En cas de lymphopénie -diminution du nombre de lymphocytes T (LT) présents en périphérie-, les LT restants prolifèrent. Ce processus, dit de prolifération homéostatique, est régulé par la disponibilité de la cytokine IL-7 ainsi que par des interactions TcR/MHC et mène à la différenciation de LT effecteurs/mémoires. La prolifération homéostatique peut augmenter l’efficacité des immunothérapies anti-cancéreuses ou avoir des conséquences délétères pour l’organisme (réaction du greffon contre l’hôte, auto-immunité). Les LT naïfs, effecteurs et de mémoire produisent leur énergie via des mécanismes différents et la capacité des lymphocytes à enclencher le programme métabolique adéquat au bon moment joue un rôle essentiel dans leur différenciation. En outre, l’inhibition de la glycolyse ou de la respiration mitochondriale altère la prolifération homéostatique, suggérant que ces deux voies métaboliques sont importantes dans ce processus. Les mécanismes par lesquels les LT accroissent leur métabolisme énergétique lors de la prolifération homéostatique ne sont, à ce jour, pas encore élucidés. L’AMPK est un régulateur essentiel du métabolisme cellulaire et est la cible de différents composés déjà utilisés chez l’homme. L’objectif de notre travail a été de déterminer les conséquences de l’absence d’AMPK sur la capacité des LT à proliférer de manière homéostatique et à adapter leur métabolisme en réponse à l’IL-7. Notre hypothèse a été que l’AMPK, en permettant de réorienter le métabolisme des LT, jouerait un rôle important dans le processus de prolifération homéostatique. Au cours de ce travail, nous avons démontré que l’AMPK favorise la prolifération homéostatique des LT ainsi que l’acquisition des fonctions effectrices de type Th1. Nos résultats mettent également en évidence un rôle de l’AMPK dans le processus de graft-versus-host disease (GVHD). En effet, les LT déficients pour l’AMPK induisent une GVHD de moindre gravité. D’un point de vue métabolique, nous avons montré que les LT déficients pour l’AMPK présentent un potentiel de membrane mitochondriale réduit ainsi qu’une sensibilité accrue aux dérivés réactifs de l’oxygène (ROS). Les LT déficients pour l’AMPK ont, de plus, un défaut de switch glycolytique lors de stress mitochondriaux ainsi que lors d’une stimulation secondaire en présence d’anticorps anti-CD3/anti-CD28. Une réduction de la toxicité des ROS, associée à une plus grande flexibilité énergétique, pourrait conférer un avantage prolifératif aux LT soumis à des stimuli antigéniques de faibles affinités, tels que rencontrés lors de proliférations induites par la lymphopénie. Nos résultats suggèrent également qu’une régulation fine du métabolisme pourrait réduire la sévérité de la GVHD. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La 7β-hydroxy-épiandrostérone, stéroïde endogène dérivant de la DHEA, présente des propriétés anti-inflammatoires. En effet, elle module la voie des prostaglandines (PGs) en inhibant la production de la PGE2 pro-inflammatoires et en augmentant la production de la 15-Deoxy-∆12,14-PGJ2 cyto-protectrice in vivo et in vitro. Les faibles doses de 7β-hydroxy-épiandrostérone (1nM, 10nM, 100nM) pour lesquelles ces effets sont observés, suggèrent une liaison à un récepteur spécifique. L’inflammation et la production des PGs jouent un rôle important dans le développement et la prolifération des tumeurs mammaires estrogéno-dépendantes. Le 17β-estradiol (E2), en se fixant sur les récepteurs des estrogènes (REs), induit la production de PGE2 et la prolifération cellulaire dans ces cellules tumorales. De ce fait, notre objectif était de tester les effets de la 7β-hydroxy-épiandrostérone sur la prolifération (comptage avec exclusion au bleu trypan), le cycle cellulaire et l’apoptose (cytométrie de flux) dans les lignées cellulaires de cancer du sein MCF-7 (REα+, REβ+, GPR30+) et MDA-MB-231 (REα-, REβ+, GPR30+) et d’identifier une(des) cible(s) potentielle(s) dans ces cellules (transactivation) et dans des cellules négatives pour les REs nucléaires SKBr3 (GPR30+) (études de prolifération). Cette étude a montré que la 7β-hydroxy-épiandrostérone exerce des effets anti-estrogéniques dans les cellules MCF-7 et MDA-MB-231 associés à une inhibition de la prolifération et un arrêt du cycle cellulaire. Les études de transactivation et de prolifération avec les agonistes spécifiques des REs ont montré une interaction avec le REβ. De plus, les résultats des études de proliférations sur les trois lignées cellulaires suggèrent que la 7β-hydroxy-épiandrostérone pourrait également interagir avec le GPR30. Ces résultats indiquent que ce stéroïde androgène agit comme un anti-estrogène. De plus, c’est la première fois qu’un stéroïde androgène à faible dose montre une action anti-proliférative dans des lignées de cancers du sein. Des études ultérieures restent à réaliser afin de mieux comprendre ces effets observés. / 7β-hydroxy-epiandrosterone, an endogenous androgenic derivative of DHEA, has previously been shown to exert anti-inflammatory action in vitro and in vivo via a shift from prostaglandin E2 (PGE2) to 15-deoxy-∆12,14-PGJ2 production. This modulation in prostaglandin production was obtained with low concentrations of 7β-hydroxy-epiandrosterone (1–100 nM) and suggested that it might act through a specific receptor. Inflammation and prostaglandin synthesis is important in the development and survival of estrogen-dependent mammary cancers. Estrogen induced PGE2 production and cell proliferation via its binding to estrogen receptors (ERs) in these tumors. Our objective was to test the effects of 7β-hydroxy-epiandrosterone on the proliferation (by counting with trypan blue exclusion), cell cycle and cell apoptosis (by flow cytometry) of breast cancer cell lines MCF-7 (ERα+, ERβ +, G-protein coupled receptor 30 : GPR30+) and MDA-MB-231 (ERα-, ERβ +, GPR30+) and to identify a potential target of this steroid in these cell lineages (by transactivations) and in the nuclear ER-negative SKBr3 cells (GPR30+) (by proliferation assays). 7β-hydroxy-epiandrosterone exerted anti-estrogenic effects in MCF-7 and MDA-MB-231 cells associated with cell proliferation inhibition and cell cycle arrest. Moreover, transactivation and proliferation with ER agonists assays indicated that 7β-hydroxy-epiandrosterone interacted with ERβ. Data from proliferation assays on the MCF-7, MDA-MB-231 and SKBr3 cell lines suggested that 7β-hydroxy-epiandrosterone may also act through the membrane GPR30 receptor.These results support that this androgenic steroid acts as an anti-estrogenic compound. Moreover, this is the first evidence that low doses of androgenic steroid exert antiproliferative effects in these mammary cancer cells. Further investigations are needed to improve understanding of the observed actions of endogenous 7β-hydroxy-epiandrosterone.

Bien que les plantes et les animaux diffèrent largement par plusieurs aspects, certaines fonctions biologiques sont extrêmement conservées entre ces deux règnes. Au cours du développement d’un organisme, la mise en place d’un organe possédant une forme, une taille et une fonction précise résulte de la coordination de plusieurs processus cellulaires tel que la prolifération et l’expansion cellulaire. Translationally Controlled Tumor Protein (TCTP) est une protéine très conservée chez tous les eucaryotes. Sa mutation entraine une létalité au stade embryonnaire, démontrant son importance dans le développement de l'organisme. De plus, il a été montré que TCTP contrôlait la croissance des organes en régulant la progression du cycle cellulaire et plus particulièrement la transition G1/S chez les plantes et les animaux. Chez les animaux, les voies moléculaires par lesquelles TCTP contrôle la prolifération cellulaire commencent à être de mieux en mieux décrites. En revanche chez les plantes, ces mécanismes restent très peu connus. Afin de comprendre plus précisément comment TCTP contrôle la prolifération cellulaire et le développement chez Arabidopsis thaliana, les intercateurs potentiels de TCTP ont été identifiés. Parmi eux, CSN4, une sous-unité du complexe COP9 Signalosme (CSN) a été trouvée. CSN est connue pour être impliquée dans le contrôle de l’état de neddylation des CULLINES (CUL) et donc influencent l’activité des complexes CULLIN-RING ubiquitine ligases (CRLs). Les CRLs, par leur activité d’ubiquitination, sont connus pour contrôler l’accumulation de certains acteurs clés du cycle cellulaire, tel que les Cyclines ou les Kip Related Proteins. Au cours de ma thèse, j’ai donc étudié l’interaction entre TCTP et CSN4, afin d’évaluer si le complexe CSN pouvait être l’intermédiaire moléculaire entre TCTP et le cycle cellulaire. Via des approches génétique, biochimiques et cellulaires j’ai pu montrer que TCTP interagissait physiquement avec CSN4 dans le cytoplasme. De plus, par la caractérisation phénotypique de plantes et de cultures cellulaires sur- ou sous-exprimant ces deux gènes, j’ai pu mettre en évidence que TCTP et CSN4 interagissaient génétiquement et que ces deux protéines contrôlaient la transition G1/S du cycle cellulaire. Dans le but de comprendre si l’interaction entre ces deux protéines pouvait interférer avec la fonction du complexe CSN, j’ai analysé par une approche biochimique l’état de neddylation de CUL1 dans les lignées transgéniques. Les données démontrent que la perte de fonction de TCTP accroit la fraction déneddylée de CUL1, alors que sa surexpression augmente la fraction de CUL1 neddylée. Ces données suggèrent que l’interaction est fonctionnelle et que TCTP interfère négativement avec la fonction de CSN. Ainsi, j’ai établi un modèle putatif pour expliquer comment TCTP régule la progression du cycle cellulaire via une interférence avec l’activité de deneddylation du CSN, et donc contrôle l’activité des complexes CRLs. Dans la dernière partie de ma thèse, afin de comprendre si le rôle de TCTP est conservé chez les animaux, j'ai par une approche biochimique évaluée la neddylation de CUL1 chez Drosophila melanogaster. Mes données montrent que comme chez Arabidopsis, la fraction déneddylée de CUL1 augmentait dans des larves de drosophile sous-accumulant TCTP, suggérant que ce mécanisme puisse être conservé entre l’Arabette et la drosophile / While plants and animals largely diverge in several major aspects, some biological functions are highly conserved between these kingdoms. During organism development, the correct implementation of organs with unique shape, size and function is the result of coordinated cellular processes as cell proliferation and expansion. Translationally Controlled Tumor Protein (TCTP) is a highly conserved protein among all eukaryotes. TCTP mutation leads to embryo lethality, indicating that it is mandatory for organism development. Moreover, it has been shown that TCTP controls organ growth by regulating the G1/S transition and cell cycle progression both in plants and animals. In animals, the molecular pathways by which TCTP controls cell proliferation are well known. However, in plants, the mechanism implicating TCTP in the control of development and cell cycle is less understood. To better understand how TCTP controls cell proliferation and development in Arabidopsis thaliana, the putative TCTP interactors were identified. Among them, CSN4, a subunit of the COP9 signalosome complex (CSN) known to be involved in the control of CULLINS (CUL) neddylation status and CULLIN-RING ubiquitin ligases (CRLs) activity, was identified. Through their ubiquitination activity, CRL complexes are known to control the accumulation of mains cell cycle regulators as Cyclins or Kip Related Proteins. Thus, during my PhD, I studied the interaction between TCTP and CSN4, in order to evaluate if CSN complex could link TCTP to cell cycle control. I used genetic, cellular and biochemical approaches to demonstrate that TCTP and CSN4 interact in the cytoplasm. Phenotypic characterization of plants and cell cultures down- or overexpressing these genes demonstrated that TCTP and CSN4 interact genetically to control G1/S transition. In order to understand if the interaction between these two proteins could interfere with the CSN complex function, I characterized CUL1 neddylation status in transgenic lines misexpressing TCTP and CSN4. Loss of function of TCTP increases the non-neddylated CUL1 fraction, while overexpression of TCTP increases neddylated CUL1 form. These data show that TCTP interferes with the role of CSN complex in regulating CUL1 neddylation. Accordingly, our data suggest that TCTP controls cell cycle progression via controlling CSN deneddylation activity, and thus influencing CRL activity. In the last part of my PhD, I addressed if this role of TCTP is conserved in animals. I used biochemical approach to evaluate CUL1 neddylation in Drosophila melanogaster downregulated for dTCTP. My data show that Drosophila larvae knockdown for dTCTP also leads to an increase of non-neddylated CUL1 fraction. These data suggest that the mechanism by which TCTP/CSN4 regulate cell cycle, is likely conserved between Arabidopsis and Drosophila

L'utilisation des ressources en fer et les variations du potentiel redox sont des processus impliqués dans la prolifération et la différenciation cellulaire. Ils participent à l'hématopoïèse normale et leur dérégulation peut être associée à des conditions pathologiques. Les hémopathies, telles que la leucémie aiguë myéloïde (LAM), témoignent du lien entre disponibilité en fer, signalisation redox et leucémogenèse. La déplétion en fer induit un arrêt de la prolifération suivi de la mort cellulaire, et pour des cellules primaires leucémiques (blastes) de patients LAM, elle peut conduire à un réengagement de la différenciation vers la lignée monocytaire. Cependant, les besoins en fer des clones leucémiques restent mal définis. Dans les cellules animales, le cœur du réseau de régulation du fer est organisé à travers le système régulateur IRE-IRP. Les Iron Regulatory Proteins (IRP), agissent sur la traduction de nombreuses protéines impliquées dans la gestion du fer par interaction avec les Iron Responsive Elements (IRE) localisés sur les régions non codantes des ARN messager (ARNm) régulés. A partir de lignées cellulaires leucémiques (KG1, K562), de blastes de patients LAM et de progéniteurs CD34+ contrôles issus de sang de cordon et de moelle osseuse de donneurs sains, le statut du système de gestion cellulaire du fer a été caractérisé pour les premières étapes de l'hématopoïèse normale et pathologique. A travers la manipulation des apports cellulaires en fer, notamment par l'utilisation de chélateurs à usage thérapeutique, la réponse du système homéostatique a été suivie. Nos données soulignent les faibles besoins en fer des progéniteurs hématopoïétiques, et d'autres cellules, pour proliférer. Dans les lignées cellulaires le régulateur IRP est en excès par rapport à ses cibles IRE, ce qui pourrait être une caractéristique générale du contrôle de la traduction pour des ARNm spécifiques par fixation de régulateurs translationnels. La régulation semble exclusivement le fait d' IRP1, puisqu' IRP2 n'a pas été détecté dans les progéniteurs hématopoïétiques, qu'ils soit pathologiques ou non. De subtiles différences ont été identifiées dans les quantités des composants du réseau gérant le fer dans les cellules leucémiques en comparaison des cellules saines témoins, ainsi que des capacités différentes à croître dans un milieu minimal comportant des concentrations en fer précisément définies. Les informations obtenues à travers ce travail pourraient bénéficier à l'élaboration de protocoles thérapeutiques, incluant notamment la manipulation du fer, dans les LAM ou d'autres pathologies. / Use of iron resources and variations of the redox balance are processes involved in cell proliferation and differentiation. They participate to normal hematopoiesis and their disturbance may be associated with pathological conditions. Hematological neoplasms, such as acute myeloid leukemia (AML), provide clinical evidence of the link between iron availability, redox signaling, and malignancy. Stringent iron depletion induces arrest of proliferation followed by cell death, and deprived primary leukemic cells of AML patients (blasts) have been previously shown to engage into the monocytic lineage. Yet, the iron needs of leukemic clones are unknown. The core network of cellular iron regulation in mammals is organized around the IRE-IRP system. The Iron Regulatory Proteins (IRP) act on the translation of many proteins involved in iron management by interacting with Iron Responsive Elements (IRE) located on the untranslated regions of messenger RNA (mRNA) coding these proteins. Using leukemic cell lines (KG1, K562), blasts of AML patients and CD34+ progenitors isolated from cord blood or the bone marrow of healthy donors, the status of the iron management system was established in the first stages of normal and pathological hematopoiesis. The response of the homeostatic system upon manipulation of iron provision, including with clinically implemented chelators, has been monitored. Our data emphasize the weak iron requirements of hematopoietic progenitors, and other cells, to proliferate. In cell lines the IRP regulator is in excess of its IRE targets, which may be a general feature of translational control for specific mRNA. The regulation seems exclusively mediated by IRP1, as the IRP2 regulator has not been detected in normal or malignant hematopoietic progenitors. Subtle differences have been found in the iron handling system of leukemic cells as compared to normal cells, together with different abilities to grow on a minimal medium containing precisely defined iron concentrations. The design of improved therapeutic regimens including iron manipulation, in AML and other pathologies, may benefit from considering the information obtained in this work.

L'ingénierie tissulaire consiste à assembler de façon intelligente des cellules et des matériaux biocompatibles dans le but de créer des tissus artificiels. Pour la construction de tissus en laboratoire, il est indispensable d'élaborer des matériaux qui miment cet environnement. Dans ce cadre, la collaboration entre les scientifiques de différents domaines (matériaux, chimie, biologie, biochimie) s'avère nécessaire. L'ingénierie du muscle squelettique est prometteuse pour remplacer le tissu musculaire endommagé et pour le traitement des maladies du muscle, mais aussi pour les essais pharmaceutiques. Dans ce but, les matériaux avec les propriétés mécaniques et chimiques contrôlées sont requis -- pour l'amplification et la différenciation in vitro de cellules souches musculaires, mais aussi pour l'étude de la myogenèse sur des microenvironnements contrôlés 2D et dans les matrices 3D. Dans ce travail, nous avons utilisé la technique d'assemblage couche par couche (LbL, layer-by-layer) pour deux buts. Le premier a été de développer de nouveaux films biomimétiques possédant des propriétés biochimiques et mécaniques parfaitement contrôlées, pour étudier les interrelations entre ces deux paramètres sur les processus cellulaires. En plus, nous avons associé ces films biomimetiques aux substrats avec la topographie contrôlée, afin de guider la formation du tissu. Dans un second temps, nous avons utilisé la technique LbL pour organiser les cellules en structures 3D. Nous avons ainsi crée des microtissus d'épaisseur contrôlée, qui pourraient être utilisés en tant que modèles de tissus artificiels pour les applications thérapeutiques ou pour les évaluations de médicament en industrie pharmaceutique. / Tissue engineering approach consists in combining cells, engineering and biomaterials to improve the biological functions of damaged tissues or to replace them. Production of “artificial tissues” is still challenging and requires collaboration of scientists from different domains like cell biology, chemistry, materials and polymer science. Skeletal muscle tissue engineering holds promise for the replacement of muscle due to an injury and for the treatment of muscle diseases, such as muscle dystrophies or paralysis, but is also required for pharmaceutical assays. To this end, materials with tunable mechanical and biochemical properties for myoblast expansion and differentiation in vitro, as well as for the studies of myogenesis on controlled 2D microenvironments or in 3D scaffolds, are crucially needed. In this work, we use layer-by-layer (LbL) assemblies for two goals. The first consisted in the development of multifunctional biomimetic thin films for the control of skeletal muscle cell fate on 2D substrates. We use LbL films made of polypeptides, which can be stiffened by chemical cross-linking and can be specifically functionalized by grafting of biomimetic peptides onto their surface. In addition, we combined the peptide-grafted films with substrate microtopography. Such approach is promising for the development or multifunctional materials that combine the different stimuli present in in vivo ECM, among them physical and biochemical cues, but also microtopography. In the second part, we use LbL assemblies for the construction of 3D skeletal muscle microtissues. This allows to rapidly build 3D muscle tissues and is promising for the in vitro construction of physiologically relevant skeletal muscle tissue models.

La Néoplasie Endocrinienne Multiple de type1 (NEM1) est une maladie à transmission autosomique dominante liée à l'inactivation du gène MEN1 codant pour la protéine ménine. Bien que ménine soit exprimée dans tous les tissus testés de l'organisme, elle n'a un effet oncosuppresseur que dans les cellules endocrines. L'hypothèse de mon travail est que ménine interagit avec des fonctions endocrines spécifiques. J'ai ciblé mes études sur une lignée de cellules β pancréatiques INS-1 dans laquelle j'ai étudié la réponse cellulaire au glucose et la régulation du facteur de transcription MAFA en fonction de la variation de l'expression de ménine. Nos résultats ont démontré que l'inhibition de ménine augmente l'incorporation de BrdU en réponse au glucose dans les cellules INS-1, ainsi que l'expression de plusieurs gènes impliqués dans la prolifération de ces cellules. Cette inhibition de ménine est associée avec une réduction dramatique de l'expression de MafA, et celle de certains gènes cibles de MafA. Par ailleurs, la surexpression de la forme sauvage, et non pas des formes mutées de ménine, stimule l'expression de MafA. La variation de l'expression de MafA étant également associée à une variation du taux de prolifération cellulaire. D'autre part, les études in vivo ont montré une bonne corrélation entre le niveau d'expression de ménine et celui de MafA dans les insulinomes du rat et de l'homme. En conclusion, mon travail de thèse a permis de mieux clarifier la fonction biologique de ménine dans les cellules β, et de mettre en évidence l'implication potentielle du facteur MafA dans la tumorigénèse des insulinomes / Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) is an autosomal dominant inherited syndrome caused by mutations of the MEN1 gene coding for the protein menin. Although menin is expressed in all tested tissues, its oncosuppressor effect is limited to the endocrine cells. The assumption of my work was that menin interact with specific endocrine functions. To check out this assumption, we selected the β pancreatic cell line INS-1 in which, we analysed the cellular response to glucose stimulation and the regulation of the transcription factor MAFA according to the variation of menin expression. Our results showed that menin inhibition increased BudU incorporation in response to glucose stimulation in INS-1 cells, as well as the expression of several genes involved in the proliferation of these cells. Menin inhibition was associated with a dramatic reduction of MafA expression level, and some of its targeted genes. Interestingly, wild type menin overexpression, but not mutant forms, stimulated MafA expression. Interestingly, modification of MafA expression modified proliferation rate of INS-1 cells. In addition, the in vivo studies, showed a good correlation between menin and MafA expression levels in both rat and human insulinoma. In conclusion, my thesis work results clarified the biological function of menin in β cells, and highlighted the potential implication of MafA factor in insulinoma tumorigenesis

L’endométriose concerne 8 à 10% des femmes en âge de procréer et est responsable de douleurs pelviennes chroniques et d’infertilité. Seule l’exérèse chirurgicale des lésions permet un traitement curatif de la maladie. Dans le cas de l’endométriose profonde avec atteinte rectale la chirurgie est extensive et associée à une morbidité significative. Les traitements médicaux reposent sur une hormonothérapie visant à bloquer la fonction ovarienne dont l’effet n’est que suspensif et transitoire. Il n’existe à ce jour aucun traitement ciblant les mécanismes à l’origine de la maladie. L’objectif de notre travail était d’explorer différents mécanismes potentiellement impliqués dans le développement de la maladie et d’identifier des molécules capables d’intervenir sur ces mécanismes. Dans un premier temps nous avons exploré le phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes et cherché un lien avec différentes voies métaboliques impliquées dans la prolifération cellulaire telles que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt. Dans un deuxième temps, nous avons exploré le recrutement des cellules endométriales au sein de la cavité péritonéale au travers de l’interaction CXCR4-CXCL12. Des cultures cellulaires ont été réalisées à partir de prélèvements humains de nodules endométriosiques profonds, d’endomètre eutopique et d’endomètre sain. Des lames histologiques ont été préparées à partir de nodules endométriosiques profonds. Des prélèvements de liquide péritonéal de femmes endométriosiques et de témoins ont été congelés. La prolifération cellulaire a été étudiée par incorporation de thymidine tritiée. La production des FRO a été évaluée par spectrofluorimétrie. La voie ERK a été évaluée par western blot, ELISA et immunohistochimie. La voie Akt été évaluée par western blot et immunohistochimie. Nous avons montré un phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes en rapport avec une activation de la voie ERK par le biais du stress oxydant et à une activation de la voie Akt. Nous avons montré qu’un anti-oxydant (NAC), un inhibiteur de protéines kinases (A771726), un inhibiteur de Raf (sorafenib), un inhibiteur de mTOR (temsirolimus), un agoniste des cannabinoïdes (WIN 55212-2) et un anti-métabolite (5-FU) pouvaient contôler la prolifération des cellules endométriosiques profondes in vitro et la progression de nodules endométriosiques profonds implantés dans des souris Nudes. L’interaction CXCR4-CXCL12 a été étudiée par western blot, analyse de migration, cytométrie de flux et ELISA. Nous avons montré une attraction spécifique des cellules endométriosiques profondes sur-exprimant le CXCR4 par la chimiokine CXCL12 présente en quantité accrue dans le liquide péritonéal des femmes endométriosiques. En conclusion, nous avons montré que le traitement médical de l’endométriose pouvait être non hormonal et que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt constituaient de nouvelles pistes thérapeutiques à évaluer dans le cadre d’essais cliniques. Nous avons également montré comment la modification constitutive des cellules de l’endomètre eutopique pouvait favoriser leur recrutement dans la cavité péritonéale. / Endometriosis, a common disease that affects approximately 8 to 10% of women of childbearing age, is responsible for chronic pelvic pain and infertility. There is currently no cure other than surgical removal of lesions. In the case of deep infiltrating endometriosis with rectal involvement, surgery is associated with a significant morbidity. Medical treatments are based on a hormone used to block ovarian function. Their effects are only transient and suspensive. There is currently no treatment targeting the mechanisms underlying the disease. The aim of our study was to explore different pathways potentially involved in the development of endometriosis and to identify molecules that act on these mechanisms. In a first step, we explored the hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells and sought a link with different metabolic pathways involved in cell proliferation such as oxidative stress, ERK, and Akt pathways. In a second step, we explored the recruitment of endometrial cells in the peritoneal cavity through the CXCL12-CXCR4 interaction. Cell cultures were taken from deep infiltrating endometriosis nodules, eutopic endometrium and control endometrium. Histological slides were prepared from deep endometriotic nodules. Peritoneal fluid of women with deep infiltrating endometriosis, and of women without endometriosis were frozen. Cell proliferation was determined by [H3]thymidine incorporation. Cellular production of ROS was assessed by spectrofluorometry. ERK pathway was assessed by Western blot, ELISA assay and immunohistochemistry. The Akt pathway was assessed by Western blot and immunohistochemistry. We showed a hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells in line with an activation of the ERK pathway through an up-regulation of oxidative stress, and activation of the Akt pathway. We have shown that an antioxidant (NAC), an inhibitor of protein kinases (A771726), a Raf inhibitor (sorafenib), an inhibitor of mTOR (temsirolimus), a cannabinoid agonist (WIN 55212-2) and an anti-metabolite (5-FU) could control the proliferation of endometriotic cells in vitro, and the growth of endometriotic nodules grafted in Nude mice. The CXCL12-CXCR4 interaction was studied by Western blot, Transwell migration assay, flow cytometry and ELISA assay. We showed a specific attraction of deep infiltrating endometriosis cells over-expressing the CXCR4 chemokine by CXCL12 present in increased amounts in the peritoneal fluid of endometriotic women. In conclusion, we have shown that medical treatment of endometriosis could be non-hormonal and that oxidative stress, ERK and Akt were new therapeutic approaches to assess in clinical trials. We also showed how the molecular changes of eutopic endometrial cells could facilitate their recruitment into the peritoneal cavity.

La progression à travers le cycle cellulaire est assurée par l’activation séquentielle d’une série de complexes cycline-CDK. Les complexes cycline D-CDK4 assurent la progression au cours de la phase G1 du cycle cellulaire en phosphorylant les protéines « antioncogéniques » de la famille Rb. L’activation de la CDK4 nécessite son association à une cycline D et sa phosphorylation sur Thr172 par la CAK nucléaire (CDK activating kinase). Le rôle essentiel des protéines de la famille Cip/Kip dans la régulation de l’activité de ces complexes reste controversé. Les protéines de cette famille (comprenant p27 et p21) ont initialement été identifiées comme des inhibiteurs puissants des complexes cycline-CDK et comme les intermédiaires de l’action antimitogénique de différents signaux intra ou extra-cellulaires. Il a été proposé que la liaison de la p27 ou de la p21 aux complexes cycline D-CDK4 empêche leur phosphorylation activatrice par la CAK et leur activité pRb kinase. Cependant, l’observation que des complexes cycline D-CDK4 associés à p21/p27 possèdent une activité pRb kinase a donné naissance à une seconde hypothèse sur la régulation de ces complexes par la p27 ou la p21. Ces « inhibiteurs » ont été paradoxalement proposés comme facteurs nécessaires et suffisants d’assemblage et de localisation nucléaire des complexes cycline D-CDK4. Dans le modèle physiologiquement relevant des thyrocytes de chien en culture primaire, la mitogénèse dépendante de l’AMPc activée par la TSH diffère des cascades des facteurs de croissance puisqu’elle n’induit pas les cyclines D mais au contraire augmente l’accumulation de l’«inhibiteur» de CDK p27. L’AMPc stimule l’assemblage des complexes cycline D3-CDK4, leur translocation nucléaire et leur association à p27. Dans ce modèle, le TGF&61538; inhibe la mitogénèse dépendante de l’AMPc en inhibant la translocation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4 et leur association à la p27.<p><p>Nous avons étudié l’activité catalytique et l’activation des complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien en culture primaire ou produits en cellules d’eucaryotes supérieurs (CHO et Sf9). Nous avons pu montrer que les complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien stimulés par la TSH présentent une activité pRb-kinase qui est inhibée par le TGF&61538; En outre, la production des complexes cycline D3-CDK4-p27 en cellules CHO ou Sf9 nous a permis de montrer que l’impact de la p27 sur l’activité catalytique des complexes cycline D3-CDK4 dépend de sa stoechiométrie de liaison à ces complexes. L’analyse du profil de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de la CDK4 issue de ces trois systèmes montre que la p27 n’empêche pas la phosphorylation activatrice de la CDK4, même aux concentrations de p27 qui empêchent l’activité pRb kinase du complexe cycline D3-CDK4. Nous avons également montré dans les cellules CHO que la p27 détermine la localisation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4, ceux-ci étant relocalisés dans le cytoplasme par la transfection d’un mutant de la p27 dépourvu de son signal de localisation nucléaire. Ces résultats valident les observations réalisées par immunofluorescence dans les thyrocytes de chien dans lesquels nous avons mis en évidence une étroite corrélation au niveau des cellules individuelles stimulées par la TSH entre la translocation nucléaire de la CDK4 et l’apparition de la p27 nucléaire. Cette colocalisation est partiellement inhibée par le TGF&61538; Ces observations renforcent l’hypothèse d’un rôle de la p27 dans l’ancrage nucléaire des complexes cycline D3-CDK4. <p><p>Alors que la localisation de la CAK est considérée comme exclusivement nucléaire et son activité catalytique constitutive, nous avons pu montrer que la phosphorylation activatrice de la CDK4 associée à la cycline D3 n’est pas affectée par sa localisation sub-cellulaire et qu’elle est régulée par le TGF&61538; dans les thyrocytes de chien et par le sérum dans les cellules T98G indépendamment de l’association de la CDK4 à la p27. De plus, la phosphorylation de la CDK4 sur Thr172 dans les cellules T98G est stimulée par le sérum, alors que la phosphorylation activatrice de la CDK6, son homologue fonctionnel, ne l’est pas. La comparaison de la séquence de ces deux CDKs à proximité des Thr phosphorylées (Thr177 pour la CDK6) révèle, outre une forte similarité de séquence, une différence au niveau de l’acide aminé situé en aval de la thréonine :il s’agit d’une proline dans la CDK4 et d’une sérine dans la CDK6. La mutation P173S de la CDK4 abolit la phosphorylation sur Thr172 et l’activité de la CDK4 associée à la cycline D3 dans les cellules CHO, mais n’affecte pas la phosphorylation et l’activation de la CDK4 par la CAK recombinante in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que la/les CAKs régulée(s) responsables de l’activation de la CDK4 n’ont pas encore été identifiées et que la proline située en aval de la Thr172 de la CDK4 est essentielle pour sa phosphorylation activatrice et son activité pRb kinase.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique, Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP. <p><p>Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire.<p><p>Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale).<p><p>Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes.<p><p>Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc.<p><p>Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2. <p><p>En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte. <p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’acide rétinoïque (AR), dérivé actif de la vitamine A (rétinol) circulante, est une petite molécule lipophile contrôlant divers aspects de la mise en place du système nerveux central des vertébrés. L'AR influence notamment le développement précoce du cerveau antérieur, où il contrôle la prolifération et la survie des cellules progénitrices dans l'épithélium neural prosencéphalique. Le développement neural est un processus qui s'articule en trois grandes étapes : la phase d'expansion latérale (E9,5-E10,5 chez la souris), la phase de neurogenèse (E11,5-stades périnataux) et la phase de gliogenèse (stades périnataux-adulte). Nous avons montré que l'AR produit par les méninges à partir de E13 influence la spécification et la migration neuronale au cours de la phase de neurogenèse. De plus, nos travaux suggèrent un rôle plus précoce de l'AR pour la formation et la prolifération des populations progénitrices et neuronales avant et au début de la phase de neurogenèse. Une combinaison de signaux intrinsèques et extrinsèques contrôle divers aspects du développement neural cortical. Nos travaux placent l'AR parmi ces facteurs modulateurs de la neurogenèse corticale. / Retinoic acid (RA), an active vitamin A (retinol) metabolite, is a small lipophilic molecule controlling numerous events during central nervous system development in vertebrates. RA is involved in early forebrain development by controlling cell proliferation and survival in the prosencephalic neuroepithelium. Neural development is a process progressing through three key steps: a phase of lateral expansion (E9.5-E10.5 in the mouse), a phase of neurogenesis (E11.5-perinatal stages) and a gliogenic phase (perinatal stages-adult). My work has shown that RA produced by the developing meninges from E13 influences neuronal specification and migration during the phase of neurogenesis. Moreover, our data suggest an earlier role of RA during the production and proliferation of progenitor and neuronal populations, before and at the onset of the neurogenic phase. A combination of extrinsic and intrinsic signals is required to orchestrate the various aspects of cortical development. RA is likely to be one of such extrinsic factors modulating cortical neurogenesis.