Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_gomes_ioc_mest_2014.pdf: 3321973 bytes, checksum: 59b3c4b51a637c1e44229ae143291433 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, o qual afeta cerca de 6-8 milhões de pessoas em áreas endêmicas da América Latina. As diferentes cepas envolvidas na infecção, e sua distribuição regional, tem sido sugeridas como causa das diferentes manifestações clínicas, resposta ao diagnóstico e eficácia terapêutica. A ecto-NTPDase é uma enzima localizada na superfície externa da membrana plasmática do T.cruzi, que hidrolisa nucleotídeos tri e difosfatados. Estudos anteriores têm relacionado esta enzima à infectividade e virulência de tripanosomatídeos, além de sugerir um papel importante na captação de purinas pelos parasitos. Neste trabalho avaliamos os níveis de mRNA para a TcNTPDase-1 por RT-PCR, em diferentes isolados do parasito (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167- T.cruzi IV; LL014- T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulenta), em formas não-infectantes (epimastigotas) e infectantes (tripomastigotas e amastigotas). Os ensaios de PCR em Tempo Real foram realizados com oligonucleotídeos desenhados para amplificar uma sequência de 111pb do gene TcNTPDase-1 e, como controles endógenos, uma sequência de 268pb do gene da TcCalmodulina e uma sequência de 100pb do gene TcGAPDH foram utilizados. Nós observamos que epimastigotas das cepas Y, 3663, 4167 e LL014 apresentaram os mesmos níveis de expressão do gene TcNTPDase-1 que o clone CL-14, avirulento Por outro lado, o clone Dm28c expressou 7,2\F0B11,5 vezes mais o gene desta enzima que o clone CL-14. Além disso, observamos que as formas infectantes tripomastigota e amastigota apresentaram, respectivamente, uma expressão 22,5\F0B15,6 e 16,3\F0B13,8 vezes maior que a forma epimastigota. Observamos também que durante a curva de crescimento de formas epimastigotas a 28°C e 37°C a expressão deste gene aumenta gradativamente com o tempo de cultivo, sendo mais pronunciado a 37°C, sugerindo que o choque-térmico e o longo período de cultivo pode aumentar a expressão do gene da TcNTPDase-1. Em conjunto, nossos dados sugerem que a TcNTPDase-1 estaria envolvida nos processos de infectividade do T.cruzi, bem como adaptação do parasita a temperatura do hospedeiro vertebrado. Devido sua importância para o T.cruzi, a TcNTPDase-1 apresenta potencial para ser avaliada como possível alvo para quimioterapia da Doença de Chagas / Chagas disease is a negl ected illness caused by the parasite protozoan Trypanosoma cruzi , which affects 6 - 8 million people in endemic areas of Latin America . The distinct strains involved in infection, in conjunction with the regional distribution, have been suggested to cause di fferent clinical manifestations and therapeutic efficiency in Chagas Disease. The ecto - NTPDase is an apyrase located on the outer surface of T. cruzi plasma membrane - that hydrolyzes tri - and/or di - phosphate nucleotides . Previous studies related this enzyme to the infectivity and virulence of the parasite , and suggest an important role in the uptake of purines . In this study, we evaluate the mRNA levels for the e cto - NTPDase I by RT - PCR in distinct isolated parasites (Dm28c - T. cruzi I; Y - T. cruzi II; 3663 - T. cruzi III; 4167 - T. cruzi IV; LL014 - T.cruzi V ; CL - 14 - T. cruzi VI - avirulent ) , in non - infective forms (epimastigotes) and infective forms (amastigotes and trypomastigotes) . The Real Time PCR assays were performed with primers designed to amplify a 111b p seq uence in the TcNTPDase - 1 gene and, as endogenous controls, a 268bp sequence in the TcCalmoduline gene and a 100bp sequence in the Tc GAPDH gene were used. We observed that the epimastigotes of strain s Y, 3663, 4167 e LL014 expressed the same levels of the g ene of TcNTPDase - 1 that the CL - 14 clone, avirulent. On the other hand, the Dm28c clone expressed 7 . 2  1 . 5 times higher the gene of this enzyme that the C L - 14 clone. Surprisingly, w e observed that the trypomastigote and amastigote presented expression levels , respectively, 22 . 5  5 . 6 and 16 . 3  3 . 8 time s higher than the epimastigote form. Moreover, following the epimastigotes growth curve at 28°C e 37°C , we also observed that the expression of TcNTPDase - 1 increases with the days of growth, and this increase is mo re pronounced at 37°C , suggesting that heat shock and long - term cultivation could increase TcNTPDase - 1 gene expression . In conjunction, our results suggest the role of TcNTPDase - 1 on T. cruzi infectivity and adjustment to stress conditions s uch as nutrients starvation and heat shock. Due to its importance for T. cruzi , TcNTPD ase - 1 has the potential to be e valuated as a possible target for chemotherapy of Chagas Disease .

O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado.O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de Baco bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca catiônica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3?M para o KM e 222 s-1para o kcat. O valor para o KM é O menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Cinco conjuntos de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75? a 1,75 ?. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75?) foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB 195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9? de resolução e em complexo com fosfato a 2,0? de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e a mesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs. / The parasite Schistosoma mansoni, unlike its mammalian hosts, lacks the \"de novo\" pathway for purine biosynthesis and depends on the salvage pathways for its purine requirements. One component of this pathway is Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to generate the corresponding purine base and ribose 1-phosphate. In the Schistosoma mansoni Genome Project the gene for this enzyme was isolated. The SmPNP cDNA was sequenced, corresponding to 1055 bases that code for a 287 amino acid protein with 49% sequence identity to its human erythrocyte homologue. The SmPNP gene was cloned into the pMAL C2G expression vector and the recombinant fusion protein was produced and purified using an amylose affinity column (approx. 80mg/mL). The fusion protein is composed of a Maltose Binding Protein adjoined to the SmPNP. After cleavage with Factor Xa, the cleavage product was purified using a cation exchange column. The KM and kcat of SmPNP for inosine phosphorolisis was determined to be 3?M and 222 s-1 respectively. This corresponds to the lowest value for KM yet described for a low molecular mass PNP. SmPNP crystals were obtained by the hanging drop method, using 18-24% PEG 1500, 20% glycerol in the presence of 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.0). When NDSB195 was used as an additive in the SmPNP crystallization the solution used was 28-30% PEG 1500, 20% glycerol and 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.O).Five datasets were obtained in the presence and absence of ligands, varying in resolution from 2,75 to 1,75?. All structures were solved by the molecular replacement method. The first structure (at 2,75?) was solved using the bovine PNP as the search model and in the remaining structures the search model was the SmPNP structure itself. The 1,75? structure was obtained from a crystal grow in the presence of the additive NDSB195, and after its determination NDSB195 was observed bound to the SmPNP active site via its phosphate binding site. Structures were also obtained for the apo SmPNP at 1,9? and its complex with phosphate at 2,0? resolution. All structures were used in the comparison with other low molecular mass PNPs. The SmPNP structure at 1,75A resolution was used in the search small molecule ligands, which potentially bind to SmPNP via virtual screening. For this purpose the program Gold together with a database of 36000 compounds with MW lower than 280Da was used. As a result 22 compounds were selected using the docking score and the H-bonding interaction with the key residues of the SmPNP active site. Using the bovine PNP and same docking approach 19 compounds were selected. These 41 compounds were assayed against SmPNP enzyme and 12 compounds were active against the SmPNP. One complex between SmPNP and one of these compound (AT2 169) was obtained and refined. This virtual screening approach was validated using known ligands of PNPs including inosine, guanosine, immucilins, etc.

O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado.O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de Baco bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca catiônica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3?M para o KM e 222 s-1para o kcat. O valor para o KM é O menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Cinco conjuntos de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75? a 1,75 ?. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75?) foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB 195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9? de resolução e em complexo com fosfato a 2,0? de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e a mesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs. / The parasite Schistosoma mansoni, unlike its mammalian hosts, lacks the \"de novo\" pathway for purine biosynthesis and depends on the salvage pathways for its purine requirements. One component of this pathway is Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to generate the corresponding purine base and ribose 1-phosphate. In the Schistosoma mansoni Genome Project the gene for this enzyme was isolated. The SmPNP cDNA was sequenced, corresponding to 1055 bases that code for a 287 amino acid protein with 49% sequence identity to its human erythrocyte homologue. The SmPNP gene was cloned into the pMAL C2G expression vector and the recombinant fusion protein was produced and purified using an amylose affinity column (approx. 80mg/mL). The fusion protein is composed of a Maltose Binding Protein adjoined to the SmPNP. After cleavage with Factor Xa, the cleavage product was purified using a cation exchange column. The KM and kcat of SmPNP for inosine phosphorolisis was determined to be 3?M and 222 s-1 respectively. This corresponds to the lowest value for KM yet described for a low molecular mass PNP. SmPNP crystals were obtained by the hanging drop method, using 18-24% PEG 1500, 20% glycerol in the presence of 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.0). When NDSB195 was used as an additive in the SmPNP crystallization the solution used was 28-30% PEG 1500, 20% glycerol and 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.O).Five datasets were obtained in the presence and absence of ligands, varying in resolution from 2,75 to 1,75?. All structures were solved by the molecular replacement method. The first structure (at 2,75?) was solved using the bovine PNP as the search model and in the remaining structures the search model was the SmPNP structure itself. The 1,75? structure was obtained from a crystal grow in the presence of the additive NDSB195, and after its determination NDSB195 was observed bound to the SmPNP active site via its phosphate binding site. Structures were also obtained for the apo SmPNP at 1,9? and its complex with phosphate at 2,0? resolution. All structures were used in the comparison with other low molecular mass PNPs. The SmPNP structure at 1,75A resolution was used in the search small molecule ligands, which potentially bind to SmPNP via virtual screening. For this purpose the program Gold together with a database of 36000 compounds with MW lower than 280Da was used. 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Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-06-29T15:07:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Ellison Neves de Lima.pdf: 2220112 bytes, checksum: c162c2bc01bd992deeae26d6a7891ccd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T15:07:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Ellison Neves de Lima.pdf: 2220112 bytes, checksum: c162c2bc01bd992deeae26d6a7891ccd (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / CNPq / O Papilomavírus humano (HPV) é um vírus causador de verrugas genitais. Estimase que até 80% das mulheres adquiram uma infecção pelo HPV durante sua vida, sendo os vírus tipo 6 e 11 responsáveis por 70% dos casos. A infecção persistente pelo HPV é considerada com a mais importante causa do câncer do colo de útero. O cidofovir é um análogo de nucleosídeo, ativo contra DNA vírus, que inibem a polimerase do DNA viral por seu difosfato metabólito. Estudos “off-label” demonstraram que a aplicação tópica do cidofovir inibiu ou preveniu o desenvolvimento de papilomas. Sabendo que não há padronização da concentração do cidofovir ou forma farmacêutica para aplicação tópica, este trabalho objetiva estudar o desenvolvimento de formas farmacêuticas emulsionadas e microemulsionadas contendo ou não promotores de permeação, realizar a caracterização físico-química destas formulações e realizar estudos de liberação utilizando membrana sintética e permeação cutânea através da pele de orelha de porco. Nas preparações desenvolvidas avaliou-se o pH, viscosidade, aspecto organoléptico, tamanho de gotículas e exclusivamente para as microemulsões: condutividade, índice de refração, potencial zeta e microscopia de luz polarizada. Para a quantificação das amostras nos estudos de liberação e permeação utilizou-se as técnicas de espectrofotometria por ultravioleta e cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta, respectivamente. Nos estudos de liberação e permeação observou perfis semelhantes entre as formulações, porém notou-se que as formulações microemulsionadas tiveram melhor retenção tanto no estrato córneo quanto na derme e epiderme. Constatou-se que a utilização dos promotores de permeação não incrementaram as quantidades permeadas e retidas do fármaco na pele. / The human papillomavirus (HPV) is a virus that causes genital warts. It is estimated that up to 80% of women acquire an HPV infection during their lifetime, virus type 6 and 11 are responsible for 70% of cases. Persistent infection with HPV is considered the most important cause of cancer of the cervix. Cidofovir is a nucleoside analogue, active against DNA viruses, which inhibit viral DNA polymerase by its diphosphate metabolite. Studies "off-label" demonstrated that topical application of cidofovir inhibited or prevented the development of papillomas. Knowing that there is no standardization of the concentration of cidofovir or pharmaceutical form for topical application, this paper aims to study the development of dosage forms and emulsified microemulsion with or without permeation enhancers, perform physical-chemical characterization of these formulations and release studies using membrane synthetic skin permeation through pig ear skin. In preparations developed evaluated the pH, viscosity, sensory aspect, droplet size and solely for microemulsions: conductivity, refractive index, zeta potential and polarized light microscopy. To quantify the samples studied release and permeation techniques was used for ultraviolet spectrophotometric and high performance liquid chromatography with ultraviolet detection, respectively. In studies of release and permeation observed similar profiles among formulations, however noted that microemulsion formulations were much better retention in the stratum corneum and in the epidermis and dermis. It was found that the use of permeation enhancers did not increase the amount of drug permeated and retained on the skin.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The synthesis of compounds that use a nucleoside as the base structure, has an intense field application. Among these compounds, the most known nowadays is azydothymidine or zidovudine, a drug which was first synthesized to work against tumor processes. However, it was discovered that it could take action to viral combat and now it is the drug of choice in the treatment of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). On the other hand, organochalcogens compounds have been calling the attention of the scientific community, mainly because of their potential in biological molecules containing these atoms. Considering this last factor and aiming to explore the structural basis of nucleosides and biological influences that changes in the 5' position of the deoxyribose ring of AZT would promote, it was planned through an efficient and accessible synthetic route to produce a new series of nucleosides, the 5'-arylseleno azidothymidine, which had the insertion of the selenium atom connected to different aril groups. Moreover, the series of selenium derivatives were evaluated for their toxicological potential for oxidative stress (TBARS and thiol peroxidase), where the compounds 5´-p-methylseleno azidothymidine 3b and 5´-p-chloroseleno azidothymidine (3h) had the results of this series, with potential as antioxidant agent. After this, the compounds 3b and 3h were tested against culture cell lines of bladder cancer (5637). The tests aimed to assess the cytotoxicity, cell morphology, apoptosis analysis and gene expression. The results showed that the compounds 3b and 3h present apoptotic profile, additionally they seem to modulate the expression of anti-apoptotic gene. The results obtained indicate that the compounds 3b and 3h in addition of presenting an antioxidant potential, have a pro-apoptotic profile, even more effective than AZT itself. Considering all the results presented, it was concluded that this new nucleoside serie has great antitumor potential and can be used as a chemopreventive, combined to the antioxidant potential. / A síntese de compostos que usam como base a estrutura de nucleosídeos é um campo que possui uma intensa aplicação biológica. Dentre estes compostos, o mais conhecido é a azidotimidina ou zidovudina (AZT), um fármaco que teve sua síntese inicial voltada para o combate de processos tumorais. No entanto, descobriu-se que este poderia agir no combate viral e hoje é o fármaco de primeira escolha no tratamento da síndrome da imunodeficiência adquirida. Adicionalmente, compostos organocalcogênio, principalmente compostos de selênio, despertam a atenção da comunidade científica principalmente devido as suas potencialidades biológicas. Dessa forma, a fim de explorar a base estrutural dos nucleosídeos e as influências biológicas que modificações na posição 5´ do anel da desoxirribose do AZT promoveriam, planejou-se através de uma eficiente rota sintética, a síntese de uma nova série de nucleosídeos, os 5´-arilseleno azidotimidina, que apresentaram a inserção do átomo de selênio ligados a diferentes grupamentos arílicos. Com o objetivo de realizarmos uma seleção dos melhores compostos da série de selenonuclesídeos, avaliamos o parâmetro toxicológico para o estresse oxidativo (TBARS e tiol peroxidase) destes compostos. Onde, os compostos 5´-p-metilseleno azidotimidina (3b) e 5´-p-cloroseleno azidotimidina (3h) apresentaram os resultados mais promissores, apresentando inclusive perfil como agente antioxidante. Dessa forma, após realizarmos a triagem, os compostos 3b e 3h tiveram suas atividades testadas frente à cultura celular de linhagem de câncer de bexiga (5637). Os testes buscaram avaliar os parâmetros de citotoxicidade, morfologia celular, análise apoptótica e a expressão gênica. Os resultados obtidos mostraram que os compostos 3b e 3h apresentaram perfil apoptótico, além de serem capazes de modular a expressão do gene anti-apoptótico. Por fim, os resultados obtidos, apontam que os compostos 3b e 3h além de apresentarem um perfil antioxidante, possuem ação pró-apoptótica mais eficientes do que o próprio AZT. Dessa forma, considerando todos os resultados obtidos, foi possível concluir que essa nova série de nucleosídeos apresenta potencial antitumoral, podendo ser usado quimiopreventivamente, aliado ao perfil antioxidante.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-08-18Bitstream added on 2014-06-13T20:29:19Z : No. of bitstreams: 1 silva_don_me_sjrp.pdf: 1054782 bytes, checksum: 832047dd271670cc0bc6debdbd5dc8d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) catalisa a fosforólise de nucleosídeos de purina para suas respectivas bases e açucares (ribose ou desoxirribose) 1-fosfato. A PNP desempenha uma função central no metabolismo das purinas, normalmente operando na via de recuperação do DNA das células. Mais ainda, a PNP cliva ligações glicosídicas com inversão da configuração para produzir a-ribose 1-fosfato. Acredita-se que no organismo do Mycobacterium tuberculosis a PNP desempenha tarefas similares, o que levanta o interesse em desenvolver ciência que dê suporte para o desenvolvimento de drogas baseadas na estrutura desta proteína. A proteína é um homotrímero simétrico com um arranjo triangular das subunidades, similar às PNPs triméricas de mamíferos. Cada monômero consiste de um enovelamento a/ß formado por onze fitas ß circundadas por oito hélices a. O estudo desta PNP visa proporcionar comparações com outras estruturas, na intenção de identificar as bases estruturais de possíveis diferenças ou similaridades funcionais entre esta e outras PNPs, num esforço para desenvolver pesquisa que dê suporte para o desenho de novas drogas mais seletivas e poderosas contra a tuberculose. / The Purine nucleoside phosphorylase (PNP) catalyses the phosphorolysis of purine nucleosides to corresponding bases and ribose 1-phosphate. PNP plays a central role in purine metabolism, normally operating in the purine salvage pathway of cells. Moreover, PNP cleaves glycosidic bond with inversion of configuration to produce á-ribose 1-phosphate. It is believed that in the MtPNP is responsible for the same labor in the Mycobacterium tuberculosis organism, which arouses the interest in developing science for giving support to the development of structure based drugs. The protein is a symmetrical homotrimer with triangular arrangement of the subunits, similar to the trimeric mammalian PNPs. Each monomer consist of a á/â folding formed by eleven â sheet surrounded by eight á helices. The study of this PNP aims the possibility of caring out comparisons with other structures, in order to identify the structural basis of possible differences or functional similarities between this and other PNPs, in an effort to develop research which gives support to the design of more selective and powerful new drugs against tuberculosis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:10:04Z : No. of bitstreams: 1 souza_mm_me_sjrp.pdf: 836354 bytes, checksum: 11c4cceceb0b5cfc0fbfbee0acea3de5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / De acordo com a OMS, a tuberculose mata 5000 pessoas por dia, e se não controlada, são estimados 35 milhões de novos casos nos próximos vinte anos. A alta susceptibilidade dos infectados por HIV para a tuberculose, bem como a proliferação da tuberculose multidroga-resistente (MDR), tem criado um grande interesse mundial de expansão nos programas atuais de pesquisas sobre a tuberculose. A Purina Nucleosídeo Fosforilase do Mycobacterium tuberculosis (MtPNP) é um potencial alvo para novas drogas anti-tuberculose visto que é responsável pela síntese de novo de ribonucleotídeos de purina. A Inibição específica da PNP poderia potencialmente levar o M. tuberculosis ao estado latente. O objetivo desde trabalho é resolver a estrutura da MtPNP complexada com adenina, e analisar as interações com os ligantes. A MtPNP foi cristalizada utilizando condições experimentais descritas posteriormente, e o ligante (adenina) foi adicionado por soaking. Os dados de difração de raios X foram coletados no detector CCD utilizando fonte de radiação síncotron (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, LNLS, Campinas, Brazil). O programa MOSFLM foi utilizado para o processamento, e os dados foram escalonados através do programa SCALA, apresentando o grupo espacial ortorrômico P21212 (a=118,96Å, b=134,65 Å, c=44,42 Å). O cristal foi determinado utilizando o método de substituição... / In according to the WHO, the tuberculosis kills 5000 people every day, if does not controlled, are esteemed 35 millions of new cases in next 20 years. The high susceptibility of human immunodeficiency virus infected persons to the disease and the proliferation of multidrug-resistant (MDR) strains have created a worldwide interest in expanding current programs in tuberculosis research. The Purine Nucleoside Phosphorylase from Mycobacterum tuberculosis (MtPNP) is a potential target for new drug anti-tuberculosis, whereas is responsible for de novo synthesis of purine ribonucleotides. The specific inhibition of M. tuberculosis PNP could potentially lead to the latent state of M. tuberculosis. The objective of this work is to solve the structure from MtPNP complexed with adenine, and to analyze their interactions with the ligand. MtPNP was crystallized using the experimental conditions described elsewhere, and the ligand (adenine) was added by soaking. The X-ray diffraction data were collected on a CCD detector using synchrotron radiation source (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, LNLS, Campinas, Brazil). It was used the MOSFLM program to processing, and the data were scaled through the program SCALA, presenting orthorhombic spatial group P21212 (a=118,96Å, b=134,65 Å, c=44,42 Å). The crystal was determined by molecular replacement methods using the program AMoRe. The final model has Rfree and Rfactor of 23.87% and 17.51% respectively, and maximum resolution of 1.86Å. It was observed a large...(Complete abstract click electronic access below)

Foram determinadas por meio de difração de raios x as estruturas de cinco compostos azaçúcares. Foram estudadas as interações envolvidas na formação das redes cristalinas em cada um dos compostos analisados. Foi encontrado que nos compostos azaçúcares estudados, as interações principais são as ligações de hidrogênio do tipo C-H···O e C-H···π. Este comportamento foi verificado usando ferramentas como as superfícies de Hirshfeld e os gráficos de impressão digital. Realizou-se o estudo de docking molecular dos compostos azaçúcares com respeito à enzima purina nucleosídeo fosforilase (PNP). Foi determinado que estes compostos têm a capacidade de entrar no sitio ativo da PNP. O estudo das interações dos cinco azaçúcares com a PNP mostrou que estes compostos apresentam as mesmas interações presentes em inibidores da PNP já reportados. / Structures of five azasugars were determined by X-ray diffraction. Crystal network interactions were analyzed for each compound. The main interaction found for these azasugar compounds is hydrogen bond as C-H···O e C-H···π. This behavior was verified by tools as Hirshfeld surface and 2D finger print plots. Molecular docking was performed for azasugar compounds in Purine Nucleoside phosphorylase (PNP). This study confirmed that these compounds are available to enter to the PNP active site. Interactions exploration showed the same interactions for the azasugars studied and for already known PNP inhibitors.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:25Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00212.pdf: 1245886 bytes, checksum: 4848d0e58992c5a9ff4b387a14c2534a (MD5) / Objetivos: Analisar a expressão das proteínas CD10 e NM23 por estudo imunohistoquímico do tecido do carcinoma colorretal e da mucosa adjacente. Avaliar a relação da expressão dessas proteínas com os aspectos anatomopatológicos da neoplasia, estadiamento clínico, ocorrência de metástases hepáticas e prognóstico dos doentes. Método: Cento e trinta doentes operados por carcinoma colorretal foram analisados. Bloco de tissue microarray foi confeccionado com tecido neoplásico e com a mucosa não neoplásica adjacente. Estudo imuno-histoquímico foi realizado com anticorpos monoclonais NM23 e CD10 no tecido neoplásico e no tecido não neoplásico da mucosa adjacente. A leitura foi realizada por aparelho de escaneamento de lâminas. A imunoexpressão foi avaliada pelo percentual de células coradas e foram obtidos escores de intensidade. Foram considerados como positivos para CD 10 os tumores que expressavam o marcador em mais de 10% das células neoplásicas. Para NM 23 considerou-se dois grupos divididos em fortes expressores (mais de 50%) e expressores fracos (menos de 50%) das células coradas. Os resultados foram relacionados com as características morfológicas e histopatológicas do carcinoma colorretal, estadiamento clínico, presença de metástases hepáticas e com o prognóstico. No estudo estatístico foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal- Wallis e exato de Fisher. A sobrevivência foi avaliada utilizando a curva de Kaplan- Meier, e o desfecho de comparação entre as curvas foi calculado pelo teste de Long rank. Resultados: Ambos os marcadores CD10 e NM23 apresentaram expressão maior no tecido do carcinoma do que na mucosa não neoplásica adjacente (p<0,0001 para ambos). A imunoexpressão tecidual das proteínas NM23 e CD10 não apresentou relação com o grau de diferenciação celular (p=0,57 e p=0,48, respectivamente), invasão vascular (p=0,85 e p=0,67, respectivamente), invasão linfática (p=0,41 e 0,73, respectivamente), infiltração perineural (p=0,46 e p=0,24, respectivamente) e com o estadiamento pela classificação TNM (p=0,19 para ambos). A imunoexpressão de CD10 no tecido do carcinoma colorretal foi maior (p=0,05) nas neoplasias exofíticas do que nos tumores não exofíticos. A expressão das proteínas NM23 e CD10 não apresentou relação com a incidência de metástases linfonodais (p=0,08 e 0,30, respectivamente). A expressão tecidual dos marcadores NM23 e CD10 não se relacionou com a ocorrência de metástases hepáticas (p=0,59 e p=0,31, respectivamente). A sobrevivência livre de doença mostrou relação significante (p=0,01) com a maior intensidade de imunoexpressão da proteína NM23 no tecido do carcinoma colorretal, o mesmo não ocorrendo com a imunoexpressão da proteína CD10 (p=0,18). A sobrevivência global não mostrou relação com as expressões das proteínas NM23 e CD10 (p=0,13 e p=0,24, respectivamente). Conclusões: O tecido neoplásico do carcinoma colorretal expressou mais intensamente as proteínas NM23 e CD10 do que a mucosa não neoplásica adjacente. A imunoexpressão de CD10 no tecido do carcinoma colorretal foi maior (p=0,05) nas neoplasias exofíticas do que nos tumores não exofíticos. A expressão das proteínas NM23 e CD10 não se relacionou com os demais aspectos anatomopatológicos da neoplasia, com a presença de metástase hepática e com o estadiamento do carcinoma colorretal. Os doentes com imunoexpressão aumentada da proteína NM23 apresentaram sobrevivência livre de doença significativamente maior. A intensidade da imunoexpressão tecidual da proteína CD10 não influenciou a sobrevivência livre de doença e a sobrevivência global não se relacionou com a imunoexpressão das proteínas NM23 e CD10. / Aims: To analyze the tissue expression of the proteins CD 10 and NM 23 through the immunohistochemichal study of the colorectal carcinoma and evaluate the expression relation of these proteins with the anatomopathological aspects of the neoplasia, clinical staging, occurrence of hepatic metastasis and patients’ prognostic. Method: One hundred and thirty operated patients of colorectal carcinoma have been analyzed. A block of tissue microarray was produced with the neoplastic mucosa and with the adjacent non-neoplastic mucosa. An immunohistochemichal study was performed with monoclonal antibodies NM23 and CD10 on the neoplastic tissue and non-neoplastic tissue of the adjacent mucosa. The interpretation of the slides was made by a scanner device. The immunoexpression was evaluated by the percentage of colored cells and the obtained intensity scores. The results were related to the morphological and histopathological characteristics of the carcinoma, clinical staging, presence of hepatic metastasis and to the prognostic of the patients. In the statistic study were used the Mann-Whitney test, the Kruskal-Wallis test and Fisher’s exact test. The analysis of survival was conducted with the use of the Kaplan-Meier curve and the comparison conclusion between the curves was calculated through the Longrank test. Results: Both markers CD10 and NM23 presented a higher expression on the carcinoma tissue rather than on the non-neoplastic adjacent mucosa (p<0,0001 for both). The expression of the proteins NM23 and CD10 did not present any relation to the degree of cellular differentiation (p=0,57 and p=0,48, respectively) , vascular invasion (p=0,85 and p=0,67, respectively), lymphatic invasion (p=0,41and 0,73, respectively), perineural infiltration (p=0,46 and p=0,24, respectively) and with the staging by the TNM classification (p=0,19). The immunoexpression of CD10 on the colorectal carcinoma tissue was higher (p=0,15) on the exophytic neoplasias than on the non-exophytic tumors. The expression of the proteins NM23 and CD10 did not present any relation with the incidence of lymphonodal metastasis (p=0,08 and 0,30, respectively). The tissue expression of the markers NM23 and CD10 did not relate to the occurrence of hepatic metastasis (p=0,59 and 0,31 respectively). The disease-free survival disclosed a significant relation (p=0,01) with a higher intensity of immunoexpression of the protein NM23 on the colorectal carcinoma’s tissue. However, the same did not occur with the immunoexpression of the protein CD10 (p=0,18). The global survival did not show any relation with the expression of the proteins NM23 and CD10 (p=0,13 and p=0,24, respectively). Conclusions: The neoplastic tissue of the colorectal carcinoma expresses more intensely the proteins NM23 and CD10 than the adjacent nonneoplastic mucosa. The expression of the proteins NM23 and CD10 does not relate to the presence of lymphonodal metastasis, hepatic metastasis, degree of cellular differentiation, colonic or rectal localization of the neoplasia, presence of vascular and/or lymphatic invasion, presence of neural infiltration and the staging of the colorectal carcinoma. The patients with increased immunoexpression of the protein NM23 presented a disease-free survival significantly higher. The intensity of the tissue immunoexpression of the protein CD10 did not influence the disease-free survival. The global survival does not relate to the immunoexpression of the proteins NM23 and CD10. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This work reports the synthesis of a series of 29 new 1-(3-aryl-4,5-dihydroisoxazol-5-yl)methyl-4-trihalomethylpyrimidin-2(1H)-ones which have high pharmacological interest, since they are similar to natural and synthetic nucleosides. These compounds were obtained from 1,3-dippolar cycloaddition reaction between the 1-allyl-(6-aryl)-4-trihalomethylpyrimidin-2(1H)-ones and different benzonitrile oxides, obtained from the selected oximes of general formula ArCH=NOH (where Ar = Ph, 4-FC6H4, 2-MeC6H4, 4-MeC6H4, 2-MeOC6H4, 4-MeOC6H4, styryl, 2-OHC6H4 e 4-OHC6H4). The reaction conditions employed were highly regioselective, because it was observed the formation of only 3,5-substituted isomer by both NMR spectral analysis and X-ray diffractometry. The compounds were obtained in good yields (58 99%) and were purified from recrystallization or by column chromatography on silica gel. Some the obtained compounds showed antineoplastic activity in vitro against different tumor cell lines. Additionally, three new N3-substituted pyrimidinic dideoxynucleoside analogues were prepared, which were obtained in good yields (88 97%) from the reaction of N-allyl-2-methylthiopyrimidin-4(3H)-one and some of the benzonitrile oxides mentioned above. The reactions for the formation of N3-substituted nucleoside still require optimization. This thesis also described the regiochemisty controled synthesis of two series of pyrazoles, named 5(3)-aryl-3(5)-trifluoromethyl-(1H-pyrazol-1-yl)benzenesulfonamides, structural analogues of Celecoxib (14 examples), where aryl = Ph, 4-FC6H4, 4-MeC6H4, 4-MeOC6H4, 4-ClC6H4, 4-BrC6H4, furan-2-yl, from the cyclocondensation reaction between 4-aryl-1,1,1-trifluoromethyl-4-methoxy-3-buten-2-ones and 4-hydrazinobenzenosulfonamide hydrochloride. The isolation of either isomer depended on the initial pH medium, where the alkaline pH favored the isolation of the 1,5-substituted isomer at yields of 73 99% and the reaction conducted in acid pH favored the isolation of the 1,3-substituted isomer, with yields of 77 94%. This study also allowed the isolation and spectroscopic characterization of a novel series of 3-aryl(heteroaryl)-5-hydroxy-5-trifluoromethyl-(1H-pyrazol-1-yl)benzenesulfonamides (7 examples) in yields of 75 97% with interesting anti-inflammatory and antinociceptive activities in vivo. / Esta tese apresenta a síntese de uma série de 29 moléculas inéditas de 1-(3-aril-4,5-diidroisoxazol-5-il)metil-4-trialometilpirimidin-2(1H)-onas que possuem alto interesse farmacológico, visto que são análogos a nucleosídeos naturais e sintéticos. Esses compostos foram obtidos a partir de reação de cicloadição 1,3-dipolar entre as 1-alil-(6-aril)-4-trialometilpirimidin-2(1H)-onas e diferentes óxidos de benzonitrila, obtidos a partir das oximas selecionadas, de fórmula geral ArCH=NOH (onde Ar = Ph, 4-FC6H4, 2-MeC6H4, 4-MeC6H4, 2-MeOC6H4, 4-MeOC6H4, Estiril, 2-OHC6H4 e 4-OHC6H4). As condições reacionais empregadas mostraram-se altamente regiosseletivas, uma vez que, por análise dos espectros de RMN e por difratometria de raios-X, observou-se a formação apenas do isômero 3,5-substituído. Os compostos foram obtidos em bons rendimentos (58 99%) e puderam ser purificados a partir de recristalização ou através de coluna cromatográfica em sílica gel. Alguns dos compostos obtidos apresentaram atividade antineoplásica in vitro frente a diferentes linhagens de células tumorais. Também estão apresentados 3 novos análogos nucleosídeos pirimidínicos N3-substituídos, obtidos em bons rendimentos (88 97%) a partir da reação da N-alil-2-metiltiopirimidin-4(3H)-ona e de alguns óxidos de benzonitrila acima citados. As reações para a formação dos nucleosídeos N3-substituídos ainda necessitam de otimização. Nesta tese também está descrito o controle regioquímico para a síntese de duas séries de pirazóis, nomeados 5(3)-aril-3(5)-trifluormetil-(1H-pirazol-1-il)benzenosulfonamidas, análogos estruturais do Celecoxib (14 exemplos), onde aril = Ph, 4-FC6H4, 4-MeC6H4, 4-MeOC6H4, 4-ClC6H4, 4-BrC6H4, fur-2-il, a partir da reação de ciclocondensação entre 4-aril-1,1,1-trifluormetil-4-metóxi-3-buten-2-onas e o cloridrato de 4-hidrazinilbenzenosulfonamida. O isolamento de um ou outro isômero dependeu do pH inicial do meio, onde o pH básico favoreceu o isolamento do isômero 1,5-substituido com rendimentos de 73 99% e a reação conduzida em pH ácido favoreceu o isolamento do isômero 1,3-substituído, com rendimentos de 77 94%. Este estudo também possibilitou o isolamento e caracterização espectroscópica de uma série inédita de 3-aril(heteroaril)-5-hidróxi-5-trifluormetil-(1H-pirazol-1-il)benzenosulfonamidas (7 exemplos) em rendimentos de 75 97%, com interessante atividade anti-inflamatória e antinociceptiva in vivo.