Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Orientador: Lourenço Sbragia Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T22:18:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_FrancesLilianLanhellas_D.pdf: 2361002 bytes, checksum: 29248e59784dbe05747e1b7336dab13c (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Gastrosquise é um defeito congênito da parede abdominal anterior no qual as alças intestinais ficam herniadas e em contato com o líquido amniótico (LA) cuja exposição crônica resulta em várias disfunções intestinais no período pós-natal. Para reduzir o efeito danoso desta exposição utilizou-se em modelo animal, dosagens diferentes de S-nitrosoglutationa (GSNO), doador de óxido nítrico (NO) e para a concentração mais diluída acrescentou-se o hidrogel de N-isopropilacrilamida (NIPAAm) copolimerizado com ácido acrílico (Aac) para cobrir as alças fetais expostas fetais afim de avaliar o tratamento com NO e a proteção oferecida pelo biomaterial. A gastrosquise foi induzida cirurgicamente em fetos de ratas com 18,5 dias de gestação. Os fetos foram separados em dez grupos: controle externo (CE), gastrosquise (G), controle interno (CI), Sham (S), gastrosquise + adesivo de fibrina - Beriplast® (GA), gastrosquise + adesivo de fibrina + hidrogel seco (GAH), gastrosquise + GSNO a 50 µM (GNO1), gastrosquise + GSNO a 5 µM (GNO2), gastrosquise + GSNO a 0,5 µM (GNO3), gastrosquise + GSNO a 0,05 µM (GNO4), gastrosquise + adesivo de fibrina + hidrogel seco + GSNO a 0,05 µM (GAHNO4). Com 21,5 dias de gestação, os fetos foram colhidos por cesárea e o hidrogel foi cuidadosamente removido. Ao grupo GNO1 não foi dada continuidade, pois a dosagem foi nociva aos animais. Dados de peso corporal e intestinal foram aferidos e algumas amostras do intestino foram fixadas para estudo histométrico e imunoistoquímico e outras congeladas para western blotting e quimioluminescência. Resultados das medidas morfológicas e histométricas, como peso, diâmetro, espessura das camadas e da parede intestinal, demostraram que o grau de proteção e tratamento das alças intestinais foi eficaz nos grupos GAH e GAHNO4, pois apresentaram valores significamente menores, assim como os grupos CE e CI e diferente dos grupos G, GA, GNO2, GNO3 e GNO4 que indicaram processo inflamatório. A expressão das enzimas nNOS, iNOS e eNOS por meio de western blotting e imunoistoquímica dimunuiu principalmente nos grupos GAH, GNO4 e GAHNO4 ficando iguais aos grupos CE e CI. A quantificação de nitrato e nitrito (NOx) no intestino e no LA por quimioluminescência nos grupos G, CI e S, mostrou que o NO se difunde do tecido intestinal para o LA, no grupo G e isso pode ser a causa para o aumento da expressão da enzima NOS. Sendo assim, a aplicação do hidrogel aderido pelo adesivo de fibrina mostrou servir como uma efetiva proteção das alças herniadas e o tratamento concomitante com GSNO a 0,05 ?M também ajudou na redução significante da inflamação na gastrosquise / Abstract: Gastroschisis is a congenital defect of the anterior abdominal wall in which the herniated bowel is in contact with the amniotic fluid (LA) whose chronic exposure results in several postnatal bowel dysfunction. To reduce the harmful effect of this exposure it was used in an animal model, different doses of S-nitrosoglutathione (GSNO), donor of nitric oxide (NO) and the more dilute concentration was added to the hydrogel of N-isopropylacrylamide (NIPAAm) copolymerized acrylic acid (Aac) to cover the exposed fetal handles in order to assess fetal treatment with NO and the protection offered by the biomaterial. Gastroschisis was surgically induced in fetuses of female Sprague-Dawley rats at 18.5 days of gestation. The fetuses were separated into ten groups: external control (CE), gastroschisis (G) internal control (CI), Sham (S), gastroschisis + fibrin adhesive - Beriplast® (GA), gastroschisis + fibrin adhesive + dry hydrogel (GAH), gastroschisis + 50 µM GSNO (GNO1), gastroschisis + 5 µM GSNO (GNO2), gastroschisis + 0.5 µM GSNO (GNO3), gastroschisis + 0.05 µM GSNO (GNO4), gastroschisis + fibrin adhesive + dry hydrogel + to 0.05 ?M GSNO (GAHNO4). On day 21.5 of gestation, fetuses were collected by cesarean section and the hydrogel was carefully removed. The group GNO1 was not given continuity, because the dosage was harmful to the animals. Data of body weight and intestinal samples were measured and some intestinal samples were fixed for immunohistochemical and histometric study and the others were frozen for western blotting and chemiluminescence. Results of morphological and histometric measures such as weight, diameter and thickness of the intestinal wall, showed that the degree of protection and treatment of bowel was effective in groups GAH and GAHNO4 because they showed significantly lower values, as well as groups CE and CI and different from groups G, GA, GNO2, GNO3 and GNO4 that indicated inflammatory process. The expression of nNO, iNOS and eNOS enzymes by western blotting and immunohistochemistry decreased especially in groups GAH, GNO4 and GAHNO4, getting the same results as the CE and CI groups. Quantification of nitrate and nitrite (NOx) by chemiluminescence in the bowel and LA of groups G, S and CI showed that NO diffused from the intestinal tissue to LA in the group G and this may be the cause for the increased expression of the NOS enzymes. Therefore, the application of hydrogel joined by fibrin adhesive showed an effective protection of the herniated bowel and concomitant treatment with GSNO at 0.05 ?M, also helped in significant reduction in inflammation in gastroschisis / Doutorado / Fisiopatologia Cirúrgica / Doutor em Ciências

O óxido nítrico (NO) é o principal agente vasodilatador endógeno que regula o tônus e a homeostase vascular, além de controlar o fluxo sanguíneo. Doadores de NO, entre eles os nitratos orgânicos, são importantes medicamentos para o tratamento de doenças cardiovasculares. O grande benefício clínico desses nitratos é atribuído ao seu efeito venodilatador. Isto se deve ao seu efeito sobre a redução do retorno venoso, da pré-carga cardíaca e da demanda de oxigênio pelo miocárdio. Porém, um dos efeitos adversos mais comuns dos nitratos orgânicos é a cefaléia causada pela vasodilatação cerebral. Os doadores de NO utilizados clinicamente, nitroglicerina (NTG) e nitroprussiato de sódio (NPS), possuem algumas limitações como indução de tolerância e toxicidade, respectivamente. Dentre os compostos amplamente estudados, que são capazes de liberar NO, estão os complexos nitrosilos de rutênio. Estes complexos têm interesse terapêutico devido à sua baixa toxicidade. Recentemente, verificamos que o complexo de rutênio [Ru(terpy)(bdq)NO]3+ (Terpy), sintetizado em nosso departamento, reduz a pressão de ratos hipertensos renais 2R-1C e promove relaxamento vascular da aorta desses animais e de ratos normotensos controles (2R). Desta forma, a hipótese deste trabalho é de que o Terpy seja capaz de induzir relaxamento vascular em anéis de artéria basilar e veia cava inferior, tanto de ratos normotensos (2R) quanto de ratos 2R-1C. O nosso estudo teve como objetivo estudar os efeitos deste composto doador de NO e do doador de NO de referência, NPS, e os seus mecanismos de relaxamento vascular na artéria basilar e veia cava inferior de ratos normotensos 2R e hipertensos renais 2R-1C. Nossos resultados demonstram que o Terpy, ao contrário do NPS, não promoveu relaxamento vascular na artéria basilar de ratos 2R e 2R-1C. Da mesma forma, o Terpy não liberou NO nas células do músculo liso vascular. O NPS liberou NO e induziu relaxamento da artéria basilar pela ativação da enzima guanililciclase solúvel (GCs), com conseqüente ativação da proteína quinase dependente de GMPc (GK) e ativação dos canais para K+(KV, KATP e KIR). Ambos doadores, assim como a NTG, promoveram relaxamento vascular em anéis de veia cava e artéria basilar de ratos 2R e 2R- 1C de forma dependente da concentração. O relaxamento das veias de ratos 2R-1C foi menor do que em veias de 2R para os doadores de NO: Terpy, NPS e NTG. A liberação do NO pelo Terpy foi menor nas veias de 2R-1C. O NPS induz relaxamento da veia cava inferior pela ativação da enzima GCs com conseqüente ativação da proteína GK e ativação de canais para K+ sensíveis ao TEA. O Terpy induziu relaxamento da veia cava inferior pela ativação da enzima GCs, com conseqüente ativação da GK, ativação da Ca2+-ATPase reticular (SERCA) e ativação dos canais para K+ (KV, SKca e BKca). Em conjunto, nossos resultados mostraram que o Terpy é menos potente que o doador de referência (NPS) na veia cava inferior de ratos 2R e 2R-1C. Sua resposta vasodilatadora se deve principalmente à ativação da GCs, de canais para K+,proteína GK e SERCA. O Terpy, ao contrário do NPS, não induz relaxamento na artéria basilar de ratos 2R e 2R-1C. A resposta vasodilatadora do NPS nesses vasos se deve principalmente à ativação da GCs, de canais para K+ e proteína GK. A SERCA parece não estar envolvida no mecanismo de relaxamento vascular induzido pelo NPS. / Nitric oxide (NO) is an endogenous vasodilator that regulates vascular tone, homeostasis and blood flow. NO donors, including organic nitrates are important drugs for the treatment of cardiovascular diseases. A major clinical benefit of NO donors is attributed to their venodilator effect, resulting in decreased venous return, cardiac preload, arterial pressure and decreased myocardial oxygen demand. But the most common side effect of these drugs is the headache, which is caused by cerebral vasodilatation. The clinically used NO donors, nitroglycerin (NTG) and sodium nitroprusside (SNP), have some limitations such as induction of tolerance and toxicity, respectively. Among the widely studied compounds, which are capable of releasing NO are the nitrosyl ruthenium complexes, which have therapeutic interest due to its low toxicity. Recently, we found that the ruthenium complex [Ru (terpy)(BDQ)NO]3+ (Terpy) reduces the blood pressure of renal hypertensive rats (2K- 1C) and promotes vascular relaxation in aorta from 2K-1C and normotensive rats (2R). Thus, the hypothesis of the present work was that Terpy is able to induce vascular relaxation in basilar artery and inferior vena cava rings in 2K and 2K-1C rats. Our study aimed to investigate the effects of Terpy and SNP (the classical NO donor) and their vascular mechanisms in basilar artery and inferior vena cava from 2K and 2K-1C rats. Our results demonstrate that Terpy, unlike the SNP, did not promote vascular relaxation in basilar artery of 2K and 2K-1C. Terpy did not release NO in vascular smooth muscle cells. SNP released NO and induced relaxation in basilar artery rings by activating the enzyme soluble guanylyl cyclase (sGC) with consequent activation of cGMP-dependent protein kinase (GK) and activation of K + channels (KV, KATP and KIR). Both NO donors and NTG promoted vascular relaxation in vena cava rings from 2K and 2K-1C rats in concentration-dependent way. We have observed an impaired relaxation to NO in cava vein from 2K-1C rats. The NO release by Terpy was lower in 2K-1C veins. NPS induces relaxation in inferior vena cava by the activation of GCs, GK and K+ channels. Terpy induced relaxation in inferior vena cava by the activation of the enzyme sGC, with consequent activation of GK, reticular Ca2 + ATPase (SERCA) and activation of K + channels (KV and BKCa SKca). Taken together, our results demonstrate that Terpy is less potent than the reference NO donor (SNP) in the inferior vena cava of 2K and 2K-1C. Its vasodilator effect is mainly due to activation of sGC, K + channels, SERCA and GK protein. In basilar artery Terpy, unlike SNP, does not induce relaxation in 2K and 2K-1C rats. Vasodilator response to SNP in basilar artery is mainly due to activation of sGC, K + channels and GK protein. SERCA appears not to be involved in the mechanism of vascular relaxation by SNP.

O óxido nítrico (NO) é o principal agente vasodilatador endógeno que regula o tônus e a homeostase vascular, além de controlar o fluxo sanguíneo. Doadores de NO, entre eles os nitratos orgânicos, são importantes medicamentos para o tratamento de doenças cardiovasculares. O grande benefício clínico desses nitratos é atribuído ao seu efeito venodilatador. Isto se deve ao seu efeito sobre a redução do retorno venoso, da pré-carga cardíaca e da demanda de oxigênio pelo miocárdio. Porém, um dos efeitos adversos mais comuns dos nitratos orgânicos é a cefaléia causada pela vasodilatação cerebral. Os doadores de NO utilizados clinicamente, nitroglicerina (NTG) e nitroprussiato de sódio (NPS), possuem algumas limitações como indução de tolerância e toxicidade, respectivamente. Dentre os compostos amplamente estudados, que são capazes de liberar NO, estão os complexos nitrosilos de rutênio. Estes complexos têm interesse terapêutico devido à sua baixa toxicidade. Recentemente, verificamos que o complexo de rutênio [Ru(terpy)(bdq)NO]3+ (Terpy), sintetizado em nosso departamento, reduz a pressão de ratos hipertensos renais 2R-1C e promove relaxamento vascular da aorta desses animais e de ratos normotensos controles (2R). Desta forma, a hipótese deste trabalho é de que o Terpy seja capaz de induzir relaxamento vascular em anéis de artéria basilar e veia cava inferior, tanto de ratos normotensos (2R) quanto de ratos 2R-1C. O nosso estudo teve como objetivo estudar os efeitos deste composto doador de NO e do doador de NO de referência, NPS, e os seus mecanismos de relaxamento vascular na artéria basilar e veia cava inferior de ratos normotensos 2R e hipertensos renais 2R-1C. Nossos resultados demonstram que o Terpy, ao contrário do NPS, não promoveu relaxamento vascular na artéria basilar de ratos 2R e 2R-1C. Da mesma forma, o Terpy não liberou NO nas células do músculo liso vascular. O NPS liberou NO e induziu relaxamento da artéria basilar pela ativação da enzima guanililciclase solúvel (GCs), com conseqüente ativação da proteína quinase dependente de GMPc (GK) e ativação dos canais para K+(KV, KATP e KIR). Ambos doadores, assim como a NTG, promoveram relaxamento vascular em anéis de veia cava e artéria basilar de ratos 2R e 2R- 1C de forma dependente da concentração. O relaxamento das veias de ratos 2R-1C foi menor do que em veias de 2R para os doadores de NO: Terpy, NPS e NTG. A liberação do NO pelo Terpy foi menor nas veias de 2R-1C. O NPS induz relaxamento da veia cava inferior pela ativação da enzima GCs com conseqüente ativação da proteína GK e ativação de canais para K+ sensíveis ao TEA. O Terpy induziu relaxamento da veia cava inferior pela ativação da enzima GCs, com conseqüente ativação da GK, ativação da Ca2+-ATPase reticular (SERCA) e ativação dos canais para K+ (KV, SKca e BKca). Em conjunto, nossos resultados mostraram que o Terpy é menos potente que o doador de referência (NPS) na veia cava inferior de ratos 2R e 2R-1C. Sua resposta vasodilatadora se deve principalmente à ativação da GCs, de canais para K+,proteína GK e SERCA. O Terpy, ao contrário do NPS, não induz relaxamento na artéria basilar de ratos 2R e 2R-1C. A resposta vasodilatadora do NPS nesses vasos se deve principalmente à ativação da GCs, de canais para K+ e proteína GK. A SERCA parece não estar envolvida no mecanismo de relaxamento vascular induzido pelo NPS. / Nitric oxide (NO) is an endogenous vasodilator that regulates vascular tone, homeostasis and blood flow. NO donors, including organic nitrates are important drugs for the treatment of cardiovascular diseases. A major clinical benefit of NO donors is attributed to their venodilator effect, resulting in decreased venous return, cardiac preload, arterial pressure and decreased myocardial oxygen demand. But the most common side effect of these drugs is the headache, which is caused by cerebral vasodilatation. The clinically used NO donors, nitroglycerin (NTG) and sodium nitroprusside (SNP), have some limitations such as induction of tolerance and toxicity, respectively. Among the widely studied compounds, which are capable of releasing NO are the nitrosyl ruthenium complexes, which have therapeutic interest due to its low toxicity. Recently, we found that the ruthenium complex [Ru (terpy)(BDQ)NO]3+ (Terpy) reduces the blood pressure of renal hypertensive rats (2K- 1C) and promotes vascular relaxation in aorta from 2K-1C and normotensive rats (2R). Thus, the hypothesis of the present work was that Terpy is able to induce vascular relaxation in basilar artery and inferior vena cava rings in 2K and 2K-1C rats. Our study aimed to investigate the effects of Terpy and SNP (the classical NO donor) and their vascular mechanisms in basilar artery and inferior vena cava from 2K and 2K-1C rats. Our results demonstrate that Terpy, unlike the SNP, did not promote vascular relaxation in basilar artery of 2K and 2K-1C. Terpy did not release NO in vascular smooth muscle cells. SNP released NO and induced relaxation in basilar artery rings by activating the enzyme soluble guanylyl cyclase (sGC) with consequent activation of cGMP-dependent protein kinase (GK) and activation of K + channels (KV, KATP and KIR). Both NO donors and NTG promoted vascular relaxation in vena cava rings from 2K and 2K-1C rats in concentration-dependent way. We have observed an impaired relaxation to NO in cava vein from 2K-1C rats. The NO release by Terpy was lower in 2K-1C veins. NPS induces relaxation in inferior vena cava by the activation of GCs, GK and K+ channels. Terpy induced relaxation in inferior vena cava by the activation of the enzyme sGC, with consequent activation of GK, reticular Ca2 + ATPase (SERCA) and activation of K + channels (KV and BKCa SKca). Taken together, our results demonstrate that Terpy is less potent than the reference NO donor (SNP) in the inferior vena cava of 2K and 2K-1C. Its vasodilator effect is mainly due to activation of sGC, K + channels, SERCA and GK protein. In basilar artery Terpy, unlike SNP, does not induce relaxation in 2K and 2K-1C rats. Vasodilator response to SNP in basilar artery is mainly due to activation of sGC, K + channels and GK protein. SERCA appears not to be involved in the mechanism of vascular relaxation by SNP.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 5 uppsatser.

Submitted by Regina Correa (rehecorrea@gmail.com) on 2016-09-19T14:14:44Z No. of bitstreams: 1 DissIPV.pdf: 1704019 bytes, checksum: 751e447a48fee6a71450395588fde1ab (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-23T18:19:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissIPV.pdf: 1704019 bytes, checksum: 751e447a48fee6a71450395588fde1ab (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-23T18:19:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissIPV.pdf: 1704019 bytes, checksum: 751e447a48fee6a71450395588fde1ab (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-23T18:19:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissIPV.pdf: 1704019 bytes, checksum: 751e447a48fee6a71450395588fde1ab (MD5) Previous issue date: 2016-04-14 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The endothelium is a monolayer of cells that extends on the vascular inner surface, responsible for the modulation of vascular tone. By means of the release of nitric oxide (NO), the endothelium has an important protective function against cardiovascular diseases, producing vasodilation by several mechanisms and generating a series of other effects, since at high concentrations it may produce toxic effects to the cells. However, endothelial dysfunction is characterized mainly by the decreased ability of endothelial cells to release NO, which may be due to reaction with superoxide anion (O2 -) and formation of peroxynitrite (ONOO-). In previous studies, it was found that ruthenium complexes can also inactivate O2 - and NO release. However, through vascular reactivity technique in aortic hypertensive and normotensive rats, and detection study of released NO in endothelial cells, the objective of this study was to evaluate the potential of the drug cis- [Ru(bpy)2(NO2)(NO)](PF6)2 as a pharmacologic strategy to reverse and/or prevent endothelial dysfunction found in the arterial hypertension model 2K-1C as well as to perform the pharmacological characterization of the dependent effects removal of O2 - and NO release induced by these drugs. Thus our major vascular reactivity results indicated that the BPY concentration of 0.1 μM was able to reverse the endothelial dysfunction present in the aortas of animals 2K-1C. Likewise, its positive control, Deta-NO in a specific concentration of 10 μM was able to reverse endothelial dysfunction, besides presenting a potentiating effect in the presence of endothelium. Furthermore, our results indicate that the lowest detection of NO in HUVECs treated with Ang. II, in addition to BPY compound occurs by the increased formation of O2 -, since in the presence of SOD there was an increased release of NO by BPY. Furthermore, it was observed that the BPY releases NO in solution in a sustained concentration-dependent form, where the presence of the endothelial cells increased and Angiotensin II reduces NO release, indicating a reduction or oxidation in BPY compound and also degradation of NO the formation of O2 -. / O endotélio é uma monocamada de células que se estende sobre a superfície interna vascular, responsável pela modulação do tônus vascular. Por meio da liberação do óxido nítrico (NO), o endotélio apresenta importante função protetora contra as doenças cardiovasculares, produzindo vasodilatação por diversos mecanismos e gerando uma série de outros efeitos, visto que em altas concentrações pode produzir efeitos tóxicos às células. Contudo, a disfunção endotelial é caracterizada principalmente pela diminuição da capacidade das células endoteliais em liberar NO, que pode ser decorrente da reação com ânion superóxido (O2 -) e formação de peroxinitrito (ONOO-). Em estudos prévios, foi verificado que complexos de rutênio podem inativar O2 - e também liberar NO. Contudo através de técnica de reatividade vascular em aorta de ratos hipertensos e normotensos, e estudo de detecção de NO liberado em células endoteliais, o objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial da droga cis-[Ru(bpy)2(NO2 -)(NO)](PF6)2 como estratégia farmacológica para reverter e/ou prevenir a disfunção endotelial encontrada no modelo de hipertensão arterial 2R-1C, bem como realizar a caracterização farmacológica dos efeitos dependentes da remoção do O2 - e liberação do NO induzidos por estas drogas. Desta forma os principais resultados de reatividade vascular indicaram que o BPY na concentração de 0,1 μM foi capaz de reverter a disfunção endotelial presente nas aortas de animais 2R-1C. Da mesma forma, seu controle positivo, Deta-NO, em uma concentração específica 10 μM, foi capaz reverter a disfunção endotelial, além de apresentar potencialização de seus efeitos na presença do endotélio. Além disso, houve menor detecção de NO em HUVECs tratadas com Ang. II, além do composto BPY, ocorre pela maior formação de O2 -, uma vez que na presença de SOD ocorreu aumento na liberação de NO pelo BPY. Ainda, observou–se que o BPY libera NO em solução de forma concentração dependente e prolongada, em que a presença das células endoteliais aumentou a liberação de NO e a angiotensina II reduz sua liberação de NO, indicando redução ou oxidação no composto BPY e degradação do NO pela formação do O2 -.

Orientador: Edson Antunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T13:42:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_MarciaHelenaMiranda_D.pdf: 20008968 bytes, checksum: 1a1bf9dc06053f021c3ee9e0591edd1e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A inibição da adesão de plaquetas ao subendotélio é fundamental na prevenção de agregação excessiva e de formação de trombos, sendo o óxido nítrico (NO) o principal mediador envolvido neste fenômeno. O objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo de ação do NO na inibição da adesão de plaquetas humanas, procurando identificar os mecanismos dependentes e independentes de GMP cíclico (GMPc). Os ensaios de adesão foram realizados em placas de 96 poços recobertos com fibrinogênio, usando-se plaquetas lavadas (1,2 x 108 plaquetas/mL) obtidas de indivíduos sadios. Dependendo do protocolo experimental, as plaquetas não ativadas e ativadas com trombina (50 mU/mL) foram incubadas com SNP (0,1-1,0 mM) ou SIN-1 (0,1-1,0 mM), na ausência ou na presença de ODQ (inibidor da guanilato ciclase solúvel), SOD (seqüestrador do ânion superóxido) ou gaiato (antioxidante seqüestrador de peroxinitrito). A adesão foi avaliada aos 15 e 60 min de incubação, medindo-se a atividade da fostase ácida. Nossos resultados mostraram que as plaquetas se aderem significativamente ao fibrinogênio in vitro, sendo a resposta em 60 min maior do que em 15 min. O tratamento das plaquetas com SNP (0,1 e 1,0 mM) elevou significativamente os níveis de GMPc e reduziu a adesão plaquetána aos 15 e 60 min. A pré-incubação das plaquetas com ODQ impediu a elevação dos níveis de GMPc induzida pelo SNP (ambas as concentrações e tempos), e reverteu a inibição da adesão plaquetária observada com 0,1 mM de SNP Entretanto, o ODQ não modificou a inibição da adesão quando se usou 1,0 mM de SNP. Por outro lado, a pré-incubação das plaquetas com SOD ou gaiato reverteu significamente o efeito inibitório de 1 mM de SNP. Resultados semelhantes foram obtidos com o SIN-1 em todas as condições experimentais. No sentido de descartar que a inibição da adesão plaquetária proporcionada pelos doadores de NO não é decorrente de efeito citotóxico, realizamos ensaios de citotoxicidade (MTT). Nossos dados revelaram que o SNP não é tóxico à plaqueta em nenhuma das concentrações e condições usadas. Por outro lado, o SIN-1 mostrou-se tóxico na concentração de 1 mM, sendo este efeito citotóxico revertido pela pré-incubação das palquetas com SOD. Numa segunda etapa deste trabalho, passamos à investigação do componente independente de GMPc responsável pela inibição da adesão plaquetária em resposta ao SNP e SIN-1, dando ênfase à nitrotirosina. A incubação de plaquetas com SNP (0,1 mM) por 15 min não revelou nenhuma proteína nitrada, mas quando as plaquetas foram tratadas com concentração maior de SNP (1 mM) ou SIN-1, houve o aparecimento de uma nitração de proteína nos resíduos de tirosina com uma massa molecular aparente de 110 kDa, identificada como alfa-actinina-1. A nitração foi aumentada em plaquetas ativadas com trombina. Por outro lado, amostras de plaquetas tratadas com SNP ou SIN-1 (0,1 e 1 mM) por 60 min não mostraram nitração de proteína nos resíduos de tirosina. No conjunto, estes dados sugerem que o NO inibe a adesão de plaquetas não ativadas e ativadas, por mecanismos dependentes e independentes de GMPc sendo que a nitração da a-actinina 1 plaquetária, parece ser o principal mecanismo responsável pelo componente independente de GMPc. Paralelamente, observamos que em concentrações elevadas, o SIN-1 diminui a viabilidade e a atividade da fosfatase ácida das plaquetas devido à formação de ânion superóxido. / Abstract: The inhibition of platelet adhesion to the subendothelium by nitric oxide (NO) is essential in preventing excessive aggregation and thrombus formation The objective of this work was to investigate the mechanisms of the NO on inhibition of human platelet adhesion looking for identify of the cGMP-dependent and independent mechanisms Adhesion assay was carried out in the 96-well microtiter plates coated by fibrinogen, using washed platelet (1,2 x 108 plaquetas/mL) from healthy volunteers. Depending on the experimental protocols, non activated or thrombin (50 mU7ml_)-activated platelets were incubated with NO donors (SNP or SIN-1), guanylyl cyclase inhibitor (ODQ), O2" scavenger (SOD) and -(-) epigallocatechin gallate, and allowed to adhere to the wells for either 15 or 60 min at 37°C. Cell toxicity was estimated using the MTT assay by platelets after exposure to NO donors. Nitrated proteins were detected by immunobloting. Purification and identification of them were done by Western blotting analysis and mass spectrometry respectively. Significant platelet adhesion was achieved when non-activated and activated platelets were kept on plates for 15 min or 60. The adhesion was significantly increased when platelets were activated with of thrombin. SNP (0,001 - 1000 nM) inhibited significantly both non-activated and thrombm-stimulated platelet adhesion. The MTT reduction assay showed that the exposure of platelets to SNP (0 1 and 1 mM) caused any toxic effect. Pretreatment of platelets with ODQ nearly abolished SNP (0.1 mM)-mediated cGMP elevation and the inhibition of platelet adhesion, but failed to affect the inhibitory effect of SNP (1 mM) on cell adhesion. Pre-incubation of platelets with SOD, reversed the effect of SNP 1mM. Epigalocatechin gallate did not affect the effect of SNP at 0.1 mM: on the other hand, reduced this effect at 1mM SNP. SIN-1 (0,001 - 100 jiM) concentration-dependently inhibited both non-activated and thrombin-stimulated platelet adhesion. In the higher concentration (1 mM), the SIN-1 inhibited almost all platelet adhesion. Pretreatment of platelets with ODQ markedly reverted the increased the levels of cGMP as well as decreased the inhibition of platelet adhesion by SIN-1 at 0,1 mM. SOD did not change the SIN-1 (0,1 mM)- mediated platelet inhibition, but reverted the platelet inhibition in all another conditions. MTT assay showed that the SIN-1 at 1 mM caused toxic effect in the platelets, and this effect was restored by SOD ECG did not affect the effect of SIN-1, excepted in the small concentration, when the inhibitory effect of thrombin-activated platelets was decreased. Immunobloting indicated the presence of nitrated protein that was recognized as alpha-actinin 1. In conclusion, cGMP-dependent and -independent mechanisms contribute to inhibition of platelet adhesion by NO, and that the a-actinic nitration can be the most important c GMP-independent mechanism. Parallel of this, we observed that the high concentration of SIN-1 decreased the viability and acid phosphatase activity by formation of superoxide anion. / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Marta Helena Krieger / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:25:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MarianaGoncalvesde_M.pdf: 2027053 bytes, checksum: c424b2043397f6d28d8adebb3fc72bd3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O óxido nítrico (NO) é um multifuncional agente biológico que nas últimas décadas tem sido alvo de uma infinidade de estudos e constitui hoje um dos mais importantes mediadores de processos intra e extracelulares. Diversos estudos demonstram sua capacidade de prevenção da ativação e adesão plaquetária ou leucocitária e inibição da proliferação e migração de células musculares lisas vasculares (VSMCs), entretanto, em condições de baixa disponibilidade do NO esses processos são prejudicados. Atualmente há o grande interesse no desenvolvimento de compostos capazes de liberar NO de forma modulada e estável, e, nesse sentido, os complexos nitrosilos de rutênio têm se destacado por suas características excepcionais. É amplamente reconhecido que a modulação fenotípica de VSMCs tem papel crítico na progressão de diversas doenças vasculares proeminentes. Sabe-se que o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) é um dos principais estimulantes desse processo. Este estudo se propôs a caracterizar os efeitos inibitórios do complexo de rutênio trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, nomeado Ru(cyclam)NO, na modulação fenotípica, resposta proliferativa e migratória de VSMCs induzidas por PDGF-BB. VSMCs foram obtidas por técnica de cultura primária. A citotoxicidade do complexo, na faixa de concentração de 100 ?M a 1500 ?M, foi determinada em ensaios de redução do MTT e incorporação neutral red (NR), e comparadas a do nitroprussiato de sódio (SNP). A concentração 100 ?M foi definida para os demais protocolos experimentais. Western blotting, ensaios transwell e wound healing, e incorporação de timidina triciada foram utilizados para determinação da modulação fenotípica, migração e proliferação celular, respectivamente, e níveis de nitrato no meio foram determinados por quimiluminescência para avaliação do perfil de liberação de NO. O complexo demonstrou baixa citotoxicidade, mesmo na maior concentração e após 48 horas de exposição, reduzindo ao máximo em 30% a porcentagem de células viáveis em ambos os ensaios, demonstrando ser menos tóxico que o SNP. Níveis de nitrato no meio atigiram a concentração máxima após 30 minutos (11 ?M ± 4,8), de maneira mais lenta em relação ao SNP, cuja concentração máxima foi após 5 minutos (13 ?M ± 3,7). A proliferação das VSMCs induzida por PDGF-BB foi inibida, reduzindo à metade a radioatividade incorporada, bem como a expressão do marcador de proliferação PCNA. Observou-se redução de 45% na migração induzida por PDGF-BB nos ensaios transwell, e no wound-healing, embora qualitativo, a redução é notável. A modulação fenotípica da VSMC foi observada pela redução em 60% da expressão da proteína alfa-actina, característica do fenótipo maduro, e foi quase totalmente prevenida pelo tratamento com o complexo. Tal prevenção pode ser mediada pelo fator de transcrição ELK-1, que favorece a expressão de genes de diferenciação, e cuja fosforilação foi estimulada pelo PDGF-BB, porém inibida em quase 50% pelo pré-tratamento com Ru(cyclam)NO. As respostas observadas nos tratamentos com Ru(cyclam)NO foram promissoras, e, embora seu mecanismo de ação x ainda não esteja completamente esclarecido, este complexo demonstrou atividade biológica singular, e sua aplicação em condições clínicas onde há descontrole de processos de proliferação e migração de VSMCs, como a reestenose, apresenta-se como uma proposta interessante / Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifuctional biological agent that in the recent decades has been the subject of a plethora of studies and today is one of the most important intracellular and extracellular processes mediators. Several studies have demonstrated its ability to prevent leukocyte or platelet adhesion and activation, and inhibition of vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and migration. However, low availability of NO conditions determines impairement of these processes. There is a keen interest in the development of compounds capable of releasing NO modulated so stable, and the nitrosyl ruthenium complexes have gained prominence for its exceptional features. It is widely recognized that the phenotypic modulation of VSMCs, and its uncontrolled proliferation and migration, plays a critical role in the progression of several prominent vascular diseases. It is known that the platelet-derived growth factor (PDGF) is a primary stimulant of the process. This study aimed to determine the inhibitory effects of the ruthenium complex NO donor trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, named Ru(cyclam)NO, in the phenotypic switching, on migratory and proliferative responses of VSMCs induced by PDGF-BB, and its biological response. VSMCs were obtained from primary culture methodology. The complex cytotoxicity were determined by MTT reduction and incorporation of neutral red (NR) assays, in the range of concentration from 100 ?M to 1500 ?M, and compared to sodium nitroprusside (SNP). For the following experimental protocols the concentration of the 100 ?M was set. Western blotting, transwell and wound healing assays, and incorporation of tritiated thymidine were used for determination of phenotypic switching, cell migration and proliferation, respectively. Evaluation of the NO profile release was determined as nitrate levels in the culture medium by chemiluminescence. The complex Ru(cyclam)NO showed low cytotoxicity even at the highest concentration evaluated and after 48 hours of exposition, reducing only 30% the percentage of viable cells in both trials, showing be less toxic than the SNP. Medium nitrate levels exibhited the highest concentration after 30 min (11 ?M ± 4.8), slower when compared to SNP, which reached the maximum concentration after 5 minutes (13 ?M ± 3.7). The proliferation of VSMCs induced by PDGF-BB was inhibited by half of the radioactivity incorporated counting, as well as the reduction on the expression of the proliferation marker PCNA. Observed a reduction by 45% in the migration induced by PDGF-BB determined in transwell assays, and on the wound-healing, although a qualitative result, the reduction of migration induced by PDGF-BB. The 60% reduction by PDGF-BB treatment of the contractile protein expression ?-SMA, characteristic of mature phenotype, revealed the modulation of VSMCs phenotype, and it was almost completely prevented by treatment with the complex. Such prevention was associated with inhibition by almost 50% of phosphorylation of the transcription factor ELK-1 stimulated by PDGF-BB. The responses determined with complex treatments revealed promising for future development of cardiovascular devices. Although its xii mechanism of action is not completely understood, this complex showed singular biological activity, and its application in some clinical conditions where there is uncontrolled proliferation and migration of VSMCs presents as a substancial proposal / Mestrado / Fisiologia / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Polymer-based drug delivery systems represent one of the promising strategies for successful tumor treatment. Conjugation of a low-molecular-weight drug to a syn- thetic polymer carrier enables targeted drug delivery to tumor tissue/cells and limited systemic toxicity of the drug. The conjugates show extended circulation time, and preferentially accumulate in tumor tissue due to the Enhanced Permeability and Re- tention (EPR) effect. The EPR effect depends on a structural anomaly in tumor neovasculature, and vasodilators were shown to enhance the EPR effect via an in- crease of blood supply in the tumor. Polymer drug carriers based on water-soluble N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide (HPMA) benefit from variable architecture, drug loading and controlled release. HPMA-based conjugates with cancerostatics have al- ready proved high anti-tumor activity, inducing complete tumor regression followed by resistance to a second tumor challenge in experimental murine models. Three HPMA-based conjugates with organic nitrates (labeled 1, 2, and 3) were pre- pared as polymer donors of nitric oxide (NO) with the aim to intensify the EPR effect, thereby enhancing accumulation of co-administered macromolecular cancerostatics in the tumor. In this study, the conjugates were non-toxic to cancer cells and did not potentiate...