods of regulation of Ku and DNA-PK, a pair of mutants has been constructed; one consisting of full length Ku70 and truncated Ku80 (Ku70/80ΔC) lacking 182 C-terminal amino acids. The removal of these amino acids was shown to have little to no effect on the proteins expression, stability or DNA binding, as determined by SDS-PAGE, western blot analysis and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). When oxidized Ku70/80ΔC showed a decrease in DNA binding similar to that seen in wild type, however when re-reduced the mutant did not recover to the same extent as wild type. A second mutant was constructed, containing amino acids 590-732 of Ku80 (Ku80CTR), to further understand the mechanism by which Ku80 C-terminus interacts with the rest of the Ku heterodimer. Possible protein-protein interactions were evaluated by Ni-NTA affinity, gel filtration chromatography, fluorescence polarization and two forms of protein-protein cross-linking. Ni-NTA agarose affinity, and gel filtration chromatography failed to reveal an interaction in the presence or absence of DNA. However, photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) as well as EDC cross-linking demonstrated an interaction which was not affected by DNA. The work presented here demonstrates that the interaction between Ku80CTR and Ku is rather weak, but it does exist and plays a relatively large role in the NHEJ pathway.

La réponse au stress génotoxique met en jeu de nombreux facteurs cellulaires impliqués dans un réseau complexe de mécanismes visant à assurer le maintien de l'intégrité génétique de l'organisme. Ces mécanismes incluent la détection et la réparation des lésions de l'ADN, la régulation de la transcription et de la réplication et le déclenchement éventuel de la mort cellulaire. Parmi les protéines nucléaires participant à cette réponse, les protéines kin17 sont des protéines à doigt de zinc conservées au cours de l'évolution et activées par les ultraviolets (UV) et les radiations ionisantes (RI). Nous avons montré que la protéine kin17 humaine (HSAkin17) est présente dans la cellule sous une forme soluble et sous une forme ancrée aux structures nucléaires. Une fraction de la protéine HSAkin17 est directement associée à la chromatine. La protéine HSAkin17 est recrutée sur les structures nucléaires 24 heures après traitement par différents agents induisant des cassures double-brin de l'ADN (DSB) et/ou un blocage des fourches de réplication. Par ailleurs, la réduction du niveau total de protéine HSAkin17 sensibilise les cellules RKO aux RI. Nous présentons également des résultats impliquant la protéine HSAkin17 dans la réplication de l'ADN. Cette hypothèse a été confirmée par la démonstration biochimique de son appartenance au complexe de réplication. La protéine HSAkin17 pourrait donc assurer le lien entre réplication et réparation de l'ADN, un défaut de la voie HSAkin17 entraînant une augmentation de la radiosensibilité. Dans un deuxième temps, nous avons étudié les interactions entre deux mécanismes de réparation de l'ADN : la réparation par excision de nucléotides (NER) et la recombinaison non homologue (NHEJ). Le NER prend en charge une grande variété de lésions provoquant une distortion de la double hélice d'ADN dont les dimères de pyrimidines induits par les UV. Le NHEJ assure la réparation des DSB par jonction directe des extrémités d'ADN. Nous avons utilisé un modèle syngénique de défaut de la réparation basé sur l'interférence ARN développé au laboratoire. En effet, les vecteurs dérivés du virus d'Epstein-Barr (pEBV) permettent l'expression à long terme de siRNA et l'extinction spécifique du gène cible. La réduction de l'expression de gènes impliqués dans le NER (XPA et XPC) ou le NHEJ (DNA-PKcs et XRCC4) entraîne les phénotypes attendus. Nous avons montré que la réduction du niveau de protéine XPC sensibilise les cellules HeLa à l'étoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II qui induit des DBS, et affecte leur activité NHEJ in vitro. Ces résultats suggèrent que la protéine XPC pourrait être requise pour la réparation de certains types de cassures ou participer à un système global de régulation de la réponse cellulaire aux lésions de l'ADN. Notre modèle ouvre donc des perspectives intéressantes pour l'étude des relations entre les différentes voies de réparation de l'ADN dans des cellules humaines.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques particulières conférant une stabilité aux extrémités de chromosomes. La plupart des mécanismes télomériques sont conservée chez les eucaryotes supérieurs notamment chez l'homme. Parmi les fonctions exercées, les télomères développent des stratégies visant à limiter la recombinaison impropre aux télomères afin de préserver l'intégrité chromosomique. Au cours de ma thèse, j'ai étudié les mécanismes de maintenance et de protection des télomères chez l'homme, et plus particulièrement le rôle de la recombinaison homologue et recombinaison illégitime. Je me suis plus particulièrement intéressé au rôle de P53 dans le maintien des télomères, à travers sa fonction dans la recombinaison. Bien que son rôle soit établi dans la maintenance des télomères des cellules ALT, sa fonction est en revanche moins bien décrite dans les cellules présentant une activité télomérase. Dans cette perspective, nous avons établi des clones télomèrase (+) exprimant de manière stable le transgène P53R175H, décrit comme stimulant la RH. Cependant, la surexpression de P53R175H ne modifie pas le profil télomérique des ces cellules, se révélant ainsi incapable de stimuler la recombinaison télomérique. L'absence de phénotype pourrait être en fait la conséquence d'une interférence de la télomérase dans la mise en place d'un processus de recombinaison télomérique. Le deuxième volet de notre étude nous amené à préciser le rôle la recombinaison dans le maintien des télomères. Pour cela, nous avons construit des lignées isogéniques invalidées pour les deux voies majeures de la recombinaison grâce à une nouvelle famille de vecteurs ARNi basée sur des vecteurs EBV (brevet CEA N° 0501483) développé par Biard D. Ce système permet d'obtenir une réduction importante, spécifique et à long terme (plus de 300 jours en culture) de l'expression d'un gène cible. Plusieurs partenaires du NHEJ (DNA-PKcs, XRCC4, LigIV, Ku70), ou de la RH (RAD54, RAD51, RAD52) ou du complexe MRN ont été inhibés dans la lignée HeLa (adénocarcinome cervical). Dès les premiers jours d'invalidation du gène cible, des altérations de la stabilité des télomères sont constatées. Ces altérations se maintiennent au cours de la sélection (de 100 à 300 jours selon les clones). Ainsi, il semble que l'invalidation du NHEJ conduise à une instabilité télomérique associée à un raccourcissement de la taille des télomères dans le cas de XRCC4 et LigaseIVKD. Malgré une instabilité télomérique prononcée, les cellules RHKD se distinguent pourtant des clones NHEJKD par des altérations télomériques particulières. En effet, la dérégulation du RH mène à des signaux hétérogènes au sein du même bras chromosomique. En revanche, les anomalies dites de structure (perte associée à des cassures) sont plus abondantes dans les cellules déficientes pour le NHEJ. Ces résultats suggèrent que le NHEJ jouerait un rôle de protection alors que le RH serait plutôt impliqué dans l'élongation et la réplication des télomères. Cette étude s'est poursuit avec l'examen de clones MRE11KD, RAD50KD, NBS1KD permettant de clarifier dans un premier temps le rôle de du complexe dans les différentes voies de recombinaison puis sur la maintenance des télomères. A l'image des autres protéines de la recombinaison, RAD50 préserverait l'intégrité télomérique. L'invalidation des protéines NBS1 et MRE11 initie une élongation des télomères, probable manifestation de l‘activation de la recombinaison télomérique, absente des cellules RAD50KD. Ainsi, la présence de cercles télomériques extrachromosomiques dans le clone NBS1KD vient étayer cettehypothèse. Le complexe MRE11/RAD50/NBS1 constituerait alors un répresseur de la RH aux télomères.

L'Efficacité Biologique Relative (EBR) des faisceaux de protons énergétiques (70-250 MeV) utilisés dans les différents centres de protonthérapie est classiquement estimée à 1,10 par rapport aux photons du Cobalt-60. Bien qu'en accord avec la mesure de la régénération des cryptes intestinales chez la souris après exposition à une dose unique de 10 à 15 Gy, cette valeur moyenne a été contestée par la microdosimétrie. Ces incertitudes nous ont conduits à analyser l'effet des protons mis en œuvre dans les deux faisceaux médicaux (76 et 201 MeV) du Centre de Protonthérapie de l'Institut Curie à Orsay (ICPO) sur deux lignées cellulaires humaines tumorales, et en partie sur une lignée fibroblastique. Les résultats font apparaître une différence de la valeur de l'EBR pour la survie au rayonnement dans la partie distale du SOBP (Spread-Out Bragg Peak) en fonction de l'énergie incidente, ainsi qu'une absence de corrélation entre la réponse en survie et l'incidence des cassures double-brin de l'ADN dans le faisceau de 76 MeV. Nous montrons cependant, grâce à l'utilisation de lignées défectives dans les voies de signalisation et de réparation des cassures double-brin de l'ADN par le D-NHEJ, que ces voies déterminent la valeur de l'EBR dans la partie distale du SOBP de 76 MeV. La réponse aux dommages de l'ADN dans cette région suggère que les dommages létaux appartiennent à la classe des "lésions complexes" (LMDS) de l'ADN. D'autre part, il apparaît que la fluence des particules constitue un paramètre majeur qui doit être pris en compte dans la partie distale des faisceaux.

L'élimination programmée d'ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double brin (CDB) de l'ADN et la préservation de l'intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l'introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l'excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l'élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L'implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l'excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n'y a pas de jonctions d'excision formées et les extrémités cassées s'accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L'hypothèse d'une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l'utilisation de microhomologie, a été émise. C'est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d'extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l'ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d'un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l'introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome.

BACKGROUND: The inactivation of the tumor suppressor gene BRCA1 is a predisposing factor for a breast/ovarian cancer development. Formation of cancer-specific alternative splicing variants with aberrant biological properties can represent additional mechanism decreasing the overall BRCA1 activity in DNA double strand break (DDSB) repair. In this study, we analyzed BRCA1 alternative splicing variants BRCA114-15 and 17-19 ascertained previously during the screening of high-risk breast cancer individuals. METHODS: We established a stable MCF-7 cell line-based model system for an in vitro analysis of BRCA1 variants. Using this system, we analyzed the impact of BRCA114-15 and 17-19 variants on DNA repair kinetics using comet assay and confocal immunomicroscopy. The capacity of DNA repair was assessed directly by an in vitro NHEJ assay and indirectly by a mitomycin C sensitivity test. The proliferation activities were determined by a clonogenic assay and growth curves. RESULTS: Overexpression of BRCA114-15 and 17-19 increases the endogenous level of DNA damage, slows down the DDSB repair, and decelerates the initial phase of radiation-induced foci formation and prolongs their persistence. Moreover, BRCA114-15 and 17-19 differentially influence the activity of HR and NHEJ and sensitivity of MCF-7 cells to ionizing...

BACKGROUND: The inactivation of the tumor suppressor gene BRCA1 is a predisposing factor for a breast/ovarian cancer development. Formation of cancer-specific alternative splicing variants with aberrant biological properties can represent additional mechanism decreasing the overall BRCA1 activity in DNA double strand break (DDSB) repair. In this study, we analyzed BRCA1 alternative splicing variants BRCA114-15 and 17-19 ascertained previously during the screening of high-risk breast cancer individuals. METHODS: We established a stable MCF-7 cell line-based model system for an in vitro analysis of BRCA1 variants. Using this system, we analyzed the impact of BRCA114-15 and 17-19 variants on DNA repair kinetics using comet assay and confocal immunomicroscopy. The capacity of DNA repair was assessed directly by an in vitro NHEJ assay and indirectly by a mitomycin C sensitivity test. The proliferation activities were determined by a clonogenic assay and growth curves. RESULTS: Overexpression of BRCA114-15 and 17-19 increases the endogenous level of DNA damage, slows down the DDSB repair, and decelerates the initial phase of radiation-induced foci formation and prolongs their persistence. Moreover, BRCA114-15 and 17-19 differentially influence the activity of HR and NHEJ and sensitivity of MCF-7 cells to ionizing...

Maintenance of genomic integrity with high fidelity is of prime importance to any organism. An insult which may result in compromised genome integrity is prevented or its consequences are monitored by advanced cellular networks, collectively called the DNA damage response (DDR). Various DNA repair pathways, which are part of DDR, constantly correct the genome in the event of any undesirable change in the genetic material and prevent the transmission of any impairment to daughter cells. Non homologous DNA end joining (NHEJ) is the predominant DNA repair pathway associated with DDR in higher eukaryotes, correcting double-strand breaks (DSBs). Microhomology mediated end joining (MMEJ), an alternate mechanism to NHEJ also exists in cells, which is associated with erroneous joining of broken DNA, leading to mutagenesis. DDR is of paramount importance in cellular viability and therefore, any defects in DDR or the imbalance of repair pathways contribute to mutations, cellular transformations and various neurodegenerative and congenital abnormalities. Here, we investigate the DDR via NHEJ and MMEJ pathways during embryonic development in mice as well as in presence of an environmental pollutant, Endosulfan, in order to understand how physiological and exogenous factors condition the balance of repair pathways. Among various classes of pesticides known to cause side effects, organochlorine pesticides (OCPs) lead the list, possessing high transport potential, and a variety of toxic and untoward health effects. Endosulfan is a widely used organochlorine pesticide and is speculated to be detrimental to human health. However, very little is known about mechanism of its genotoxicity. Using in vivo and ex vivo model systems, we showed that exposure to Endosulfan induced reactive oxygen species (ROS) in a concentration dependent manner. Using an array of assays and equivalents of sub-lethal concentrations comparable to the detected level of Endosulfan in humans living in active areas of exposure, we demonstrated that ROS production by Endosulfan resulted in DNA double-strand breaks in mice, rats and human cells. In mice, the DNA damage was predominantly detected in type II pneumocytes of lung tissue; spermatogonial mother cells and primary spermatids of testes. Importantly, Endosulfan-induced DNA damage evoked DDR, which further resulted in elevated levels of classical NHEJ. However, sequence analyses of NHEJ junctions revealed that Endosulfan treatment resulted in extensive processing of broken DNA, culminating in increased and long junctional deletions, thereby favouring erroneous repair. We also find that exposure to Endosulfan led to significantly increased levels of MMEJ, which is a LIGASE III dependent, alternative, non classical repair pathway, encompassing long deletions and processing of DNA. Further, we show that the differential expression of proteins following exposure to Endosulfan correlated with activation of alternative DNA repair. At the physiological level, using mouse model system, we showed that exposure to Endosulfan affected physiology and cellular architecture of organs and tissues. Among all organs, damage to testes was extensive and it resulted in death of different testicular cell populations. We also found that the damage in testes resulted in qualitative and quantitative defects during spermatogenesis in a time dependent manner, increasing epididymal ROS levels and affecting sperm chromatin integrity. This further culminated in reduced number of epididymal sperms and actively motile sperms, which finally resulted in reduced fertility in male but not in female mice. Repair of DSBs is important for maintaining genomic integrity during the successful development of a fertilized egg into a whole organism. To date, the mechanism of DSB repair in post implantation embryos has been largely unknown except for the differential requirement of DNA repair genes in the course of development. These studies relied on null mutation analysis of animal phenotypes and therefore a quantitative understanding of repair pathways was absent. In the present study, using a cell free repair system derived from different embryonic stages of mice, we found that canonical NHEJ is predominant at 14.5 day of embryonic development. Interestingly, all types of DSBs tested were repaired by LIGASE IV/XRCC4 and Ku-dependent classical NHEJ. Characterization of end-joined junctions and expression studies further showed evidence for C-NHEJ. Strikingly, we observed non canonical end joining accompanied by DSB resection, dependent on microhomology and LIGASE III in 18.5-day embryos. Further we observed an elevated expression of CtIP, MRE11, and NBS1 at this stage, suggesting that it could act as a switch between classical and microhomology-mediated end joining at later stages of embryonic development. Keeping these observations in mind, we wondered if Endosulfan affected the differential regulation of DDR during development, similar to mice tissues. Upon analysing the effect of endosulfan on NHEJ/MMEJ at above mentioned stages of mouse embryonic development, we found that C-NHEJ efficiency remained low or unaltered while the efficiency of MMEJ was upregulated significantly, perturbing the repair balance during embryo development and hence facilitating mutagenic repair. Thus, our results establish the existence of both classical and non classical NHEJ pathways during the post implantation stages of mammalian embryonic development. Our studies also provide deeper insights into physiological and molecular events leading to male infertility upon Endosulfan exposure and its impact on impairing the differential regulation of DNA repair during embryonic development. Our findings suggest the plasticity of DNA repair pathways in physiological and pathological conditions and provide insights into mechanism of genome instability due to DNA repair imbalance, when exposed to environmental mutagens.