In order to obtain quinolone nucleosides a new methodology based on construction of the heterocyclic ring at the carbohydrate moiety was devised. The carbohydrates: 1-methoxy-2,3-O-isopropylidene-α-D-ribofuranose (108), 1-methoxy-2,3-O-isopropylidene-5-O-methanesulfonyl-β-D-ribofuranose (109a) and 1-methoxy-2,3-O-isopropylidene-5-O-p-toluenesulfonyl-β-D-ribofuranose (109b) were prepared. The last two, the mesyl and tosyl derivatives, were submitted to nucleopilic substitution reaction with aniline or its corresponding anion, leading to 1-methoxy-2,3-O-isopropylidene-5-anilino-β-D-ribofuranose (110) in very low yield. Attempts to improve this yield by changing reaction conditions such as the polarity of the solvent or nitrogen eletronic density were unsuccessful. It seems that the elimination process is the most favorable under these conditions in the ribofuranoside ring.Also, the aldehyde 126 was prepared in order to produce 110 throught reductive amination reaction. Although, this synthesis has failed. Reaction of the amine 110 with diethyl ethoxymethylene malonate didn`t lead to ethyl N-phenyl-2,3-O-isopropilydene-ribofuranoside-α-carbethoxy-β-(anilino)acrylate (111), probably due to steric effects around the nitrogen. In the search for obtaining new quinolonic 2’,3’-didehydro-ribonucleosides (type II), several intermediates were prepared by using a methodology optimized in our group, which involves coupling previous sylilated 3-carbetoxy-4(1H)quinolones (X= F, 116a and X = Me, 116b) by reaction with N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamide (BSTFA), with 1-O-acetyl-2’,3’,5’,-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranose (23),under trimethylsilyltrifluormethanesulfonate (TMSO-Tf) catalysis. 3-Carbethoxy-1-(2’,3’,5’,-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)-4(1H)quinolone 117a-b were obtained in 83 and 85% yields, respectively. The acrylates 115a-b used to prepare the corresponding quinolones 116a-b were synthesized in 85 and 75% yields by a procedure described in the literature. The benzoyl protecting groups of the ribonucleosides 117a-b were removed by using methanolic sodium carbonate solution leading to the unprotected 3-carbomethoxy-1-β-D-ribofuranosyl-4(1H)quinolones 118a-b in 75% and 69% yields. These ribonucleosides were submitted to bromination and acetylation. Ribonucleoside 118b formed a 3:1 mixture of 2`-O-acety-3`-bromo and 3`-O-acety-2`-bromo regioisomeric derivatives. However, the same reaction with 118a produced the 2’,3’,5’-tri-O-acetylated derivative. Attempts to perform β-elimination reaction of the bromo-acetate ribonucleoside 118b to obtain the desired didehydro-nucleosides, using as reagent nickel deposited on charcoal surface were unsuccessful.Continuing our search for new heterocyclic nucleosides was investigated the preparation of triazolic derivatives (type III). The synthetic route devised started by preparing the aminocarbohydrates 129, 147, 150, 156 and 156, by a standard procedure described in the literature. These amino derivatives were reacted with diazomalonaldehyde (132) and diazoacetylacetone (133) affording 4-formyl-1,2,3-triazole-1-yl (130a e 148a) and 4-acetyl-5-methyl-1,2,3-triazole-1-yl (130b, 148b and 152a). The triazolic nucleoside 130a was tested against Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) showing a good inhibition of the virus (86%) at the concentration 50 M. Biological evaluation of this substance against HIV-1 virus is under study. All the nucleosides synthesized are also being tested against HSV-1 and HIV-1 virus. As an extension of our study on carbohydrate derivatives we undertook a search for new chiral Lewis acids based on stannylated carbohydrates. With this purpose we planned the preparation of the chiral Lewis acids 157a, 158a e 163a. Three reactions between tosylated carbohydrates 109b, 121 and 145 and Ph3SnLi were attempted. However, only carbohydrate 109b led to 1-methoxy-2,3-O-isopropylidene-5C-triphenylstannyl-α-D-ribofuranose (157a). In contrast, the reaction of Ph3SnLi with 121 produced 4,5-anhydro-1,2-O-isopropylidene-α-D-xylofuranose, rather than the stannylated substitution product. The carbohydrate 145 failed to produced any desired product. Thus it appears, superficially at least, that Ph3SnLi is acting as a nucleophille with 109b and as a base towards 121, eliminating p-MeC6H4SO3H. The lack of reactivity of 145 results from the steric hindrance by 3-sulfonate group difficulting the approach of the bulky tin-lithium reagent in an SN2-type reaction. Reactions of 157a with iodine, at both 1:1 and 1:2 mole ratios of 157a:I2, proceeded at ambient temperature to give the iodophenylstannylated products, 157b and 157c, in good yields. The chiral Lewis acids 157a-c were used in Diels-Alder reactions between methyl acrylate (122) and cyclopentadiene (123). The aduct 124 which was formed in the presence of 157c had its optical rotations measured. Chiral Lewis acid 157c was able to induce chirality leading to S configuration adduct as the major enantiomer (91% of enantiomeric excess). During the study on Diels-Alder reaction we had the opportunity to get a chiral catalyst, the fluoro-bis-oxazolidine 164 synthesized by Prof. Denis Sinou of Université Claude Bernard-Lyon I. We prepared in situ a copper complex of this compound and it was used in the Diels-Alder reaction between methyl acrylate (122) and cyclopentadiene (123). The result indicated that this catalyst was able to induce chirality in the cycloaduct favoring the S enantiomer (87% of enantiomeric excess).

A identificação de genes relacionados com resistência a compostos antiparasitários tem contribuído para um melhor entendimento do mecanismo de ação de alguns desses compostos. Utilizando a estratégia que permite a indução de super-expressão após transfecção gênica, isolamos dois loci relacionados com resistência ao análogo tóxico de purina, tubercidina (TUB). Em um desses locus identificamos um ortólogo do gene TOR (TOxic nucleoside Resistance) em L. (L.) major (TOR-Lm), capaz de conferir altos níveis de resistência a TUB. A identificação e localização cromossomal do segundo locus foi obtida, mas os testes funcionais em presença de TUB não foram tão significativos quanto os obtidos após a transfecção do TOR-Lm. Na segunda parte desta dissertação avaliamos a eficácia da associação de TUB com um inibidor específico do transporte de nucleosídeos em mamíferos, nitrobenziltioinosina (NBMPR), visando reverter a toxicidade de TUB apenas no hospedeiro. Demonstramos que TUB tem uma potente ação anti-parasitária em culturas de Leishmania spp., e que o inibidor NBMPR é capaz de proteger células mamíferas de camundongos infectados da ação tóxica de TUB. / Gene identification associated with drug resistance has contributed to a better understanding of the mechanism of action of anti parasitic compounds. Using transfection and over-expression selection strategy we isolated two loci related with the resistance of tubercidin (TUB), a toxic analog purine. In the first locus we identified an ortholog of the TOR gene (TOxic nucleoside Resistance) in L. (L.) major (TOR-Lm), capable to render wild cells resistance to TUB after transfection and over-expression. Chromosomal location and identification of the second locus was done, but functional tests in the presence of TUB were not as significant as those obtained after TOR-Lm transfection. In the second part of this work, we evaluate the effectiveness of the association of TUB with an inhibitor specific to the mammals nucleoside transport, as nitrobenzylthioinosine (NBMPR), aimed at reversing the TUB toxicity only on the host. We first demonstrate that TUB has a potent anti-parasitic action in cultures of Leishmania spp. Then, we discuss the capacity of the NBMPR inhibitor to protect infected macrophages from the toxic effects of TUB.

A tuberculose humana (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis, continua sendo uma ameaça à saúde pública no mundo, tendo resistido às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. A emergência de cepas resistentes a drogas levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novos compostos anti-TB. Estes agentes quimioterápicos podem ser desenhados baseados em vias metabólicas que sejam essenciais ao patógeno. Há uma necessidade contínua de estudos do metabolismo micobacteriano, como tentativa de identificar enzimas de relevância biológica, uma vez que estas podem representar alvos promissores para o desenvolvimento de novos agentes anti-TB. A fosforilase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtPNP), uma enzima chave da rota de salvamento de purinas, foi recentemente proposta como sendo essencial para a sobrevivência micobacteriana. Foi sugerido que esta enzima possa desempenhar um papel no processo de latência. Entretanto, não houve nenhum relato sobre o mecanismo enzimático e especificidade de substrato de MtPNP. No presente trabalho, demonstramos que MtPNP é mais específica por 2'-desoxiguanosina (2dGuo) e não catalisa a fosforólise de adenosina. Dados de velocidade inicial, inibição por produto e ligação em equilíbrio sugerem que MtPNP catalisa a fosforólise de 2dGuo por um mecanismo cinético ordenado em estado estacionário do tipo bi bi, onde o fosfato inorgânico liga-se primeiro, seguido pela ligação de 2dGuo para formar o complexo ternário cataliticamente competente, e ribose 1-fosfato é o primeiro produto a se dissociar, seguido pela guanina. Dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação de produto é o passo limitante da velocidade para a reação catalisada por MtPNP. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para o desenho de inibidores de MtPNP com potencial ação contra M. tuberculosis. / Human tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains a public health threat worldwide, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. The emergence of drug-resistant strains has led to an urgent need for the development of new anti-TB compounds. These chemotherapic agents can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism, as an attempt to identify enzymes of biological significance, as these might represent promising targets for the development of new anti-TB agents. M. tuberculosis purine nucleoside phosphorylase (MtPNP), a key enzyme of the purine salvage pathway, has been recently proposed to be essential for mycobacterial survival. It has been suggested that this enzyme may play a role in the latency process. However, there has been no report on MtPNP enzyme mechanism and substrate specificity. In the present work, we demonstrate that MtPNP is more specific to 2'-deoxyguanosine (2dGuo) and does not catalyze the phosphorolysis of adenosine. Initial velocity, product inhibition and equilibrium binding data suggest that MtPNP catalyzes 2dGuo phosphorolysis by a steady-state ordered bi bi kinetic mechanism, in which inorganic phosphate binds first followed by 2dGuo binding to form the catalytically competent ternary complex, and ribose 1-phosphate is the first product to dissociate followed by guanine. Pre-steady-state kinetic data indicate that product release is the ratelimiting step for MtPNP-catalyzed reaction. The results described here should be useful to the design of MtPNP inhibitors with potential action against M. tuberculosis.

VASCONCELOS, D. L. M. Espectroscopia Raman no cristal do nucleosídeo adenosina submetido a altas pressões. 2017. 62 f. Dissertação (Mestrado em Física) – Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017 / Submitted by Giordana Silva (giordana.nascimento@gmail.com) on 2017-04-17T18:28:35Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_dlmvasconcelos.pdf: 2006987 bytes, checksum: da5f9b7150205500331adf6b00735075 (MD5) / Approved for entry into archive by Giordana Silva (giordana.nascimento@gmail.com) on 2017-04-17T18:30:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_dlmvasconcelos.pdf: 2006987 bytes, checksum: da5f9b7150205500331adf6b00735075 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T18:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_dlmvasconcelos.pdf: 2006987 bytes, checksum: da5f9b7150205500331adf6b00735075 (MD5) Previous issue date: 2017 / Nucleosides are organic compounds formed by a nitrogenous base and a sugar. In the present work a detailed study was carried out regarding the vibrational modes of the crystal of the nucleoside adenosine (C10H13N5O4) submitted to high pressures. Initially the reagent which was in powder form was crystallized by the slow evaporation method of the solvent. In the obtained crystal Raman spectroscopy measurements were performed. The spectral region investigated covered the interval between 20 cm-1 and 1700 cm-1 , having been observed 49 vibrational modes. The classification of these modes was done with reference to work done with the same material, as well as investigations in other nucleosides such as thymidine and cytosine. In order to subject the material to high pressures a pressure cell with diamond anvil was used and the nujol was used as the compressor medium. The study was performed with a pressure ranging from 1 atm to 7.2 GPa. The results inferred from the Raman spectra show that around 2.4 GPa some vibrational modes disappear, while others appear, besides discontinuities in the evolution of frequencies of several normal modes of vibration. This changes suggest a structural phase transition in adenosine occurring around 2.4 GPa, reversible, and without sample destruction, either during compression or during decompression. The fact that frequency discontinuities occur with modes associated with both nucleic acid and sugar suggests that the phase transition involves conformational changes of the two units of the adenosine molecule. As a consequence, it can be inferred that the change of symmetry in the unit cell involves the various hydrogen bonds, which ultimately constitute the intermolecular connections between the various molecules therein. / Nucleosídeos são compostos orgânicos formados por uma base nitrogenada e uma pentose. No presente trabalho foi realizado um estudo detalhado a respeito dos modos vibracionais do cristal do nucleosídeo adenosina (C10H13N5O4) submetido a altas pressões. Inicialmente o reagente que se encontrava em forma de pó foi cristalizado pelo método da evaporação lenta do solvente. No cristal obtido foram realizadas medidas de espectroscopia Raman. A região espectral investigada cobriu o intervalo entre 20 cm-1 e 1700 cm-1, tendo sido observados 49 modos vibracionais. A classificação destes modos foi feita tendo como referência trabalhos realizados com o material, além de investigações em outros nucleosídeos como a timidina e a citosina. Para submeter o material a altas pressões foi utilizada uma célula de pressão com bigorna de diamante tendo o nujol como meio compressor. O estudo foi realizado com a pressão variando entre 1 atm e 7,2 GPa. Os resultados inferidos a partir dos espectros Raman mostram que em torno de 2,4 GPa alguns modos vibracionais desaparecem, enquanto outros surgem, além de terem sido observadas descontinuidades na evolução das frequências de diversos modos normais de vibração. Tais mudanças sugerem uma transição de fase estrutural na adenosina ocorrendo em torno de 2,4 GPa, reversível, e sem destruição da amostra, seja durante a compressão ou seja durante a descompressão. O fato das descontinuidades das frequências ocorrerem com modos associados tanto ao ácido nucléico quanto ao açúcar, sugere que a transição de fase envolve mudanças conformacionais das duas unidades da molécula de adenosina. Como consequência, pode-se inferir que a mudança de simetria na célula unitária envolve as diversas ligações de hidrogênio, que em última análise constituem as conexões intermoleculares entre as várias moléculas ali existentes.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2099.pdf: 2520910 bytes, checksum: 6a3f1c1c7ca45d7fb8121098569f4c5b (MD5) Previous issue date: 2005-02-25 / Universidade Federal de Minas Gerais / In the last few years, the carbohydrate chemistry has been growing surprisingly, especially because of the diversity of biological applications of this class of compounds. This present work aimed to synthesize and evaluate a series of carbohydrates and nucleosides, in order to contribute for the study of their structure-activity relationship. A series of sugar esters from glucose, mannose, galactose and fructose with stearic and palmitic acids was synthesized with the respective acid chlorides in aqueous basic medium in the presence of DMAP with 30 - 40% yield. Mannofuranose, galactofuranose and fructose derivatives were prepared for the synthesis of β-L-mannofuranosyl(6→2)-fructosyl(2→6)-β-L-galactofuranose, however the coupling reactions were not successful and the synthesis was interrupted. Purinic nucleosides and analogs were synthesized under Mitsunobu conditions, using the appropriated purine and the respective alcohols, as for example, menthol, dodecanol, benzyl alcohol, oleic alcohol and glucose and mannose derivatives, with 37 - 86% yield. Synthesis of the carbocyclic nucleoside, 4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-[(trityloxy)methyl] cyclopentanol, was carried out until intermediate 6-chloro-9-(6-oxabicyclo[3.1.0]hex-3-yl)-9H-purine. After several attempts in order to open the epoxide with cyanides, the synthesis was discontinued. All synthetic compounds and a series of 22 commercial carbohydrates were biologically evaluated against T. cruzi gGAPDH and L. tarentolae APRT enzymes, several microorganisms and the leaf-cutting ant Atta sexdens. The evaluated carbohydrates were inactive or showed moderate inhibition against gGAPDH enzyme at 200 μM. D-isoascorbic acid showed an inhibition of 67% (100 μM) against the APRT enzyme. The evaluated nucleosides and analogs were inactive or showed low inhibition against the gGAPDH enzyme at 200 μM. 6-Chloro-9-dodecyl-9H-purine showed an inhibition of 63% (100 μM) against the APRT enzyme. The sugar esters of fatty acids presented no toxic effect to the ants. In the case of 6-O-estearoyl-D-glucopiranose, 6-O-palmitoyl-D-mannopiranose e 6-O-palmitoyl-D-galactopiranose, it was observed a small growth of the survival of the worker ants. They showed no inhibition or low inhibition (20%) of the symbiotic fungus Leucoagaricus gongylophorus. 6-Chloro-9-dodecyl-9H-purine showed a moderate inhibition against Escherichia coli. The compounds analyzed will be employed as models for the design and synthesis of more active compounds. / Nos últimos anos, o estudo da química dos carboidratos tem crescido de forma surpreendente, principalmente com relação à diversidade de aplicações biológicas desses compostos. O presente trabalho teve como objetivo sintetizar e avaliar uma série de carboidratos e nucleosídeos, para contribuir com o estudo da relação estrutura-atividade destas classes de compostos. Uma série de ésteres de açúcares derivados da glicose, manose, galactose e frutose com os ácidos esteárico e palmítico foi sintetizada a partir do respectivo cloreto de ácido em meio básico aquoso na presença de DMAP com rendimentos de 30 - 40%. Foram preparados derivados da manofuranose, galactofuranose e frutose com o objetivo de sintetizar a β-L-manofuranosil(6→2)-frutosil(2→6)-β-Lgalactofuranose, mas as reações de acoplamento desses monossacarídeos não tiveram sucesso e a sua síntese foi interrompida. Nucleosídeos purínicos e análogos foram sintetizados utilizando as condições de Mitsunobu para a purina desejada e os respectivos álcoois, como o mentol, dodecanol, álcool benzílico, álcool oléico e derivados da glicose e manose, com rendimentos de 37 - 86%. A síntese do nucleosídeo carbocíclico alvo, 4-(6-amino-9H-purin-9-il)-2-[(tritiloxi)metil]ciclopentanol, foi realizada até o intermediário avançado 6-cloro-9-(6-oxabiciclo[3.1.0]hex-3-il)-9H-purina. Várias metodologias foram empregadas na tentativa de abertura deste epóxido com cianetos, mas nenhuma foi eficiente. Todos os compostos sintetizados e uma série de 22 carboidratos comercias foram avaliados biologicamente com relação à atividade inibitória das enzimas gGAPDH de T. cruzi e APRT de L. tarentolae, atividade antimicrobiana e avaliação frente à formiga Atta sexdens. Os carboidratos avaliados foram inativos ou apenas inibiram moderadamente a enzima gGAPDH à 200 μM. Com relação à inibição da enzima APRT o ácido D-isoascórbico teve uma inibição de 67% (100 μM). Os nucleosídeos e análogos avaliados com relação à enzima gGAPDH à 200 μM foram inativos ou tiveram uma inibição baixa. Com relação à inibição da enzima APRT, a 6-cloro-9-dodecil-9H-purina apresentou uma inibição de 63% (100 μM). Os ésteres de açúcares derivados de ácidos graxos não apresentaram efeitos tóxicos às formigas. No caso dos ésteres, 6-O-estearoil-D-glicopiranose, 6-O-palmitoil-D-manopiranose e 6-O-palmitoil-D-galactopiranose, ocorreu um pequeno aumento da sobrevivência das operárias em relação aos respectivos controles. Com relação ao crescimento do fungo simbionte Leucoagaricus gongylophorus a maioria dos compostos não apresentou atividade e alguns inibiram no máximo a 20%. Dentre os compostos avaliados com relação ao potencial antimicrobiano a 6-cloro-9-dodecil-9Hpurina, mesmo não sendo tão expressivo como o controle, a Escherichia coli se mostrou sensível ao composto em questão. Os compostos analisados serão utilizados no planejamento e síntese de compostos mais ativos.

A tuberculose humana (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis, continua sendo uma ameaça à saúde pública no mundo, tendo resistido às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. A emergência de cepas resistentes a drogas levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novos compostos anti-TB. Estes agentes quimioterápicos podem ser desenhados baseados em vias metabólicas que sejam essenciais ao patógeno. Há uma necessidade contínua de estudos do metabolismo micobacteriano, como tentativa de identificar enzimas de relevância biológica, uma vez que estas podem representar alvos promissores para o desenvolvimento de novos agentes anti-TB. A fosforilase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtPNP), uma enzima chave da rota de salvamento de purinas, foi recentemente proposta como sendo essencial para a sobrevivência micobacteriana. Foi sugerido que esta enzima possa desempenhar um papel no processo de latência. Entretanto, não houve nenhum relato sobre o mecanismo enzimático e especificidade de substrato de MtPNP. No presente trabalho, demonstramos que MtPNP é mais específica por 2'-desoxiguanosina (2dGuo) e não catalisa a fosforólise de adenosina. Dados de velocidade inicial, inibição por produto e ligação em equilíbrio sugerem que MtPNP catalisa a fosforólise de 2dGuo por um mecanismo cinético ordenado em estado estacionário do tipo bi bi, onde o fosfato inorgânico liga-se primeiro, seguido pela ligação de 2dGuo para formar o complexo ternário cataliticamente competente, e ribose 1-fosfato é o primeiro produto a se dissociar, seguido pela guanina. Dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação de produto é o passo limitante da velocidade para a reação catalisada por MtPNP. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para o desenho de inibidores de MtPNP com potencial ação contra M. tuberculosis. / Human tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains a public health threat worldwide, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. The emergence of drug-resistant strains has led to an urgent need for the development of new anti-TB compounds. These chemotherapic agents can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism, as an attempt to identify enzymes of biological significance, as these might represent promising targets for the development of new anti-TB agents. M. tuberculosis purine nucleoside phosphorylase (MtPNP), a key enzyme of the purine salvage pathway, has been recently proposed to be essential for mycobacterial survival. It has been suggested that this enzyme may play a role in the latency process. However, there has been no report on MtPNP enzyme mechanism and substrate specificity. In the present work, we demonstrate that MtPNP is more specific to 2'-deoxyguanosine (2dGuo) and does not catalyze the phosphorolysis of adenosine. Initial velocity, product inhibition and equilibrium binding data suggest that MtPNP catalyzes 2dGuo phosphorolysis by a steady-state ordered bi bi kinetic mechanism, in which inorganic phosphate binds first followed by 2dGuo binding to form the catalytically competent ternary complex, and ribose 1-phosphate is the first product to dissociate followed by guanine. Pre-steady-state kinetic data indicate that product release is the ratelimiting step for MtPNP-catalyzed reaction. The results described here should be useful to the design of MtPNP inhibitors with potential action against M. tuberculosis.

A identificação de genes relacionados com resistência a compostos antiparasitários tem contribuído para um melhor entendimento do mecanismo de ação de alguns desses compostos. Utilizando a estratégia que permite a indução de super-expressão após transfecção gênica, isolamos dois loci relacionados com resistência ao análogo tóxico de purina, tubercidina (TUB). Em um desses locus identificamos um ortólogo do gene TOR (TOxic nucleoside Resistance) em L. (L.) major (TOR-Lm), capaz de conferir altos níveis de resistência a TUB. A identificação e localização cromossomal do segundo locus foi obtida, mas os testes funcionais em presença de TUB não foram tão significativos quanto os obtidos após a transfecção do TOR-Lm. Na segunda parte desta dissertação avaliamos a eficácia da associação de TUB com um inibidor específico do transporte de nucleosídeos em mamíferos, nitrobenziltioinosina (NBMPR), visando reverter a toxicidade de TUB apenas no hospedeiro. Demonstramos que TUB tem uma potente ação anti-parasitária em culturas de Leishmania spp., e que o inibidor NBMPR é capaz de proteger células mamíferas de camundongos infectados da ação tóxica de TUB. / Gene identification associated with drug resistance has contributed to a better understanding of the mechanism of action of anti parasitic compounds. Using transfection and over-expression selection strategy we isolated two loci related with the resistance of tubercidin (TUB), a toxic analog purine. In the first locus we identified an ortholog of the TOR gene (TOxic nucleoside Resistance) in L. (L.) major (TOR-Lm), capable to render wild cells resistance to TUB after transfection and over-expression. Chromosomal location and identification of the second locus was done, but functional tests in the presence of TUB were not as significant as those obtained after TOR-Lm transfection. In the second part of this work, we evaluate the effectiveness of the association of TUB with an inhibitor specific to the mammals nucleoside transport, as nitrobenzylthioinosine (NBMPR), aimed at reversing the TUB toxicity only on the host. We first demonstrate that TUB has a potent anti-parasitic action in cultures of Leishmania spp. Then, we discuss the capacity of the NBMPR inhibitor to protect infected macrophages from the toxic effects of TUB.

A tuberculose humana (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis, continua sendo uma ameaça à saúde pública no mundo, tendo resistido às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. A emergência de cepas resistentes a drogas levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novos compostos anti-TB. Estes agentes quimioterápicos podem ser desenhados baseados em vias metabólicas que sejam essenciais ao patógeno. Há uma necessidade contínua de estudos do metabolismo micobacteriano, como tentativa de identificar enzimas de relevância biológica, uma vez que estas podem representar alvos promissores para o desenvolvimento de novos agentes anti-TB. A fosforilase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtPNP), uma enzima chave da rota de salvamento de purinas, foi recentemente proposta como sendo essencial para a sobrevivência micobacteriana. Foi sugerido que esta enzima possa desempenhar um papel no processo de latência. Entretanto, não houve nenhum relato sobre o mecanismo enzimático e especificidade de substrato de MtPNP. No presente trabalho, demonstramos que MtPNP é mais específica por 2'-desoxiguanosina (2dGuo) e não catalisa a fosforólise de adenosina. Dados de velocidade inicial, inibição por produto e ligação em equilíbrio sugerem que MtPNP catalisa a fosforólise de 2dGuo por um mecanismo cinético ordenado em estado estacionário do tipo bi bi, onde o fosfato inorgânico liga-se primeiro, seguido pela ligação de 2dGuo para formar o complexo ternário cataliticamente competente, e ribose 1-fosfato é o primeiro produto a se dissociar, seguido pela guanina. Dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação de produto é o passo limitante da velocidade para a reação catalisada por MtPNP. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para o desenho de inibidores de MtPNP com potencial ação contra M. tuberculosis. / Human tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains a public health threat worldwide, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. The emergence of drug-resistant strains has led to an urgent need for the development of new anti-TB compounds. These chemotherapic agents can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism, as an attempt to identify enzymes of biological significance, as these might represent promising targets for the development of new anti-TB agents. M. tuberculosis purine nucleoside phosphorylase (MtPNP), a key enzyme of the purine salvage pathway, has been recently proposed to be essential for mycobacterial survival. It has been suggested that this enzyme may play a role in the latency process. However, there has been no report on MtPNP enzyme mechanism and substrate specificity. In the present work, we demonstrate that MtPNP is more specific to 2'-deoxyguanosine (2dGuo) and does not catalyze the phosphorolysis of adenosine. Initial velocity, product inhibition and equilibrium binding data suggest that MtPNP catalyzes 2dGuo phosphorolysis by a steady-state ordered bi bi kinetic mechanism, in which inorganic phosphate binds first followed by 2dGuo binding to form the catalytically competent ternary complex, and ribose 1-phosphate is the first product to dissociate followed by guanine. Pre-steady-state kinetic data indicate that product release is the ratelimiting step for MtPNP-catalyzed reaction. The results described here should be useful to the design of MtPNP inhibitors with potential action against M. tuberculosis.

Submitted by Natalia de Souza Gonçalves (natalia.goncalves@ufpe.br) on 2016-10-10T12:17:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Maralise-081214-VERSÃO corrigida biblioteca ATUALIZADA.pdf: 9951245 bytes, checksum: be34a8b4340d6e8daffcff6422e39f13 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T12:17:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Maralise-081214-VERSÃO corrigida biblioteca ATUALIZADA.pdf: 9951245 bytes, checksum: be34a8b4340d6e8daffcff6422e39f13 (MD5) Previous issue date: 2014-12-22 / síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS) é uma doença infecciosa e desde que foi descoberta nos EUA, em 1981, a AIDS se espalhou rapidamente, sendo considerada uma epidemia mundial caracterizada por uma imunodeficiência severa, infecções oportunistas, neoplasia e um resultado fatal. Apesar de já ser empregado a multiterapia anti-HIV, tal tratamento farmacológico traz como inconveniente resistência já relatada aos antivirais e a toxicidade provocada por esses fármacos. Dessa forma, é um desafio para os pesquisadores a busca por fármacos mais eficazes e menos tóxicos. A meta é minimizar o impacto dessa doença no Brasil e no mundo. Para tanto, conhecendo-se as propriedades dos tionucleosídeos, objetivou-se, no presente trabalho, a síntese, a caracterização e a avaliação da atividade antiviral e antitumoral de novos análogos tionucleosídeos da 5-metiluridina. A síntese dos análogos foi efetuada a partir de 2’,2-anidrotimidina. Reação deste composto com 2-(trimetilsilil)etanotiol na presença de carbonato de potássio, seguida da mesilação das hidroxilas de 3’ e 5’ forneceu o derivado dimesilado correspondente que, por reação com benzoato de sódio forneceu o tionucleosídeo 2’, 3’-didesidro correspondente, benzoilado em C-5’. Remoção do grupo benzoíla com hidróxido de potássio/metanol forneceu o nucleosídeo insaturado 2’,3’-didesidro-2’,3’-didesoxi-2’-(2-trimetilsilil)etiltio)timidina. Substituindo-se o 2-(trimetilsilil)etanotiol pelo tiometóxido de sódio o tionucleosídeo insaturado correspondente foi obtido. Quando o derivado anidro foi submetido a reação com hidreto de sódio em DMF, seguida da reação do epóxido formado com 2-(trimetilsilil)etanotiol, obteve-se um intermediário de configuração D-xilo, contendo a cadeia sulfurada em C-3’. Reação desse composto com carbonato de difenila em DMF, em presença de bicarbonato de sódio forneceu o derivado 2’,3’-insaturado correspondente, contendo o grupo fenoxicarbonila em C-5’. Esse intermediário foi convertido no tionucleosídeo insaturado correspondente de forma semelhante à descrita para a obtenção de 2’,3’-didesidro-2’,3’-didesoxi-2’-(2-trimetilsilil)etiltio)timidina. Também nesse caso, a substituição de 2-(trimetilsilil)etanotiol pelo tiometóxido de sódio levou, ao final da síntese, ao tionucleosídeo insaturado contendo o grupo metiltio em C-3’. Os produtos finais e alguns intermediários foram avaliados em testes de atividade citotóxica contra linhagem de células tumorais A549 (linhagem humana de câncer de pulmão). O intermediário 2’, 3’-didesidro benzoilado em C-5’ e derivado 2’,3’-insaturado contendo o grupo fenoxicarbonila em C-5’ destacaram-se entre os mais ativos da série, apresentando, respectivamente CC50 32,8 μM e 85,5 μM. Os testes de atividade contra o herpes vírus simplex humano tipo I (HSV-I) estão em andamento. Os testes contra o HIV serão realizados oportunamente. / Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) is an infectious disease and since its discovery in the USA in 1981, AIDS has spread rapidly and is considered a global epidemic characterized by severe immunodeficiency, opportunistic infections, cancer and a fatal outcome. Despite being already employed an anti-HIV multi-therapy, pharmacotherapy has drawbacks like viral resistance to antiviral drugs and drug toxicity. Thus, it is a challenge for researchers the search for more effective and less toxic drugs.The goal is to minimize the impact of this disease in Brazil and worldwide. To that end, knowing the properties of thionucleosides, the aim of the present work was the synthesis, characterization and evaluation of antiviral and antitumor activity of novel thionucleosides analogues of 5-methyluridine. Analogues synthesis was performed from 2', 2-anhydrothymidine. Reaction of this compound with 2- (trimethylsilyl)ethanethiol in the presence of potassium carbonate, followed by mesylation of hydroxyl groups at 3' and 5' provided the corresponding mesylated derivative, which, by reaction with sodium benzoate, provided the corresponding 2',3'-didehydro, benzoylated at C-5'. Removal of benzoyl group with potassium hydroxide/methanol gave the unsaturated nucleoside 2',3'- didehydro-2',3'-dideoxy-2'-(2-trimethylsilyl)ethylthio)thymidine. Replacing 2- (trimethylsilyl)ethanethiol by sodium thiomethoxide, the corresponding unsaturated thionucleoside was obtained. When the anhydro derivative was subjected to reaction with sodium hydride in DMF, followed by reaction of the epoxide formed with 2-(trimethylsilyl)ethanethiol, a D-xylo intermediate, with the side chain at C-3' was obtained. Reaction of this compound with diphenyl carbonate in DMF in the presence of sodium bicarbonate provided the corresponding 2',3'-unsaturated derivative containing phenoxycarbonyl group at C-5'. This intermediate was converted to the corresponding unsaturated thionucleoside in a similar way to that described to obtain 2', 3'-didehydro-2',3'- dideoxy-2'- (2-trimethylsilyl)ethylthio)thymidine. Also in this case, replacing 2- (trimethylsilyl)ethanethiol by sodium thiomethoxide led to the unsaturated thionucleoside containing methylthio group at C-3'. Final and some intermediate compounds were evaluated for cytotoxicity activity against tumor cell line A549 (human lung cancer strain). 2',3'-didehydro thionucleoside benzoylated at C-5' and 2',3'-unsaturated thionucleoside containing phenoxycarbonile group at C-5' derivative were the most active compounds in this series, presenting CC50 values of 32.8 μM and 85.5 μM, respectively. Tests for antiviral activity against human herpes simplex virus type I (HSV-I) are in progress. Anti-HIV screening will be conducted in the near future.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-05-03T20:20:57Z No. of bitstreams: 1 gustavosenragoncalvesdecarvalho.pdf: 5276279 bytes, checksum: aa3f838f0b318ba70f85c3713711fde6 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-13T13:54:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gustavosenragoncalvesdecarvalho.pdf: 5276279 bytes, checksum: aa3f838f0b318ba70f85c3713711fde6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-13T13:54:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gustavosenragoncalvesdecarvalho.pdf: 5276279 bytes, checksum: aa3f838f0b318ba70f85c3713711fde6 (MD5) Previous issue date: 2007-08-01 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Este trabalho apresenta uma nova metodologia para síntese de análogos da 5’-metil-tioadenosina, importante regulador metabólito, controlador da 5’-metil-tioadenosina/S-adenosilhomocisteína (MTA/SAH) nucleosidase. Esta enzima está presente em diversos microorganismos patógenos, como por exemplo, no Plasmodium falciparum, sendo essencial para seu metabolismo. O P. falciparum é um dos causadores da malária, doença que afeta grande parte dos países do terceiro mundo, e que vem aumentando o número de vítimas a cada dia. Para a obtenção dos análogos foi utilizada uma síntese total utilizando como material de partida o D-glicose. Os carboidratos são muito utilizados em sínteses, devido a apresentarem um baixo custo e por já possuírem estereocentros definidos. Este carboidrato foi inicialmente tratado com acetona em meio ácido, fornecendo o derivado 1,2;5,6-di-O-isopropilideno-α-D-glicofuranose 1, que sofreu desproteção regioseletiva nas posições C-5 e C-6, gerando o 1,2-O-isopropilideno-α-D-glicofuranose 2. A este derivado foi realizada uma clivagem oxidativa em C-5/C-6 e subsequentemente uma condensação aldólica, fornecendo o intermediário 4-C-hidroximetil-1,2-O-isopropilideno-α-D-xilofuranose 3. A tosilação deste intermediário e subseqüente reação com tioacetato de potássio, através de uma substituição nucleofílica interna, forneceu o composto 1,2-O-isopropilideno-4,4-C-tietano-3-O-tosil-α-D-treofuranose 6. A este intermediário foi feita a acetilação das hidroxilas em C-1 e C-2 e em seguida o acoplamento com a base nitrogenada, fornecendo os precursores nucleosídicos 6-N-benzoil-9-[2’-O-acetil-4’,4’-C-tietano-3’-O-tosil-βD-treofuranosil]-adenina 10a e 6-N-benzoil-9-[2’-O-acetil-4’,4’-C-tietano-3’-Otosil-α-D-treofuranosil]-adenina 10b. Ao primeiro precursor (o isômero β) aplicou-se a desproteção dos grupos acilas, obtendo-se o composto 9,2’-anidro-[4’,4’-C-tietano-β-D-eritrofuranosil]-adenina 11, análogo a MTA. Todos os compostos obtidos foram caracterizados por diferentes técnicas espectroscópicas, a saber, infravermelho, RMN 1D e 2D e espectrometria de massas. / This work presents a new method for the synthesis of 5’-methylthioadenosyne (MTA) analogues, which is an important metabolic regulator and controller of the 5’-methylthioadenonsine/S-adenosylhomocysteine (MTA/AdoHcy) nucleosidase. This enzyme is present in many pathogen microbes, for example, in the Plasmodium falciparum, and this one is essential for your metabolism. The microorganism P. falciparum causes malaria, a disease, which affects a lot of people in countries of third world and it has been increasing every day. In the synthesis of analogues, a total synthesis from D-glucose was used. The carbohydrates are very used in synthesis, since they show a low cost and defined estereocenters. This carbohydrate was initially treated with acetone in acidic conditions, giving rise to the derivative 1,2;5,6-di-O-isopropylidene-α-D-glucofuranose 1, which was submitted to a regioselective deprotection in C-5 and C-6, furnishing 1,2-O-isopropylidene-α-D-glucofuranose 2. For this derivative a oxidative cleavage in C-5/C-6 and in sequence an aldol reaction are realized, leading to the intermediate 4-C-hydroxymethyl-1,2-di-O-isopropylidene-α-D-xylofuranose 3. A tosilation of this intermediate and in sequence a reaction using potassium thioacetate, through an intra nucleophilic substitution, produce the compound 1,2-O-isopropylidene-4,4-C-tietane-3-O-toluenesulphonyl-α-D-threofuranose 6. In this intermediate, an acetylation of this hydroxyls in C-1 and C-2 followed by a coupling with nitrogen base were carried out, leading to the nucleosides precursors 6-N-benzoyl-9-[2’-O-acetyl-4’,4’-C-tietane-3’-O-toluenesulphonyl-β-D-threofuranosyl]-adenine 10a e 6-N- benzoyl -9-[2’-O- acetyl -4’,4’-C- tietane -3’-O- toluenesulphonyl -α-D-threofuranosyl]-adenine 10b. In the first precursor (isomer β) a deprotection in the acyl groups was made, furnishing the compound 9,2’-anhydrous-[4’,4’-C-tietane-β-D-erithrofuranosyl]-adenine 11, which is an analogue of MTA. All obtained compounds were characterized by different spectroscopic techniques, including infrared spectroscopy, 1D and 2D NMR and mass spectrometry.