Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'identité et la réactivité cellulaires sont établies, maintenues et modulées grâce à l'orchestration de programmes transcriptionnels spécifiques. Les éléments régulateurs, des régions particulières de la chromatine responsables de l'activation ou de la répression des gènes, sont au coeur de cette opération. Ces dernières années, de nombreuses études ont révélé le rôle central des « enhancers » dans ce processus. En effet, des centaines de milliers « enhancers » seraient éparpillés dans le génome humain, majoritairement dans sa portion non-codante, et contrairement au promoteur, leur activation varierait selon le type ou l'état cellulaire ou en réponse à une stimulation physiologique, pathologique ou environnementale. Les « enhancers » sont, en quelque sorte, des carrefours où transitent une multitude de protéines régulées par les signaux intra- et extra-cellulaires et un dialogue s'établit entre ces diverses protéines et la chromatine. L'identification des « enhancers ainsi qu'une compréhension de leur mode de fonctionnement sont donc cruciales, tant au plan fondamental que clinique. La chromatine joue un rôle indéniable dans l'activité des éléments régulateurs, tant par sa composition que par sa structure, en régulant, entre autres, l'accessibilité de l'ADN. En effet, l'ADN des régions régulatrices est bien souvent masqué par un nucléosome occlusif, lequel doit être déplacé ou évincé afin de permettre la liaison des protéines régulatrices, notamment les facteurs de transcription (FTs). Toutefois, la contribution de la composition de la chromatine à ce processus reste incomprise. Le variant d'histone H2A.Z a été identifié comme une composante de la chromatine aux régions accessibles, dont des « enhancers » potentiels. Toutefois son rôle y est inconnu, bien que des études récentes suggèrent qu'il pourrait jouer un rôle important dans la structure de la chromatine à ces régions. Par ailleurs, un lien étroit existe entre H2A.Z et la voie de signalisation des oestrogènes (notamment la 17-[beta]-estradiol (E2)). Ainsi, H2A.Z est essentiel à l'expression de plusieurs gènes cibles de l'E2. Les effets de l'E2 sont en partie exercés par un FT, le récepteur alpha des oestrogènes (ER[alpha]), lequel se lie à l'ADN suite à son activation, et ce majoritairement à des « enhancers », et permet l'établissement d'un programme transcriptionnel spécifique. Cette thèse vise à définir le rôle d'H2A.Z aux « enhancers », et plus particulièrement son influence sur l'organisation des nucléosomes aux « enhancers » liés par ER[alpha]. D'abord, mes travaux effectués à l'échelle du génome ont démontré qu'H2A.Z n'est présent qu'à certains ER[alpha]-« enhancers » actifs. Cette particularité a fait en sorte que nous avons pu comparer directement les « enhancers » actifs occupés par H2A.Z à ceux non-occupés, afin de mettre en évidence sa relation à l'environnement chromatinien. Étonnamment, il est apparu qu'H2A.Z n'introduit pas une organisation unique ou particulière des nucléosomes aux « enhancers ». Par ailleurs, nos résultats montrent qu'H2A.Z joue un rôle crucial dans la régulation de l'activité des « enhancers ». En effet, nous avons observé que suite à leur activation par l'E2, les « enhancers » occupés par H2A.Z recrutent l'ARN polymérase II (ARNPII) et produisent un transcrit. Ils recrutent également RAD21, une composante du complexe cohésine impliqué, entre autres, dans des interactions chromosomiques entre « enhancers » et promoteurs. De façon intéressante, nous avons mis en évidence que ces trois évènements, connus pour leur importance dans l'activité des « enhancers », sont dépendants d'H2A.Z. Ainsi, la présence d'H2A.Z à l' « enhancer » pourrait permettre un environnement chromatinien favorable à trois aspects clés de l'activité des « enhancers » : la présence de l'ARNPII, la transcription et la formation d'une boucle d'interaction, et par la suite, de par la proximité « enhancer »-promoteur ainsi créée, augmenter la concentration d'ARNPII à proximité du promoteur favorisant l'expression du gène cible. Un tel rôle central d'H2A.Z dans l'activité d' « enhancers » spécifiques pourrait participer à un mécanisme épigénétique ciblé de la régulation de l'expression des gènes.

Le cancer du sein reste la principale cause de décès par cancer chez les femmes et est connu pour la divergence des comportements cliniques et des résultats pour les patientes, malgré les caractéristiques histopathologiques courantes au moment du diagnostic. Cela s'explique par la grande hétérogénéité histologique et moléculaire de la maladie, qui rend difficile le choix d'une thérapie adaptée à chaque patient.L'épigénétique se rapporte aux modifications du phénotype et de l'expression génique. Les modifications épigénétiques du génome peuvent être acquises de novo et sont potentiellement héritées. Les mécanismes épigénétiques agissent pour modifier l'accessibilité de la chromatine à la régulation de la transcription localement et globalement via des modifications de l'ADN et par des modifications ou des réarrangements de nucléosomes. L'épigénétique consiste en plusieurs mécanismes moléculaires: modifications de l'histone, petits ARN non codants ou anti-sens et méthylation de l'ADN étroitement interconnectés.L'incidence et la mortalité par cancer du sein sont plus élevées (incidence environ trois fois supérieure) dans le monde occidental que dans les pays d'Asie avec des différences régionales dans les pays occidentaux. Plusieurs études impliquant des immigrés des pays occidentaux suggèrent que le mode de vie et l'alimentation sont deux des causes principales de ces différences. Un apport alimentaire élevé en phytoestrogènes, principalement sous forme de produits à base de soja, peut produire des taux circulants de phytoestrogènes à effets œstrogéniques. Des études épidémiologiques et expérimentales suggèrent qu'un régime alimentaire riche en phytoestrogènes pouvait avoir des effets protecteurs contre sur les affections liées aux œstrogènes, telles que le cancer du sein.Sur la base de ces informations, nous avons étudié les effets du traitement par les phytoestrogènes; génistéine, daidzéine et 17-β-estradiol sur la modification post-traductionnelle des histones, telles que la méthylation de la lysine et l’acétylation des histones H3 et H4 dans des lignées cellulaires du cancer du sein. Nous avons ensuite étudié les effets de l'inhibiteur de la méthylation de l'histone et de l'inhibiteur de l'histone désacétylase sur la triméthylation et l'acétylation de l'histone-lysine dans les lignées cellulaires du cancer du sein. Nous avons utilisé deux lignées cellulaires de cancer du sein, MCF-7 et MDA-MB-231, chacune traitée respectivement avec de l'hydrochlorure de 3-désazanule (DZNep) [5 µM] (HMTi), du butyrate de sodium (NaBu) [2 mM] (HDACi) et de l'acide de type Suberoylanilide Hydroxamic (SAHA) [1 µM] (HDACi). Enfin, nous avons mené des études sur toutes les lignées cellulaires atteintes de tumeurs du sein afin d'évaluer l'immunoprécipitation de la chromatine (PIP) de certaines modifications de l'histone dans le cancer. Les niveaux relatifs de trois histones modifiées, y compris H3K27me3 (histone 3 Lysine 27 méthylation), H3K9ac (Histone 3 Lysine 9 acétylation) et H3K4ac (Histone 3 Lysine 4 acétylation) seront déterminés dans les tumeurs du sein par rapport au tissu normal correspondant selon le classement de Saint-Gall. Aujourd'hui, ChIP a été couplé à des puces à ADN de promoteur afin d'évaluer les mécanismes de régulation du gène humain à l'échelle du génome. La technologie de la puce sur puce pourrait être utilisée pour étudier les altérations de l'expression globale des gènes dans la tumorigenèse. Ici, nous avons étudié les gènes exprimés de manière différentielle associés aux histones modifiées H3K27me3, H3K9ac et H3K4ac dans les tumeurs du sein à l'aide de microréseaux Agilent SurePrint G3 400kX2 contenant environ 21 000 transcrits humains. Nous analyserons les régions enrichies de chaque promoteur de gène dans trente tumeurs du sein par rapport à des échantillons de tissus normaux. Les échantillons de tumeurs du sein seront classés en fonction de leur profil clinique, en particulier du statut des récepteurs hormonaux. / Breast cancer remains the leading cause of cancer-related deaths in women, and is noted for conflicting clinical behaviors and patient outcomes, despite common histopathological features at diagnosis. This can be explained by the high histological and molecular heterogeneity of the disease, making it hard to choose a therapy adapted uniquely to each patient. Epigenetics refer to changes in phenotype and gene expression. Epigenetic modifications of the genome can be acquired de novo and are potentially inherited. Epigenetic mechanisms work to change the accessibility of chromatin to transcriptional regulation locally and globally via modifications of the DNA and by modifications or rearrangements of nucleosomes. Epigenetics consist in several molecular mechanisms: histone modifications, small non-coding or antisense RNAs and DNA methylation that are closely interconnected. The incidence and mortality of breast cancer is high in the Western world as compared with countries in Asia. There are also differences in the regional cancer incidence rates in Western countries. Several studies involving immigrants to Western countries suggest that lifestyle and diet are two of the main causes of these differences. In Eastern countries, the incidence of breast cancer is approximately one-third that of Western countries, whilst their high dietary intake of phytoestrogens, mainly in the form of soy products, can produce circulating levels of phytoestrogens that are known experimentally to have estrogenic effects. An increasing number of epidemiological and experimental studies have suggested that the consumption of a 4 phytoestrogen-rich diet may have protective effects on estrogen-related conditions, such as breast cancer.Based upon this information, we studied the effects of treatment phytoestrogens; genistein, daidzein and 17-β-estradiol on the post-translational modification of histones such as lysine methylation and acetylation of histones H3 and H4 in breast cancer cell lines. Subsequently, we studied the effects of histone methylation inhibitor and histone deacetylase inhibitor on histone lysine trimethylation and acetylation in breast cancer cell lines. For this study, we used two breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231. Each cell line was treated respectively with 3-Deazaneplanocin A hydrochloride (DZNep) [5 μM] (HMTi), Sodium Butyrate (NaBu) [2 mM] (HDACi) and Suberoylanilide Hydroxamic acid (SAHA) [1 μM] (HDACi) for 48 hours. Finally, we completed studies in all cell lines with breast tumors to assess Chromatin ImmunoPrecipitation (ChIP) of selected histone modifications in cancer. The relative levels of three modified histones, including H3K27me3 (Histone 3 Lysine 27 Methylation), H3K9ac (Histone 3 Lysine 9 Acetylation), and H3K4ac (Histone 3 Lysine 4 Acetylation) will be determined in breast tumors compared to matched normal tissue according to the classification of Saint Gallen. Today, ChIP has been coupled with promoter DNA microarrays to evaluate the mechanisms of human gene regulation on a genome-wide scale. ChIP-on-chip technology could be used to investigate the alterations of global gene expression in tumorigenesis. Here, we investigated differentially expressed genes associated with modified histones H3K27me3, H3K9ac and H3K4ac in breast tumors by Agilent SurePrint G3 400kX2 microarrays containing approximately 21,000 of human transcripts. We will scan the enriched regions at each gene promoter in thirty breast tumors compared with normal tissue samples. Breast tumor samples will be classified according to their clinical profiles, especially hormone receptor status.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie autoimmune médiée par les cellules T caractérisée par l'infiltration de leucocytes inflammatoires dans le système nerveux central (SNC) aboutissant à la destruction de la gaine de myéline. Des rémissions cliniques sont fréquemment observées lors de la grossesse chez des patientes atteintes de SEP suggérant que les hormones, particulièrement les œstrogènes, pourraient jouer un rôle protecteur. En effet, l'administration d'œstrogènes (17beta-œstradiol, E2) inhibe l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris, le modèle animal de la SEP. Par l'utilisation de souris KO conditionnelles pour REalpha dans différentes cellules du système immunitaire, notre équipe a précédemment montré que l'inhibition de l'EAE par l'E2 était associée à une suppression de l'activation des cellules Th1 et Th17 encéphalitogènes et que cet effet était dépendant de l'expression de RE? dans les lymphocytes T. Les objectifs de ma thèse ont été d'identifier les cellules T impliquées dans l'effet protecteur de l'E2 dans l'EAE et de disséquer les mécanismes sous-jacents. Nous avons mis en évidence que de fortes doses d'E2 in vivo inhibait sélectivement la différenciation des cellules T 2D2, possédant un TCR spécifique du peptide MOG, en lymphocytes Th1 et Th17 suite à leur transfert chez des souris receveuses. En utilisant des cellules T 2D2 déficientes pour REalpha, nous avons pu mettre en évidence que l'expression de REalpha par les cellules T CD4+ spécifiques de MOG n'était pas nécessaire à l'action inhibitrice de l'E2. Ces résultats suggéraient que l'activation intrinsèque de la voie de signalisation E2/RE? dans les cellules T spécifiques de l'antigène n'avait pas d'impact sur leur différenciation en cellules T effectrices. Nous avons confirmé ces résultats par des expériences effectuées in vitro, montrant que la sensibilisation des cellules T naïves à l'E2 in vivo et in vitro n'affectait pas leur capacité à se différencier en cellules Th1, Th2, Th17 ou Treg. De plus, nous avons mis en évidence que l'E2 via REalpha agissait sur les cellules T CD4+ endogènes pour inhiber le développement des réponses Th1 et Th17 inflammatoires par un mécanisme de suppression en trans. Ensuite, nous avons montré par un modèle de transfert adoptif que les cellules T REalpha+/+, mais pas REalphaKO, sensibilisées à l'E2 conféraient une protection contre l'EAE lorsqu'elles étaient transférées avec les cellules T 2D2 naïves REalphaKO dans des souris receveuses Rag2KO REalphaKO immunisées avec MOG. De plus, en utilisant des souris déficientes pour RE? sélectivement dans les Treg Foxp3+, nous avons démontré que l'action protectrice des cellules T CD4+ bystander sensibilisées à l'E2 était non seulement maintenue mais augmentée en comparaison aux cellules contrôles exprimant RE?. Ces résultats ont donc permis de mettre en évidence que l'E2 agissait sur les cellules T CD4+ Foxp3neg pour restreindre la différenciation des cellules T encéphalitogènes en lymphocytes Th17 en trans et ainsi inhiber le développement de l'EAE. / Multiple sclerosis (MS) is a T-cell mediated autoimmune disease characterized by the inflammatory leukocytes infiltration into central nervous system (CNS) resulting in myelin damages. Clinical remissions in MS patients are frequently observed during pregnancy suggesting that steroid hormones, particularly estrogens, could be protective. Indeed, administration of estrogens (17beta-œstradiol, E2) inhibits experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice, the animal model of MS. Using ERalpha conditional KO mice, our group has shown previously that E2-mediated inhibition of EAE was associated with suppression of encephalitogenic Th1 and Th17 cell activation and that this effect required ERalpha expression in T cells. The objectives of my thesis aimed to identify the T cells implicated in E2 protective effect on EAE and to dissect the underlying mechanisms. We highlighted that pharmacological doses of E2 in vivo selectively inhibited MOG specific TCR 2D2 T cells differentiation into Th1 and Th17 lymphocytes following their transfer into recipient mice. Using ERalpha deficient 2D2 T cells, we have showed that ERalpha expression in MOG specific CD4+ T cells was not required for the E2 inhibitory action. These results suggested that intrinsic activation of E2/ERalpha signaling in antigen specific T cells didn't impact their differentiation into effector T cells. We confirmed these results by in vitro experiment, showing that in vitro and in vivo E2 treatment of naïve T cells didn't affect their differentiation capacity into Th1, Th2, Th17 or iTreg cells. Moreover, we highlighted that E2 acted through ER? in endogenous CD4+ T cells to inhibit inflammatory Th1 and Th17 responses by a suppressive mechanism in trans. Then, we have shown using an adoptive transfer model that E2 primed ER?+/+, but not ERalphaKO, CD4+ T cells conferred substantial protection against EAE when transferred together with 2D2 ERalphaKO transgenic T cells into naïve RagKO recipients lacking ERalpha prior to MOG immunization. Futhermore, using mice selectively lacking ERalpha in Foxp3+ Treg, we have demonstrated that E2-primed CD4+ T cell protective action was not only maintained but increased in comparison to ERalpha+/+ T cells. These results allowed us to conclude that E2 acts on CD4+ Foxp3neg T cells to restrict encephalitogenic Th17 cell differentiation in trans and inhibit EAE development.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le cancer de la prostate est une pathologie impliquant des facteurs divers comme l'hérédité, l'appartenance ethnique mais aussi des facteurs environnementaux. En effet, il a été démontré que certains micronutriments dont les phyto-oestrogènes contenus dans l'alimentation pouvaient avoir un rôle protecteur vis-à-vis de cette pathologie. Ces molécules seraient capables de moduler les mécanismes épigénétiques observés dans le cancer de la prostate. L'objectif de ce travail a été de déterminer si les phyto-oestrogènes du soja pouvaient induire la réversion de la méthylation d'oncosuppresseurs impliqués dans la cancérogenèse prostatique et par quelles voies moléculaires. Nos études, in vitro, réalisées sur des lignées continues de cancer de la prostate (DU-145, PC-3 et LNCaP) ont montré dans un premier temps, une diminution de la méthylation des gènes GSTP1, RASSF1A, EPHB2 et BRCA1 et une augmentation des protéines correspondantes, suite au traitement par la génistéine (40μM) et la daidzéine (110μM) pendant 48H. Dans un deuxième temps, une étude comparative entre l'effet des phyto-oestrogènes et l'oestradiol sur la méthylation de l'ADN d'un panel de 24 gènes a permis de mettre en évidence une régulation des mécanismes épigénétiques par les phyto-oestrogènes via la voie des Récepteurs aux oestrogènes. En conclusion, les phyto-oestrogènes agissent sur les mécanismes épigénétiques dans la cancérogenèse prostatique laissant supposer que ces molécules pourraient jouer un rôle préventif dans cette pathologie. / Prostate cancer is a disease caused by a multiple interacting factors such as family history of prostate cancer, age and ethnic origin. Environnemental factors play also a role in prostatic carcinogenesis events. Indeed, several studies have reported the efficiency of nutrients such as phytoestrogens to possess anticancer properties. It has been reported that these compounds may have the ability to induce the reversion of epigenetic modifications observed in prostate cancer cells. The aim of this work was to determine if soy isoflavone could reverse the DNA methylation of oncosuppressor which are hypermethylated in prostate cancer and through which metabolic pathways. Our in vitro studies were carried out on tree prostate cancer cell lines: DU-145, PC-3 and LNCaP. The qualitative and quantitative studies performed demonstrated a decrease of methylation percentage of GSTP1, RASSF1A, EPHB2 and BRCA1 after soy isoflavone treatment. In a second step, a comparative study between the effect of phytoestrogens and estradiol on the DNA methylation of a panel of 24 genes was performed. Our results has highlighted that the regulation of epigenetic mechanisms by phytoestrogens may be mediated via the estrogen receptor pathway. In conclusion, phytoestrogen act on epigenetics mechanisms on prostate carcinogenesis suggesting that these molecules may play a role in the prevention of this pathology.

Le cancer de la prostate est le plus fréquent et représente la troisième cause de mortalité par cancer chez l’homme en France. Outre la théorie de la génétique dans le développement des cancers, l’implication des modifications épigénétiques au cours de la carcinogenèse prostatique ne fait plus aucun doute. L’épigénétique est définie comme l’étude des modifications de l’expression des gènes qui sont transmissibles lors de la mitose et/ou la méiose, mais ne découlent pas de modifications dans la séquence de l’ADN (Berger et al., 2009). Autrement dit, les altérations épigénétiques sont capables de moduler le niveau d’expression des gènes en agissant sur la chromatine. Depuis quelques années, l’attention des chercheurs porte de plus en plus sur l’implication des modifications épigénétiques dans la carcinogenèse prostatique. Une activité anormale d’un ou de plusieurs acteurs épigénétiques entraîne des modifications de profil d’expression des gènes pouvant être associées à la carcinogenèse. Dans le cancer de la prostate, on retrouve ainsi une forte activité des ADN méthyltransférases (DNMT1) et une dérégulation des modificateurs d’histones, notamment de l’histone méthyle transférase EZH2, associée à la répression de la transcription de certains gènes (Gillio-Tos et al., 2012; Gravina et al., 2013; Koh et al., 2011; Yu et al., 2007). En plus de ces facteurs épigénétiques, des facteurs environnementaux et plus particulièrement la nutrition intervient dans les processus de carcinogenèse. La thématique du laboratoire a été longtemps axée sur la nutrition et le développement des cancers. En effet, des études sur les effets préventifs des phyto-oestrogènes du soja dans la carcinogenèse prostatique ont largement été abordées (Adjakly et al., 2011). Les phyto-oestrogènes du soja ont montré leur effet déméthylant sur les promoteurs des gènes suppresseurs de tumeurs. L’hypothèse de ces travaux a été établie du fait de la faible incidence du cancer de la prostate retrouvée dans les pays asiatiques où une forte consommation de soja a été remarquée. Les micronutriments contenus dans le soja auraient ainsi la capacité de moduler les modifications épigénétiques dans le cancer de la prostate (Vardi et al., 2010). Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes focalisés sur les modifications des histones notamment la méthylation des histones qui reste peu étudiée dans le cancer de la prostate. Premièrement, nous avons étudié le rôle de la triméthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3) dans l’implication et la progression du cancer de la prostate. La deuxième partie a consisté en l’identification de nouveaux marqueurs pronostiques et épigénétiques liés à la méthylation des histones afin d’établir un profil épigénétiques des tumeurs prostatiques. Nous avons également évoqué l’effet des phyto-oestrogènes du soja sur la modulation des modifications épigénétiques dans le cancer de la prostate et leurs rôles protecteurs dans le développement tumoral. / Prostate cancer is the most common and represents the third leading cause of cancer death in men in France. In addition to the theory of genetics in the development of cancers, the involvement of epigenetic changes during prostate carcinogenesis is no longer in doubt. Epigenetics is defined as the study of changes in the expression of genes that are transmissible during mitosis and / or meiosis, but do not result from modifications in the DNA sequence. In other words, epigenetic alterations are able to modulate the level of gene expression by acting on chromatin. In recent years, the attention of researchers has increasingly focused on the involvement of epigenetic modifications in prostatic carcinogenesis. Abnormal activity of one or more epigenetic actors leads to changes in gene expression patterns that may be associated with carcinogenesis. In prostate cancer, there is thus a strong activity of DNA methyltransferases (DNMT1) and a deregulation of histone modifiers, especially histone methyl transferase EZH2, associated with the repression of the transcription of certain genes (Gillio- Tos et al., 2012, Gravina et al., 2013, Koh et al., 2011, Yu et al., 2007). In addition to these epigenetic factors, environmental factors and more particularly nutrition is involved in the processes of carcinogenesis. The work of the laboratory has long focused on nutrition and cancer development. Indeed, studies on the preventive effects of soy phytoestrogens in prostate carcinogenesis have been widely discussed (Adjakly et al., 2011). The soy phytoestrogens showed their demethylating effect on the promoters of tumor suppressor genes. The hypothesis of this work was established because of the low incidence of prostate cancer found in Asian countries where high consumption of soybeans was noticed. The micronutrients contained in soy thus have the ability to modulate epigenetic modifications in prostate cancer (Vardi et al., 2010). In this thesis, we focused on histone modifications including histone methylation, which remains poorly studied in prostate cancer. First, we investigated the role of trimethylation of histone H3 lysine 27 (H3K27me3) in the involvement and progression of prostate cancer. The second part consisted of the identification of new prognostic and epigenetic markers related to histone methylation in order to establish an epigenetic profile of prostate tumors. We also discussed the effect of soy phytoestrogens on the modulation of epigenetic changes in prostate cancer and their protective roles in tumor development.