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Síntese e relações estrutura-atividade de dipeptidil-nitrilas inibidoras da cruzaína / Synthesis and Structure-Activity Relationships of Dipeptidyl nitrile inhibitors of cruzain

Orozco, Erika Vanessa Meñaca 27 November 2014 (has links)
A cruzaína é a principal cisteíno protease encontrada no parasito Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da Doença de Chagas. A enzima é essencial para o desenvolvimento e sobrevivência do parasito dentro do hospedeiro e possui uma excelente validação pré-clínica como alvo susceptível à ação de fármacos. Várias classes de inibidores peptídicos reversíveis e irreversíveis, baseados no estado de transição, inibem efetivamente a cruzaína. No entanto, a maioria destes inibidores ainda não apresenta perfis farmacodinâmicos/farmacocinéticos adequados e/ou estão relacionados com potenciais efeitos fora do alvo (do inglês, off-target). Com o objetivo de encontrar inibidores mais eficientes e seletivos, foi aplicado uma abordagem de planejamento de ligantes baseada em hipótese, combinando quiminformática, síntese orgânica, ensaios bioquímicos e determinação do modo de interação para validar os compostos planejados como inibidores de cruzaína. Neste trabalho, é mostrado um conjunto de dipeptidil-nitrilas que foram sintetizadas e avaliadas com base nestes métodos para investigar as interações nos subsítios S1, S2 e S3 de cruzaína. Nossos resultados demonstram o sucesso da abordagem aplicada que resultou na identificação de vários inibidores da cruzaína em concentrações que chegam a sub-micromolar. Alguns dos compostos dessa classe de dipeptidil-nitrilas também são agentes tripanossomicidas por apresentar concentrações efetivas com formas infectivas do T. cruzi em baixo micromolar. / Cruzain is the major cysteine protease found in the parasite Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The enzyme is essential for the development and survival of the parasite within host cells, having excellent pre-clinical validation evidence as a druggable target. Several classes of peptide inhibitors including transition state-based reversible and irreversible ones effectively inhibit cruzain. However, most of these inhibitors still have poor PK/PD profiles and are related with potential off target effects. In order to find more efficient and selective inhibitors, we have applied the hypothesis driven ligand design approach, combining cheminformatics, organic synthesis, biochemical assays and mode of binding determination to validate the designed compounds as cruzain inhibitors. Here, we show a set of dipeptidyl nitriles that were synthetized and evaluated based on these methods to probe interactions at S1, S2 and S3 pockets of cruzain binding site. Our results unveil the success of the applied approach that yielded in the identification of several cruzain inhibitors at sub-micromolar concentrations. Some of the compounds of this class of dipeptidyl nitriles are also trypanocidal agents with effective concentrations in the low micromolar range against infective forms of T. cruzi.
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Modificações no grupo ciano, em nitrilas alifáticas, pela substituição de alfa-beta-gama-delta metilenas por enxofre, Frequência de estiramento e basicidade relativas pela espectroscopia no infravermelho / Infrared cyano group stretching frequencies and relative basicities of unsubstituted and thio-substituted nitriles

Liliana Marzorati 18 June 1976 (has links)
Neste trabalho investigamos a influência de alquiltio grupos sobre a basicidade e frequência de estiramento do ciano grupo de nitrilas alifáticas. Com esta finalidade foi estudada uma grande série de nitrilas alquiltio-substituidas em posição α, β γ, e δ, além de nitrilas não substituídas, incluídas para efeito de comparação. A série completa compõe-se dos seguintes compostos: acetonitrila, propionitrila, butironitrila, valeronitrila, hexanonitrila, heptanonitrila, octanonitrila, isobutironitrila, 2-metilvaleronitrila, pivalonitrila, 2,2\'-dimetilvaleronitrila, metiltioacetonitrila, α-metiltiopropionitrila, etiltioacetonitrila, α-etiltiopropionitrila, α-etiltioisobutironitrila, α-terc-butiltioacetonitrila, β-etiltiopropionitrila, β-etiltiobutironitrila, γ-etiltiobutironitrila e δ-etiltiovaleronitrila. É apresentada uma revisão bibliográfica na qual são abordados aspectos de estrutura, características espectrais e habilidade de formação de ponte de hidrogênio do ciano grupo de nitrilas, além de serem relatados trabalhos concernentes à auto-associação e momento dipolar de tais compostos. São fornecidos os dados de medidas de deslocamentos da frequência do grupo hidroxila do fenol e p-clorofenol (Δvo(OH)) em complexo 1:1 com as nitrilas estudadas, em tetracloreto de carbono, pelo emprego da espectroscopia no infravermelho. São apresentadas as frequências de estiramento do ciano grupo (vo (CN)) das mesmas nitrilas, em tetracloreto de carbono. São descritas as sínteses de algumas das nitrilas da série estudada, a saber: hexanonitrila, heptanonitrila, 2-metilvaleronitrila, 2,2\'-dimetilvaleronitrila, etiltioacetonitrila, α-etiltioisobutironitrila e γ-etiltiobutironitrila. Feita uma análise dos resultados das medidas realizadas, conclue-se que: 1) as nitrilas α-alquiltio-substituídas apresentam uma diminuição da basicidade e uma diminuição da frequência de estiramento do ciano grupo, com relação aos compostos análogos não substituídos; 2) as nitrilas &#946-etiltio-substituídas apresentam uma ligeira diminuição de basicidade em comparação com os compostos não substituídos correspondentes; 3) a introdução de um etiltio grupo nas posições γ e δ não produz qualquer alteração na basicidade do ciano grupo. Urna discussão é apresentada, focalizando-se a validade dos resultados de basicidade obtidos, assim como a sua atribuição. É eliminada a possibilidade da competição do átomo de enxofre na medida de basicidade do ciano grupo. São excluídas, também, as hipóteses de o impedimento estérico e o efeito indutivo do enxofre serem os únicos efeitos responsáveis pela diminuição de basicidade do ciano grupo, observada em β-alquiltio-nitrilas. Os resultados relatados para as α-, β-, γ-e δ-alquiltio-nitrilas, investigadas pelo emprego de sistema ternário, são comparados com os anteriormente obtidos por B.Wladislaw e col, em sistema ternário. Observa-se concordância no caso de nitrilas α-alquiltio-substituídas, mas não no de nitrilas com enxofre em posições mais afastadas, para as quais, em sistema binário, foi relatado um aumento de basicidade. Discutem-se as divergências observadas, sugerindo-se a possibilidade da ocorrência, no caso de sistema binário, de uma associação intra ou intermolecular envolvendo o enxofre e o ciano-grupo. Finalmente, é sugerida a interação entre enxofre e ciano grupo como provável causa da diminuição de basicidade em α-alquiltio-nitrilas. É aventada a hipótese de que a ligeira diminuição de basicidade em β-etiltio-nitrilas, observada em sistema ternário, seja proveniente do efeito indutivo do enxofre. / This thesis investigates the influence of alkylthio-groups on the basicities and stretching frequencies of the cyano-group of aliphatic nitriles. A large series of alkylthio- and unsubstituted nitriles was studied, including the following compounds: acetonitrile, propionitrile, butyronitrile, valeronitrile, capronitrile, heptanenitrile, octanenitrile, isobutyronitrile, 2-methylvaleronitrile, trimethylacetonitrile, 2,2\'-dimethylvaleronitrile, methylthioacetonitrile, α-methylthiopropionitrile, ethylthioacetonitrile, α-ethyl-thiopropionitrile, α-ethylthioisobutyronitrile, α-tert-butylthioacetonitrile, β.ethylthiopropionitrile, β-ethylthiobutyronitrile, γ-ethylthiobutyronitrile and &#948-ethylthiovaleronitrile. The thesis contains: A literature review on the structure, polarity and hydrogen bonding ability of the cyano-group of aliphatic nitriles, as well as self-association and dipolar moments of the same compounds. The data of relative basicities (Δvo(OH)) of the cyano-group as measured by i.r. shifts of OH stretching vibration of phenol and p-chlorophenol associated to the above mentioned nitriles (1:1), in carbon tetrachloride. The stretching frequencies (vo (CN)) of the cyano-group for the same nitriles, in carbon tetrachloride. The syntheses of the following compounds: capronitrile, heptanenitrile, 2-methylvaleronitrile, 2,2\'-dimethylvaleronitrile, ethylthioacetonitrile, α-ethlthioisobutyronitrile and γ-ethylthiobutyronitrile. The Δvo(OH) measurements show that: 1) the α-alkylthio-nitriles are less basic than the corresponding unsubstituted nitriles; 2) there is a slight decrease of the cyano-group basicity when the β-methylene-group is replaced by a sulphur atom; 3) the nitriles, in which sulphur atom and cyano-group are apart by three or four methylene-groups, do not undergo any change in the basicity. Several aspects are discussed in the light of the obtained data. Thus, evidences are provided that the decrease of basicity observed is a measure of the cyano-group basicity, without any competition of the sulphur atom. The hypotheses of steric hindrance and inductive effect as responsible for the decrease of the cyano-group basicity in the α-alkylthio-nitriles are excluded. The basicity data obtained for α-, β-, γ- and δ-alkylthio-nitriles, in ternary system, are compared with those reported, previously, by B.Wladislaw et al., for binary system. While our results for the &#945-derivatives are in accord with the previous ones, those for the nitriles with sulphur further removed from the cyano-group are contrasting. The increase of basicity for the latter compounds, observed previously, is tentatively explained by intra- or intermolecular association involving the cyano-group and sulphur atom. Finally, an interaction between cyano-group and sulphur is suggested as responsible for the decrease of basicity in the α-alkylthio-nitriles. The slight decrease of basicity, observed for the β-derivatives, is suggested to be best explained as due to the inductive effect of sulphur atom.
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Síntese e relações estrutura-atividade de dipeptidil-nitrilas inibidoras da cruzaína / Synthesis and Structure-Activity Relationships of Dipeptidyl nitrile inhibitors of cruzain

Erika Vanessa Meñaca Orozco 27 November 2014 (has links)
A cruzaína é a principal cisteíno protease encontrada no parasito Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da Doença de Chagas. A enzima é essencial para o desenvolvimento e sobrevivência do parasito dentro do hospedeiro e possui uma excelente validação pré-clínica como alvo susceptível à ação de fármacos. Várias classes de inibidores peptídicos reversíveis e irreversíveis, baseados no estado de transição, inibem efetivamente a cruzaína. No entanto, a maioria destes inibidores ainda não apresenta perfis farmacodinâmicos/farmacocinéticos adequados e/ou estão relacionados com potenciais efeitos fora do alvo (do inglês, off-target). Com o objetivo de encontrar inibidores mais eficientes e seletivos, foi aplicado uma abordagem de planejamento de ligantes baseada em hipótese, combinando quiminformática, síntese orgânica, ensaios bioquímicos e determinação do modo de interação para validar os compostos planejados como inibidores de cruzaína. Neste trabalho, é mostrado um conjunto de dipeptidil-nitrilas que foram sintetizadas e avaliadas com base nestes métodos para investigar as interações nos subsítios S1, S2 e S3 de cruzaína. Nossos resultados demonstram o sucesso da abordagem aplicada que resultou na identificação de vários inibidores da cruzaína em concentrações que chegam a sub-micromolar. Alguns dos compostos dessa classe de dipeptidil-nitrilas também são agentes tripanossomicidas por apresentar concentrações efetivas com formas infectivas do T. cruzi em baixo micromolar. / Cruzain is the major cysteine protease found in the parasite Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The enzyme is essential for the development and survival of the parasite within host cells, having excellent pre-clinical validation evidence as a druggable target. Several classes of peptide inhibitors including transition state-based reversible and irreversible ones effectively inhibit cruzain. However, most of these inhibitors still have poor PK/PD profiles and are related with potential off target effects. In order to find more efficient and selective inhibitors, we have applied the hypothesis driven ligand design approach, combining cheminformatics, organic synthesis, biochemical assays and mode of binding determination to validate the designed compounds as cruzain inhibitors. Here, we show a set of dipeptidyl nitriles that were synthetized and evaluated based on these methods to probe interactions at S1, S2 and S3 pockets of cruzain binding site. Our results unveil the success of the applied approach that yielded in the identification of several cruzain inhibitors at sub-micromolar concentrations. Some of the compounds of this class of dipeptidyl nitriles are also trypanocidal agents with effective concentrations in the low micromolar range against infective forms of T. cruzi.
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Modificações no ciano grupo, em nitrilas alifáticas, pela substituição de α, β, γ, δ metilenas por enxofre. Basicidades relativas e constantes de associação pela ressonância magnética nuclear / Modifications in the cyano-group, in aliphatic nitriles, by replacing α, β, γ, δ metilenas sulfur. Relative basicities and constant association by nuclear magnetic resonance

Marino Tadeu Fabi 20 August 1976 (has links)
Neste trabalho, é investigado o efeito exercido por grupos alquiltio, sobre a basicidade de nitrilas alifáticas. Com esta finalidade, foi estudada uma extensa série de nitrilas alquiltio-substituídas em posição α, β, γ e δ, juntamente com nitrilas não substituídas, escolhidas para efeito de comparação. O conjunto de compostos investigados foi o seguinte: acetonitrila, propionitrila, butironitrila, valeronitrila, hexanonitrila, heptanonitrila, octanonitrila, isobutironitrila, 2-metilvaleronitrila, pivalonitrila, 2,2\'-dimetilvaleronitrila, metiltioacetonitrila, α-metiltiopropionitrila, etiltioacetonitrila, α-etiltiopropionitrila, α-etiltioisobutironitrila, terc-butiltioacetonitrila, β-etiltiopropionitrila, β-etiltiobutironitrila, γ-etiltiobutironitrila, δ-etiltiovaleronitrila e etilselenoacetonitrila. É apresentada inicialmente, uma revisão bibliográfica sobre vários aspectos eletrônicos e estruturais do ciano grupo, incluindo potenciais de ionização e participação de orbitais moleculares na formação de pontes de hidrogênio. são também apresentados métodos utilizados para a determinação de constantes de associação aceptor-doador pela ressonância magnética nuclear. São fornecidos os resultados de basicidade relativa das nitrilas não substituídas e α-alquiltio-nitrilas. Tais dados foram obtidos através de medidas dos deslocamentos químicos, na r.m.n., dos protons de doadores, fenol e p-clorofenol, em sistemas ternários nitrila-doador fenólico-tetracloreto de carbono. São apresentados também, valores de constantes de associação para os mesmos sistemas, determinados pelo emprego do método de Benesi e Hildebrand. São apresentados os dados de deslocamentos químicos e de constante de associação para as β-, γ- e δ-etiltionitrilas e nitrilas não substituídas correspondentes pelo estudo de sistemas ternários nitrila-doador fenólico-tetracloreto de carbono. São fornecidos os deslocamentos químicos do próton etinílico do fenilacetileno associado às nitrilas β-, γ- e δ-etiltio-substituídas e nitrilas não substituídas correspondentes, em sistema binário. São descritas as preparações de nove nitrilas a saber: butironitrila, octanonitrila, isobutironitrila, metiltioacetonitrila, α-etiltiopropionitrila, β-etiltiopropionitrila, β-etiltiobutironitrila, δ-etiltiovaleronitrila e etilselenoacetonitrila, das quais, três são compostos novos. Os resultados obtidos permitem concluir que: a) a associação com doador de protons, em α-alquiltionitrilas, ocorre no ciano grupo e não no enxofre; b) as nitrilas α-alquiltio-substituídas apresentam uma diminuição de basicidade com relação aos análogos não substituídos; c) as nitrilas β-etiltio-substituídas, estudadas nos sistemas ternários, apresentam basicidade ligeiramente menor do que as correspondentes não substituídas; d) a substituição de um grupo metilena em posições afastadas (γ e δ), em relação ao ciano grupo, por enxofre, não conduz a alteração de basicidade quando as medidas são efetuadas em sistemas ternários e provoca um aumento da basicidade quando se trabalha em sistemas binários. São discutidas as causas da diminuição de basicidade em α-alquiltio-nitrilas. A influência dos efeitos estérico e indutivo, como únicos determinantes desta diminuição, é excluída devido à diminuição de frequência de estiramento do ciano grupo nestes compostos e ao resultado de basicidade e frequência da etilselenoacetonitrila. Discute-se a divergência de resultados na série de nitrilas β-, γ- e δ-etiltio-substituídas, nos sistemas ternários e binários. É sugerida a hipótese da transferência de carga intra ou intermolecular, envolvendo o enxofre e o ciano grupo, em tais compostos. Finalmente, é proposta a interação entre enxofre e ciano grupo, como causa preponderante para a diminuição de basicidade em α-alquiltio-nitrilas. É também sugerido, que a pequena diminuição de basicidade, observada para as β-etiltio-nitrilas, em sistema ternário, seja devida ao efeito indutivo do enxofre. / The effects of alkylthio groups on the basicities of aliphatic nitriles have been investigated. A large number of unsubstituted and alkylthio-nitriles have been studied, including the following compounds: acetonitrile, propionitrile, butyronitrile, valeronitrile, hexanenitrile, heptanenitrile, octanenitrile, isobutyronitrile, 2-methylvaleronitrile, trimethylacetonitrile, 2,2\'-dimethylvaleronitrile, methylthioacetonitrile, α-methylthiopropionitrile, ethylthioacetonitrile, α-ethylthiopropionitrile, α-ethylthioisobutyronitrile, tert-butylthioacetonitrile, β-ethylthiopropionitrile, β-ethyl thiobutyronitrile, δ-ethylthiovaleronitrile and ethylselenoacetonitrile. A literature review on several electronic and structural aspects of the cyano-group, in aliphatic nitriles, like its ionization potentials and its hydrogen bonding ability as measured by n.m.r. spectroscopy, is presented, as well as the methods of determination of association constants by n.m.r. spectroscopy. The relative basicities data measured from hydrogen chernical shifts of phenol and p-chlorofenol associated to the above nitriles, in ternary systems, using carbon tetrachloride as solvent, are reported. The association constants for the same systems, determined by Benesi-Hildebrand method are given. The relative basicities data of β-, γ- and δ-alkylthio-nitriles measured from chemical shifts of phenylacetylene, in binary systems, are presented. The syntheses of the following nitriles: butyro nitrile, octanenitrile, isobutyronitrile, methylthioacetonitrile, α-ethylthiopropionitrile, β-ethylthiopropionitrile, β-ethylthiobutyronitrile, δ-ethylthiovaleronitrile and ethylselenoacetonitrile, are described. The following conclusions and suggestions are presented: 1) in α-alkylthio-nitriles, the association with proton donors, takes place on the cyano group instead of on the sulphur; 2) the α-alkylthio-nitriles are weaker bases than the corresponding unsubstituted nitriles; 3) in ternary systems, β-alkylthio-nitriles are slightly less basic than the corresponding unsubstituted compounds; 4) in binary systems β-alkylthio-nitriles are stronger bases than the corresponding unsubstituted compound; 4) in ternary systems, γ- and δ-alkylthio-nitriles do not show any change in basicity in confront with unsubstituted compounds, but an increase in basicity is observed in binary systems. The hypothesis of the steric hindrance to proton donor association and the one of the inductive effect of the sulfur atom, as the only factors responsibles for the decrease of cyano-group basicity in α-alkylthio-nitriles, have been excluded. The divergency of the relative basicities of β-, γ- and δ-alkylthio-nitriles, obtained by measurements in ternary and binary systems is attributed to an intra- or intermolecular charge transfer involving the sulphur atom and the cyano-group. Lastly, an interaction between the cyano-group and the sulphur atom is suggested as responsible for the decrease of the basicity observed for the α-alkylthio-nitriles. The slight decrease of basicity observed for the β-derivatives in ternary systems, is attributed to the inductive effect of the sulphur atom.
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Determinação da afinidade e assinatura termodinâmica de inibidores da cruzaína por calorimetria de titulação isotérmica / Determination of Thermodynamic Profile and Binding Constant of Cruzain Inhibitors using Isothermal Titration Calorimetry

Prokopczyk, Igor Muccilo 22 July 2016 (has links)
A enzima cruzaína é um alvo validado e promissor para a descoberta de agentes tripanossomicidas. A validação desta enzima estimulou o desenvolvimento de vários inibidores ao longo dos últimos vinte anos. A descoberta de novos compostos, provenientes de classes químicas distintas, mais seguros e eficazes representa uma importante contribuição para o desenvolvimento da quimioterapia da doença de Chagas. Dentre essas classes, encontram-se as dipeptidil-nitrilas, que apresentam alta potência contra a cruzaína e são conhecidamente inibidores covalente-reversíveis. Estudos de afinidade através de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) são fundamentais na compreensão de sistemas bioquímicos e viabilizam a determinação dos parâmetros termodinâmicos. A ITC possibilita determinar com precisão e acurácia os valores de Kd(1/Ka), ΔH,ΔG,ΔS e ΔCp e com esses parâmetros pode-se traçar facilmente o perfil termodinâmico dos ligantes. No presente trabalho, a enzima selvagem cruzaína bem como sua forma mutante C25S foram preparadas e, pela primeira vez, foi realizado o estudo de afinidade através da ITC para 16 dipeptidil-nitrilas usadas como inibidores da cruzaína. O perfil termodinâmico (TP) foi obtido e observado como entálpico-dirigido com compensação entrópica desfavorável. A fatoração da energia livre ( ΔG) de interação foi usada para avaliar os efeitos causados pelas substituições em P1, P2 e P3 na energética, sugerindo uma correlação direta entre a afinidade e a otimização entálpica/entrópica. As substituições avaliadas promoveram um aumento de 10 a 20 vezes na afinidade da cruzaína pelo inibidor. Estudos em diferentes tampões foram realizados para a determinação da influência do efeito de ionização na afinidade. Foi determinado o valor de ΔCp do complexo cruzaína-Neq0409 e a relação de ΔHITC com ΔHvH. O Neq0569 foi testado contra a proteína mutante C25A, tendo sido observada inversão da assinatura que passou a ser entropicamente dirigida. Além disso, uma redução de 176 vezes na afinidade foi observada, demonstrando a importância da ligação covalente-reversível para o aumento da afinidade. / The enzyme cruzain is a validated and promising target for the discovery of trypanocidal agents. The validation of this enzyme has stimulated the development of several inhibitors over the past twenty years. The discovery of new compounds from different chemical classes, which are safer and more effective is an important contribution to the development of chemotherapy of Chagas disease. Among known classes are the dipeptidyl nitriles that exhibit high cruzain affinity and are known to be covalent-reversible inhibitors. Molecular optimization requires a rigorous assessment of physicochemical properties, including the thermodynamic characterization of molecular forces that govern cruzain-inhibitor interactions. Affinity studies through Isothermal Titration Calorimetry (ITC) are fundamental in understanding biochemical systems and enable the determination of thermodynamic parameters. The ITC tool provides the determination of Kd values (1/Ka), ΔH, ΔG, ΔS and ΔCp accurately and precisely. These parameters can easily be used to draw the thermodynamic profile of ligands. In this study, the wild type cruzain enzyme and its mutant form C25S were prepared and, for the first time by the best of our knowledge, the study was conducted by ITC for 16 dipeptidyl nitriles used as inhibitors of cruzain enzyme, which is a hydrolase. The thermodynamic profile (TP) was obtained and observed to be enthalpy-driven with unfavorable entropic compensation. The free energy factorization (ΔG) interaction was used to evaluate the effects caused by substitutions in P1, P2 and P3 in energy, thereby suggesting a direct correlation between the affinity and the enthalpy/entropy optimization. Substitutions made possible to observe an increase of 10 to 20 times higher than the affinity for previous cruzain inhibitors. Studies on different buffers were performed to determine the influence of ionizing effect on affinity. The ΔCp value was determined for cruzain-Neq0409 complex and its ΔHITC relationship with ΔHvH was also evaluated. Neq0569 was tested against the mutant protein C25A, having been observed reversal of the signature which became entropy driven. Furthermore, a reduction of 176-fold in the affinity was observed, demonstrating the importance of covalent-reversible binding to increase affinity.
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Inibidores de Cisteíno Proteases como Candidatos Terapêuticos para o Tratamento de Doenças Parasitárias / Cysteine Protease Inhibitors as Therapeutic Candidates for the Treatment of Parasitic Diseases

Ribeiro, Jean Francisco Rosa 25 June 2018 (has links)
<p align=\"justify\">A necessidade urgente de descoberta de terapias mais seguras e eficazes para o tratamento da doença de Chagas e leishmanioses tem motivado a pesquisa por novos inibidores das enzimas cruzaína e CPB, as principais cisteíno proteases do T. cruzie e Leishmania spp., respectivamente. Uma série de 52 compostos nitrílicos que atuam como inibidores covalente-reversíveis de cisteíno proteases foi sintetizada no grupo NEQUIMED/IQSC/USP e avaliada quanto a sua atividade inibitória contra as enzimas cruzaína, CPB de Leishmania mexicana e catepsina L de humanos. Utilizando planejamento molecular baseado em hipótese, mapeamos as relações estrutura-atividade (SARs) desses inibidores através de variações nas posições P1, P2, P3 e P1\' do esqueleto dipeptidil nitrílico. A substituição do grupo eletrofílico (warhead) aminonitrila em P1 pelo grupo azanitrila melhorou a afinidade em duas ordens de magnitude para todos os alvos avaliados. Um dos mais potentes inibidores, o análogo azanitrila Neq0690 mostrou uma cinética de ligação lenta com valores de pKi de 8,8, 9,3 e 9,7 para cruzaína, catepsina L e LmCPB, respectivamente. A substituição bioisostérica da ligação amida entre as posições P2-P3 pelo grupo trifluoroetilamina resultou na síntese do Neq0659, um potente inibidor com um perfil de ação seletivo para as proteases de parasitos. A substituição do grupo metileno em P1 pelo ciclopropano aumentou a afinidade para todas as enzimas. Contudo, uma inibição seletiva da cruzaína e LmCPB foi associada à presença do grupo (R)-benzila como substituinte da posição P1 dos derivados CF3 substituídos. Embora os compostos substituídos com leucina, tirosina, triptofano e 3-cloro fenilalanina como substituintes da posição P2 foram relativamente bem tolerados pela cruzaína e catepsina L, uma restrita especificidade foi verificada para LmCPB com pequenos ganhos de afinidade para os inibidores que possuíam os grupos leucina e metil benzoato como substituintes dessa posição. Com relação à posição P3, a inserção do grupo 3-terc-butilpirazol e 3-bromo piridina aumentou a afinidade para todos os alvos avaliados enquanto que um ganho seletivo para a LmCPB foi observado para os compostos que possuíam o grupo bifenila nessa posição. Além disso, duas novas estruturas cristalográficas da LmCPB complexada com o Neq0690 e metil metanotiossulfonato (MMTS) foram determinadas com resoluções de 1,3 Å e 1,5 Å, respectivamente. As estruturas dos co-complexos revelaram os modos de interação (MoB) desses ligantes, bem como as principais características do processo de reconhecimento bimolecular. Isso permitirá o uso de estratégias de planejamento baseado na estrutura do alvo com translação natural para a pesquisa por novos inibidores de cisteíno proteases, com amplo espectro de ação na quimioterapia de doenças a elas relacionadas. / <p align=\"justify\">The urgent need for the discovery of safer and more effective therapies for the treatment of Chagas disease and leishmaniasis has motivated the search for new inhibitors of the enzymes cruzain and CPB, the major T. cruzi and Leishmania spp. cysteine proteases, respectively. A series of 52 nitrile-containing compounds acting as covalent-reversible inhibitors of cysteine proteases was synthesized at the NEQUIMED/IQSC/USP Medicinal Chemistry Group and evaluated for their inhibitory activity against the enzymes cruzain, Leishmania mexicana CPB and cathepsin L from humans. Using hypothesis-driven molecular design, we mapped the structure-activity relationships (SARs) of these inhibitors through variations in the P1, P2, P3 and P1\' positions of the dipeptidyl nitrile scaffold. The substitution of the aminonitrile by the azanitrile group improved the affinity by two orders of magnitude for all the evaluated targets. One of the most potent inhibitors, the azanitrile analogue dubbed Neq0690 showed a slow-binding kinetics with pKi values of 8.8, 9.3 and 9.7 for cruzain, cathepsin L and LmCPB, respectively. Bioisosteric substitution of the amide moiety between the P2-P3 positions by the trifluoroethylamine group resulted in the synthesis of Neq0659, a potent inhibitor with a selective action profile for parasite proteases. Substitution of the methylene group at P1 by cyclopropane increased the affinity for all enzymes. However, selective inhibition of cruzain and LmCPB was associated with the presence of the (R)-benzyl group as substituent of the P1 position of the substituted CF3 derivatives. Although leucine, tyrosine, tryptophan and 3-chloro phenylalanine substituted compounds as substituents of the P2 position were relatively well tolerated by cruzain and cathepsin L, a restricted specificity was verified for LmCPB with small affinity gains for the inhibitors possessing the leucine and methyl benzoate as substituents of that position. Regarding the P3 position, the insertion of the 3-tert-butylpyrazole and 3-bromo pyridine groups increased the affinity for all evaluated targets whereas a selective gain for LmCPB was observed for the compounds having the biphenyl moiety at that position. In addition, it is noteworthy that two new crystallographic structures of LmCPB complexed with Neq0690 and methyl methanethiosulfonate (MMTS) were determined with resolutions of 1.3 Å and 1.5 Å, respectively. The structures of the co-complexes revealed the modes of binding (MoB) of these ligands, as well as the main characteristics of the bimolecular recognition process. This will allow the natural translational target structure strategies for the search for new inhibitors of cysteine proteases with broad spectrum of action in the chemotherapy of related diseases.
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Determinação da afinidade e assinatura termodinâmica de inibidores da cruzaína por calorimetria de titulação isotérmica / Determination of Thermodynamic Profile and Binding Constant of Cruzain Inhibitors using Isothermal Titration Calorimetry

Igor Muccilo Prokopczyk 22 July 2016 (has links)
A enzima cruzaína é um alvo validado e promissor para a descoberta de agentes tripanossomicidas. A validação desta enzima estimulou o desenvolvimento de vários inibidores ao longo dos últimos vinte anos. A descoberta de novos compostos, provenientes de classes químicas distintas, mais seguros e eficazes representa uma importante contribuição para o desenvolvimento da quimioterapia da doença de Chagas. Dentre essas classes, encontram-se as dipeptidil-nitrilas, que apresentam alta potência contra a cruzaína e são conhecidamente inibidores covalente-reversíveis. Estudos de afinidade através de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) são fundamentais na compreensão de sistemas bioquímicos e viabilizam a determinação dos parâmetros termodinâmicos. A ITC possibilita determinar com precisão e acurácia os valores de Kd(1/Ka), &Delta;H,&Delta;G,&Delta;S e &Delta;Cp e com esses parâmetros pode-se traçar facilmente o perfil termodinâmico dos ligantes. No presente trabalho, a enzima selvagem cruzaína bem como sua forma mutante C25S foram preparadas e, pela primeira vez, foi realizado o estudo de afinidade através da ITC para 16 dipeptidil-nitrilas usadas como inibidores da cruzaína. O perfil termodinâmico (TP) foi obtido e observado como entálpico-dirigido com compensação entrópica desfavorável. A fatoração da energia livre ( &Delta;G) de interação foi usada para avaliar os efeitos causados pelas substituições em P1, P2 e P3 na energética, sugerindo uma correlação direta entre a afinidade e a otimização entálpica/entrópica. As substituições avaliadas promoveram um aumento de 10 a 20 vezes na afinidade da cruzaína pelo inibidor. Estudos em diferentes tampões foram realizados para a determinação da influência do efeito de ionização na afinidade. Foi determinado o valor de &Delta;Cp do complexo cruzaína-Neq0409 e a relação de &Delta;HITC com &Delta;HvH. O Neq0569 foi testado contra a proteína mutante C25A, tendo sido observada inversão da assinatura que passou a ser entropicamente dirigida. Além disso, uma redução de 176 vezes na afinidade foi observada, demonstrando a importância da ligação covalente-reversível para o aumento da afinidade. / The enzyme cruzain is a validated and promising target for the discovery of trypanocidal agents. The validation of this enzyme has stimulated the development of several inhibitors over the past twenty years. The discovery of new compounds from different chemical classes, which are safer and more effective is an important contribution to the development of chemotherapy of Chagas disease. Among known classes are the dipeptidyl nitriles that exhibit high cruzain affinity and are known to be covalent-reversible inhibitors. Molecular optimization requires a rigorous assessment of physicochemical properties, including the thermodynamic characterization of molecular forces that govern cruzain-inhibitor interactions. Affinity studies through Isothermal Titration Calorimetry (ITC) are fundamental in understanding biochemical systems and enable the determination of thermodynamic parameters. The ITC tool provides the determination of Kd values (1/Ka), &Delta;H, &Delta;G, &Delta;S and &Delta;Cp accurately and precisely. These parameters can easily be used to draw the thermodynamic profile of ligands. In this study, the wild type cruzain enzyme and its mutant form C25S were prepared and, for the first time by the best of our knowledge, the study was conducted by ITC for 16 dipeptidyl nitriles used as inhibitors of cruzain enzyme, which is a hydrolase. The thermodynamic profile (TP) was obtained and observed to be enthalpy-driven with unfavorable entropic compensation. The free energy factorization (&Delta;G) interaction was used to evaluate the effects caused by substitutions in P1, P2 and P3 in energy, thereby suggesting a direct correlation between the affinity and the enthalpy/entropy optimization. Substitutions made possible to observe an increase of 10 to 20 times higher than the affinity for previous cruzain inhibitors. Studies on different buffers were performed to determine the influence of ionizing effect on affinity. The &Delta;Cp value was determined for cruzain-Neq0409 complex and its &Delta;HITC relationship with &Delta;HvH was also evaluated. Neq0569 was tested against the mutant protein C25A, having been observed reversal of the signature which became entropy driven. Furthermore, a reduction of 176-fold in the affinity was observed, demonstrating the importance of covalent-reversible binding to increase affinity.
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Inibidores de Cisteíno Proteases como Candidatos Terapêuticos para o Tratamento de Doenças Parasitárias / Cysteine Protease Inhibitors as Therapeutic Candidates for the Treatment of Parasitic Diseases

Jean Francisco Rosa Ribeiro 25 June 2018 (has links)
<p align=\"justify\">A necessidade urgente de descoberta de terapias mais seguras e eficazes para o tratamento da doença de Chagas e leishmanioses tem motivado a pesquisa por novos inibidores das enzimas cruzaína e CPB, as principais cisteíno proteases do T. cruzie e Leishmania spp., respectivamente. Uma série de 52 compostos nitrílicos que atuam como inibidores covalente-reversíveis de cisteíno proteases foi sintetizada no grupo NEQUIMED/IQSC/USP e avaliada quanto a sua atividade inibitória contra as enzimas cruzaína, CPB de Leishmania mexicana e catepsina L de humanos. Utilizando planejamento molecular baseado em hipótese, mapeamos as relações estrutura-atividade (SARs) desses inibidores através de variações nas posições P1, P2, P3 e P1\' do esqueleto dipeptidil nitrílico. A substituição do grupo eletrofílico (warhead) aminonitrila em P1 pelo grupo azanitrila melhorou a afinidade em duas ordens de magnitude para todos os alvos avaliados. Um dos mais potentes inibidores, o análogo azanitrila Neq0690 mostrou uma cinética de ligação lenta com valores de pKi de 8,8, 9,3 e 9,7 para cruzaína, catepsina L e LmCPB, respectivamente. A substituição bioisostérica da ligação amida entre as posições P2-P3 pelo grupo trifluoroetilamina resultou na síntese do Neq0659, um potente inibidor com um perfil de ação seletivo para as proteases de parasitos. A substituição do grupo metileno em P1 pelo ciclopropano aumentou a afinidade para todas as enzimas. Contudo, uma inibição seletiva da cruzaína e LmCPB foi associada à presença do grupo (R)-benzila como substituinte da posição P1 dos derivados CF3 substituídos. Embora os compostos substituídos com leucina, tirosina, triptofano e 3-cloro fenilalanina como substituintes da posição P2 foram relativamente bem tolerados pela cruzaína e catepsina L, uma restrita especificidade foi verificada para LmCPB com pequenos ganhos de afinidade para os inibidores que possuíam os grupos leucina e metil benzoato como substituintes dessa posição. Com relação à posição P3, a inserção do grupo 3-terc-butilpirazol e 3-bromo piridina aumentou a afinidade para todos os alvos avaliados enquanto que um ganho seletivo para a LmCPB foi observado para os compostos que possuíam o grupo bifenila nessa posição. Além disso, duas novas estruturas cristalográficas da LmCPB complexada com o Neq0690 e metil metanotiossulfonato (MMTS) foram determinadas com resoluções de 1,3 Å e 1,5 Å, respectivamente. As estruturas dos co-complexos revelaram os modos de interação (MoB) desses ligantes, bem como as principais características do processo de reconhecimento bimolecular. Isso permitirá o uso de estratégias de planejamento baseado na estrutura do alvo com translação natural para a pesquisa por novos inibidores de cisteíno proteases, com amplo espectro de ação na quimioterapia de doenças a elas relacionadas. / <p align=\"justify\">The urgent need for the discovery of safer and more effective therapies for the treatment of Chagas disease and leishmaniasis has motivated the search for new inhibitors of the enzymes cruzain and CPB, the major T. cruzi and Leishmania spp. cysteine proteases, respectively. A series of 52 nitrile-containing compounds acting as covalent-reversible inhibitors of cysteine proteases was synthesized at the NEQUIMED/IQSC/USP Medicinal Chemistry Group and evaluated for their inhibitory activity against the enzymes cruzain, Leishmania mexicana CPB and cathepsin L from humans. Using hypothesis-driven molecular design, we mapped the structure-activity relationships (SARs) of these inhibitors through variations in the P1, P2, P3 and P1\' positions of the dipeptidyl nitrile scaffold. The substitution of the aminonitrile by the azanitrile group improved the affinity by two orders of magnitude for all the evaluated targets. One of the most potent inhibitors, the azanitrile analogue dubbed Neq0690 showed a slow-binding kinetics with pKi values of 8.8, 9.3 and 9.7 for cruzain, cathepsin L and LmCPB, respectively. Bioisosteric substitution of the amide moiety between the P2-P3 positions by the trifluoroethylamine group resulted in the synthesis of Neq0659, a potent inhibitor with a selective action profile for parasite proteases. Substitution of the methylene group at P1 by cyclopropane increased the affinity for all enzymes. However, selective inhibition of cruzain and LmCPB was associated with the presence of the (R)-benzyl group as substituent of the P1 position of the substituted CF3 derivatives. Although leucine, tyrosine, tryptophan and 3-chloro phenylalanine substituted compounds as substituents of the P2 position were relatively well tolerated by cruzain and cathepsin L, a restricted specificity was verified for LmCPB with small affinity gains for the inhibitors possessing the leucine and methyl benzoate as substituents of that position. Regarding the P3 position, the insertion of the 3-tert-butylpyrazole and 3-bromo pyridine groups increased the affinity for all evaluated targets whereas a selective gain for LmCPB was observed for the compounds having the biphenyl moiety at that position. In addition, it is noteworthy that two new crystallographic structures of LmCPB complexed with Neq0690 and methyl methanethiosulfonate (MMTS) were determined with resolutions of 1.3 Å and 1.5 Å, respectively. The structures of the co-complexes revealed the modes of binding (MoB) of these ligands, as well as the main characteristics of the bimolecular recognition process. This will allow the natural translational target structure strategies for the search for new inhibitors of cysteine proteases with broad spectrum of action in the chemotherapy of related diseases.

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