Proghrelin produces three proghrelin derived peptides (PGDP) known for their roles in glucose homeostasis: acylated ghrelin (AG), unacylated ghrelin (UAG), and obestatin (Ob). Only the receptor for AG, growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS R1a), is known, however there is evidence for additional receptors for AG, UAG and Ob. Our aim was to determine the actions of PGDP on two beta cell lines, MIN6 and INS-1, which we have shown to contain and lack GHS R1a respectively. PGDP increased proliferation in INS-1 but not MIN6 cells, measured by BrdU incorporation. AG decreased apopotosis in both cell lines, measured by decreased levels of activated caspase 3. Insulin secretion was investigated in INS-1 cells, where PGDP modulated insulin release in a glucose dependent manner. Our results indicate that PGDP modulate beta cell mass in the presence and absence of GHS R1a, and present a detailed anaylsis of insulin secretion in INS-1 cells.

In den nächsten Jahren wird weltweit ein starker Anstieg des Anteils Übergewichtiger an der Bevölkerung zu verzeichnen sein. Daraus resultiert auch ein Anstieg der Adipositas assoziierten Krankheiten und der damit verbundenen medizinischen und volkswirtschaftlichen Konsequenzen. Im Hinblick darauf sind Untersuchungen zur Klärung der Regulation des Körpergewichtes und der Entstehung von Übergewicht von grundlegender Bedeutung. Die vorliegende Promotionsarbeit liefert einen Beitrag zur Erforschung dieser Regulationsmechanismen des Körpergewichts, die aus einem komplexen Netzwerk hormoneller Signalwege bestehen. Dem Peptidhormon Obestatin, das wahrscheinlich an den Rezeptor GPR39 bindet, wurde eine gewichtsreduzierende Wirkung zugeschrieben. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die Wirkungsweise dieses Hormons in Bezug auf die Proliferation und die Differenzierung im (Prä-)Adipozytenmodell 3T3-L1 näher zu untersuchen. Der Einfluss von Obestatin in Abhängigkeit von seiner Konzentration auf diese murinen, embryonalen Zellen wurde zum einen mittels colorimetrischem Proliferationstest untersucht. Zum anderen wurde die Aktivität der MAP-Kinase ERK1/2, Schlüsselenym der Zellproliferation und Zelldifferenzierung, während der Proliferation mittels in situ ELISA und SDS-Page/Western Blot bestimmt. Der Einfluss von Obestatin auf die Differenzierung der 3T3-L1 Zellen wurde anhand ihres Differenzierungsgrad mit Hilfe des lipophilen Farbstoffes AdipoRed evaluiert. Darüberhinaus erfolgte mittels quantitativer PCR die Bestimmung der Expression des Obestatinrezeptor-Gens GPR39 in humanem Fettgewebe. Ausgehend von der Annahme, dass durch eine autogene Regulation die Rezeptorenanzahl in Abhängigkeit vom Körpergewicht variiert wird, wurde der statistische Zusammenhang zwischen der Expression des hGPR39-Rezeptor-Gens und dem Alter bzw. Body-Mass-Index von Patienten untersucht, denen Proben von viszeralem oder subkutanem Fett entnommen wurden. In Zusammenschau aller Versuchsergebnisse, die in dieser Dissertationsarbeit erzielt wurden, kann davon ausgegangen werden, dass das hier verwendete Obestatin insgesamt keinen Effekt auf das Adipozytenmodell 3T3-L1 besitzt, weil ein Substrat verwendet wurde, das wohl eine zu geringe Konzentration des Hormons Obestatin enthielt. Durch neue Forschungsergebnisse anderer Arbeitsgruppen muss vermutet werden, dass der tatsächliche Anteil von Obestatin in nicht speziell aufbereiteten Substraten zu gering ist, um mit den angewendeten Nachweisverfahren signifikante Effekte zu erzielen. Bei den Untersuchungen eines Zusammenhangs zwischen der Expression des hGPR39-Gens und dem BMI wurden die Ergebnisse der 12 Proben mithilfe der univarianten Varianzanalyse (SPSS) statistisch geprüft. Ohne Beachtung eines Ausreißer-Messwertes konnte dabei ein nahezu signifikanter, positiv linearer Zusammenhang zwischen der normierten Kopienzahl des Rezeptor-Gens und dem BMI gezeigt werden. Sollte durch zusätzliche Experimente dieser Zusammenhang Signifikanz erlangen, schiene es denkbar, dass Obestatin nicht – wie bisher angenommen – eine Verminderung der Gewichtszunahme bewirkt, sondern möglicherweise den adipösen Phänotyp und die damit verbundenen Begleit- und Folgekrankheiten befördert.

Ghrelin is a gut peptide produced by mainly stomach that induces appetite stimulatory actions. Obestatin is peptide derived from preproghrelin and was initially described to antagonize stimulatory effect of ghrelin on food intake. This work was undertaken to investigate the influence of postprandial status on plasma ghrelin and obestatin concentrations in patients with bulimia nervosa and healthy women. After overnight fasting, plasma ghrelin and obestatin were measured before and after consumption of soluble fiber alone or with glucose. I observed greater decrease of plasma ghrelin and obestatin after consumption of soluble fiber with glucose. I conclude that postprandial plasma ghrelin and obestatin levels are influenced by caloric content of the meal and depend on eating behavior.

This study was to determine (1) if genetic selection for high (HWS) or low (LWS) body weight in chickens has altered the hypothalamic AMP-activated protein kinase (AMPK) system and (2) if this alteration contributes to the dissimilar feeding response to various appetite modulators between HWS and LWS lines. Compared to HWS, LWS chickens had higher levels of AMPK α and acetyl-CoA carboxylase (ACC) phosphorylation, which was caused by upregulation of the upstream factor calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2 (CAMKK β). There was greater mRNA expression of carnitine palmitoyltransferase I (CPT1), leptin receptor (LEPR) and neuropeptide Y (NPY) and less mRNA expression of ACC α, fatty acid synthase (FAS), fat mass and obesity associated gene (FTO), pro-opiomelanocortin (POMC) and orexin in LWS than HWS chickens. At 5 days of age, intracerebroventricular (ICV) injection of AICAR, 5-amino- 4-imidazolecarboxamide riboside, caused a quadratic dose-dependent decrease in food intake in LWS but not HWS chicks. Compound C, (6-(4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)-phenyl))-3-pyridin-4-yl-pyrazolo(1,5-a)-pyrimidine, caused a quadratic dose-dependent increase in food intake in HWS but not LWS chicks. The anorexigenic effect of AICAR in LWS chicks and orexigenic effect of Compound C in HWS chicks resulted from either activation or inhibition of other kinase pathways separate from AMPK. There is a lower threshold for the anorexigenic effect of ghrelin in LWS than HWS chicks, which was associated with differential hypothalamic AMPK signaling. ICV injection of ghrelin inhibited corticotrophin-releasing hormone (CRH), 20-hydroxysteroid dehydrogenase (20HSD), glucocorticoid receptor (GR), CPT1 and FTO expression in LWS but not HWS chicks. Additionally, the hypothalamic mRNA level of ghrelin was significantly higher in LWS than HWS chicks, which may also contribute to the differential threshold response to ghrelin in these two lines. Obestatin caused a linear dose-dependent increase in food intake in HWS but not LWS chicks. The orexigenic effect of obestatin in HWS chicks was not associated with altered AMPK. Obestatin inhibited LEPR and FTO expression in HWS but not LWS chicks. Thus, selection for body weight may alter the hypothalamic response to ghrelin by the AMPK pathway, CRH pathway, CPT1 and FTO, and to obestatin by LEPR and FTO. / Ph. D.

In den nächsten Jahren wird weltweit ein starker Anstieg des Anteils Übergewichtiger an der Bevölkerung zu verzeichnen sein. Daraus resultiert auch ein Anstieg der Adipositas assoziierten Krankheiten und der damit verbundenen medizinischen und volkswirtschaftlichen Konsequenzen. Im Hinblick darauf sind Untersuchungen zur Klärung der Regulation des Körpergewichtes und der Entstehung von Übergewicht von grundlegender Bedeutung. Die vorliegende Promotionsarbeit liefert einen Beitrag zur Erforschung dieser Regulationsmechanismen des Körpergewichts, die aus einem komplexen Netzwerk hormoneller Signalwege bestehen. Dem Peptidhormon Obestatin, das wahrscheinlich an den Rezeptor GPR39 bindet, wurde eine gewichtsreduzierende Wirkung zugeschrieben. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die Wirkungsweise dieses Hormons in Bezug auf die Proliferation und die Differenzierung im (Prä-)Adipozytenmodell 3T3-L1 näher zu untersuchen. Der Einfluss von Obestatin in Abhängigkeit von seiner Konzentration auf diese murinen, embryonalen Zellen wurde zum einen mittels colorimetrischem Proliferationstest untersucht. Zum anderen wurde die Aktivität der MAP-Kinase ERK1/2, Schlüsselenym der Zellproliferation und Zelldifferenzierung, während der Proliferation mittels in situ ELISA und SDS-Page/Western Blot bestimmt. Der Einfluss von Obestatin auf die Differenzierung der 3T3-L1 Zellen wurde anhand ihres Differenzierungsgrad mit Hilfe des lipophilen Farbstoffes AdipoRed evaluiert. Darüberhinaus erfolgte mittels quantitativer PCR die Bestimmung der Expression des Obestatinrezeptor-Gens GPR39 in humanem Fettgewebe. Ausgehend von der Annahme, dass durch eine autogene Regulation die Rezeptorenanzahl in Abhängigkeit vom Körpergewicht variiert wird, wurde der statistische Zusammenhang zwischen der Expression des hGPR39-Rezeptor-Gens und dem Alter bzw. Body-Mass-Index von Patienten untersucht, denen Proben von viszeralem oder subkutanem Fett entnommen wurden. In Zusammenschau aller Versuchsergebnisse, die in dieser Dissertationsarbeit erzielt wurden, kann davon ausgegangen werden, dass das hier verwendete Obestatin insgesamt keinen Effekt auf das Adipozytenmodell 3T3-L1 besitzt, weil ein Substrat verwendet wurde, das wohl eine zu geringe Konzentration des Hormons Obestatin enthielt. Durch neue Forschungsergebnisse anderer Arbeitsgruppen muss vermutet werden, dass der tatsächliche Anteil von Obestatin in nicht speziell aufbereiteten Substraten zu gering ist, um mit den angewendeten Nachweisverfahren signifikante Effekte zu erzielen. Bei den Untersuchungen eines Zusammenhangs zwischen der Expression des hGPR39-Gens und dem BMI wurden die Ergebnisse der 12 Proben mithilfe der univarianten Varianzanalyse (SPSS) statistisch geprüft. Ohne Beachtung eines Ausreißer-Messwertes konnte dabei ein nahezu signifikanter, positiv linearer Zusammenhang zwischen der normierten Kopienzahl des Rezeptor-Gens und dem BMI gezeigt werden. Sollte durch zusätzliche Experimente dieser Zusammenhang Signifikanz erlangen, schiene es denkbar, dass Obestatin nicht – wie bisher angenommen – eine Verminderung der Gewichtszunahme bewirkt, sondern möglicherweise den adipösen Phänotyp und die damit verbundenen Begleit- und Folgekrankheiten befördert.

<p>Enterochromaffin-like (ECL) and ghrelin cells, in the human gastric mucosa and in gastric endocrine tumours (GETs), were subclassified with respect to immunohistochemical reaction <i>vs.</i> vesicular monoamine transporter 2 (VMAT-2), ghrelin/obestatin, and histidine decarboxylase (HDC). The immunohistochemical expression of ghrelin/obestatin and HDC in GETs was related/correlated to plasma ghrelin/obestatin and urinary methyl imidazole acetic acid (U-MeImAA) excretion respectively, with the intention of identifying markers for these tumour types. </p><p>ECL cells in the gastric mucosa appear either with VMAT-2 only, or with HDC immunoreactivity only, or they can express both proteins; but in GETs the transporter protein and the enzyme were almost always co-expressed in the same cells. Furthermore, ghrelin and obestatin were co-localized in the same cells in the gastric mucosa and in the tumours. In the gastric mucosa, occasional ghrelin/obestatin cells expressed VMAT-2, but in GETs these proteins were always co-localized. Ghrelin expressing cells were non-immunoreactive to HDC. Plasma ghrelin/obestatin concentrations remained low in patients with GETs, irrespective of the relative incidence of these cells in the mucosa and in tumours. The plasma values were not related/correlated to various clinico-pathological parameters. A malignant ghrelinoma was however an exception. The tumour released high total and active ghrelin concentrations into the blood circulation. The patient suffered from diarrhoea, hypothyroidism and diabetes mellitus, but it is not clear if these conditions were due to hyperghrelinaemia. The excretion U-MeImAA was increased in a few patients with GETs, but this increase was not always related to clinical symptoms.</p><p>In conclusion, ECL cells are an heterogeneous group according to VMAT-2 and HDC immunoreactivity. Ghrelin and obestatin are expressed in the same cells in the gastric mucosa, and a few of these cells display VMAT-2 immunoreactivity. Ghrelinoma is a new gastric tumour entity.</p>

Enterochromaffin-like (ECL) and ghrelin cells, in the human gastric mucosa and in gastric endocrine tumours (GETs), were subclassified with respect to immunohistochemical reaction vs. vesicular monoamine transporter 2 (VMAT-2), ghrelin/obestatin, and histidine decarboxylase (HDC). The immunohistochemical expression of ghrelin/obestatin and HDC in GETs was related/correlated to plasma ghrelin/obestatin and urinary methyl imidazole acetic acid (U-MeImAA) excretion respectively, with the intention of identifying markers for these tumour types. ECL cells in the gastric mucosa appear either with VMAT-2 only, or with HDC immunoreactivity only, or they can express both proteins; but in GETs the transporter protein and the enzyme were almost always co-expressed in the same cells. Furthermore, ghrelin and obestatin were co-localized in the same cells in the gastric mucosa and in the tumours. In the gastric mucosa, occasional ghrelin/obestatin cells expressed VMAT-2, but in GETs these proteins were always co-localized. Ghrelin expressing cells were non-immunoreactive to HDC. Plasma ghrelin/obestatin concentrations remained low in patients with GETs, irrespective of the relative incidence of these cells in the mucosa and in tumours. The plasma values were not related/correlated to various clinico-pathological parameters. A malignant ghrelinoma was however an exception. The tumour released high total and active ghrelin concentrations into the blood circulation. The patient suffered from diarrhoea, hypothyroidism and diabetes mellitus, but it is not clear if these conditions were due to hyperghrelinaemia. The excretion U-MeImAA was increased in a few patients with GETs, but this increase was not always related to clinical symptoms. In conclusion, ECL cells are an heterogeneous group according to VMAT-2 and HDC immunoreactivity. Ghrelin and obestatin are expressed in the same cells in the gastric mucosa, and a few of these cells display VMAT-2 immunoreactivity. Ghrelinoma is a new gastric tumour entity.

The aim of this thesis was to characterize the expression of the peptides ghrelin and obestatin, as well as other neuroendocrine markers in human normal tissues, in invasive breast cancer and a wide panel of neuroendocrine tumors (NETs). In normal tissues the expression of ghrelin and obestatin was mainly localized to the gastric mucosa, and in lesser extent in the remaining gastrointestinal tract, endocrine pancreas and mammary glands. Double immunofluorescence studies demonstrated that ghrelin and obestatin were co-localized in the same cells displaying the same cytoplasmic distribution. In normal breast tissue, ghrelin, obestatin, adrenomedullin, apelin and vesicular monoamine transporter 2 were specifically demonstrated in the luminal epithelial cells. Consecutive sections indicated that mammary epithelial cells could express several of these peptides. Secretogranin II and III were also detected in breast tissue, but their presence was restricted to the outer layer of myoepithelial cells, whereas chromogranin B immunoreactivity was found in both the epithelial and myoepithelial cells. Ghrelin and obestatin immunoreactivity was seen in invasive breast cancer, where the expression could be correlated to factors associated with prognosis. Furthermore, multivariate analysis indicated that ghrelin expression was a possible independent prognostic factor for prolonged recurrence-free and breast cancer-specific survival. In a panel of NETs and endocrine-related disorders it was revealed that ghrelin and obestatin immunoreactivity was primarily found in tumors originating from the respective normal tissues. The two proteins were detected in only a few cases and only occasional tumor cells were immunoreactive. In conclusion, ghrelin and obestatin are localized in the gastrointestinal tract, endocrine pancreas and mammary glands. This thesis has contributed to our understanding of the distribution of ghrelin and obestatin in both normal tissue and tumor cells. A potential role of ghrelin as a prognostic factor in invasive breast cancer has been identified and should be further explored.

La première cause de maigreur chez les femmes dans les pays occidentaux est l’anorexie mentale (AM). La maigreur constitutionnelle (MC) regroupe des femmes d’Indice de masse corporelle identique aux AM mais sans les anomalies psychologiques, biologiques ou hormonales (pas d’aménorrhée) rencontrées dans l’AM. Les troubles du comportement alimentaire (TCA) comprennent l’AM restrictive pure (AM-R), l’AM avec crises boulimiques (AM-BP) et la boulimie nerveuse (BN). Notre travail explore ces troubles à la lumière de la régulation de l’appétit dont le centre organique (noyau arqué) reçoit des afférences de peptides périphériques tels que la leptine, le PYY, le GLP1 , la ghréline et l’obéstatine. Nous montrons un profil orexigène dans l’AM-R, témoignant d’une intégrité du système de régulation de la prise alimentaire et adaptatif, luttant contre la restriction alimentaire. Nous avançons le concept de ghrélino-résistance dans l’AM-R dont le substratum biologique est peut-être l’obéstatine. Nous montrons une ghréline basse chez les AM-BP comme chez les BN permettant un diagnostic différentiel précis et rapide. A l’inverse, nous montrons un profil anorexigène constitutif chez les MC participant au maintien du poids bas, proposant la MC comme un modèle humain de résistance à la prise de poids. Ces hormones peuvent agir comme arbitre organique objectif entre des entités cliniques parfois à tort confondues. Une leptine basse chez une jeune fille maigre signe une AM, une ghréline basse chez une AM signe la présence de crises boulimiques. Ces éléments forts nous poussent à continuer notre travail de précision et de phénotypage de ces entités pour mieux en comprendre la physiopathologie / The commonest group of underweight young women in the developed world is restrictive anorexia nervosa (AN). However, constitutional thinness (CT) is a condition described in the same low weight range as AN. CT women display normal menstruation an do not present with psychological or hormonal features of AN. Eating disorders (EA) displays Anorexia Nervosa with restrictive food behaviour (AN-R), Anorexia Nervosa with binge purge associated (AN-BP) and bulimia Nervosa (BN ). Food intake is controlled by the arcuate nucleus through integration of peripheral hormonal signals such as leptin, ghrelin, peptide YY (PYY) and glucagon like peptide 1 (GLP-1). Our objective was to understand thinness and EA through those hormonal signals. AN-R presents an orexigenic adaptative profile contrasting with the anorexigenic constitutive one in CT, proving the integrity of the appetite regulation system. We propose the ghrelin resistance concept with the putative obestatin. AN-BP presents a very different profile of appetite regulatory peptides when compared with AN-R, with low ghrelin levels. The hormones appear to be valuable biomarkers to distinguish AN and CT in severe underweight patients and to diagnose binge purge in AN. The assessment of ghrelin (and eventually obestatin) could be of particular interest for differential diagnosis between AN-R and AN-BP. The assessment of leptin could also be useful for differential diagnosis between AN and CT