Des nouveaux ligands multidentes associant la fonction iminophosphorane (P=N) et des donneurs de types thiolates ou phenolates ont été développés au cours de la thèse. La synthèse de ces ligands présentement plusieurs avantages comme l'utilisation des produits bon marche ou la facilité de monter en échelle. Tous les ligands montrent une grande capacité de se coordiner avec plusieurs métaux, y comprise les métaux de transition, aluminium (group principal) et yttrium (terre-rare). Les complexes résultant de ces coordinations ont été étudiés théoriquement par les calculs DFT et expérimentalement par plusieurs techniques de spectroscopies électromagnétiques (RMN multi-noyaux, diffraction aux rayons X, RPE, UV-Vis, IR). Leur activités catalytiques ont été évaluées en tant que catalyseurs dans l'oligomerisation d'éthylène et la polymérisation de lactide pour des polymères biodégradables. En particulier, la synthèse des plusieurs ligands tétradentes phosphasalens a été mise au point. Ces ligands sont des homologues phosphorés des ligands Salen, qui, eux, ont fait l'objet d'études extensives ces dernières années. Les ligands phosphasalen ont été démontrés d'avoir une grande flexibilité et d'être excellent donneurs d'électrons. Grâce à ces propriétés, ils seront capables de stabiliser des métaux de haut degré d'oxydation. Un premier exemple très encourageant a été fait avec l'étude sur le complexe [Ni(III)-phosphasalen]. Ces ligands phosphasalens s'avèrent également très intéressants en catalyse. En effet, les complexes yttrium de ces ligands sont parmi les meilleurs initiateurs pour la polymérisation de lactide par ouverture de cycles, en terme de performance et stereoselectivity, alors que les complexes salen sont pas ou très peu active pour la même réaction. Ces études pionnières ouvrent plusieurs perspectives pour l'application des ligands phosphasalen en chimie de coordination et catalyse.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in engl. Sprache.

Mon travail de thèse s’est focalisé sur l’étude des récepteurs CXCR4 et ACKR3, deux récepteurs aux chimiokines. Ceux-ci jouent des rôles majeurs dans différentes fonctions physiologiques notamment le chimiotactisme des cellules immunitaires. Le dérèglement de leur activité est souvent associé à différents pathologies, notamment des cancers. Outre le fait que ces récepteurs lient tous les deux la même chimiokine, CXCL12, il a été montré qu’ils étaient capables d’exercer l’un sur l’autre des régulations croisées. Les mécanismes sous-tendant celles-ci sont très mal connus. Ils pourraient être liés à une compétition entre les récepteurs pour lier le même ligand CXCL12 ou à des régulations au niveau des voies de signalisation activées lors de la liaison d’une chimiokine. Ces régulations croisées pourraient également résulter de la formation de complexes de récepteurs appelés oligomères, complexes qui disposeraient de propriétés pharmacologiques particulières. De tels complexes ont été décrits dès les années 1990 dans des systèmes d’expression hétérologues mais leur existence et leurs rôles dans des systèmes natifs reste très largement débattus. Une des raisons est la difficulté à élaborer des outils moléculaires permettant l’étude de ces oligomères dans les tissus natifs.Le premier objectif de ma thèse a été l’élaboration d’outils permettant d’étudier l’existence de ces oligomères dans les systèmes natifs. En collaboration avec des laboratoires d’Amsterdam, j’ai développé des nanobodies fluorescents, petits anticorps produits par le lama, afin de marquer spécifiquement les récepteurs endogènes exprimés à la surface des cellules. Pour rendre fluorescent ces nanobodies, nous avons utilisé une technique originale permettant de greffer un fluorophore sur l’extrémité C-terminale de la molécule. Ces nanobodies conservent des propriétés pharmacologiques remarquables puisqu’ils conservent de hautes affinité et spécificité pour leur cible. J’ai ainsi pu utiliser ces molécules et démontrer l’existence des oligomères CXCR4 dans des lignées cellulaires exprimant de façon endogène le récepteur CXCR4. Des analyses similaires sont en cours sur le récepteur ACKR3.Le second objectif de ma thèse a été de définir les rôles potentiels de ces oligomères. J’ai pu montrer que les hétéro-oligomères CXCR4 /ACKR3, complexes associant les deux types de récepteurs, possèdent des propriétés de liaison particulière. Ceux-ci semblent ne lier la chimiokine CXCL12 que sur le récepteur ACKR3 au sein du complexe. Cette asymétrie de liaison est très étonnante car le récepteur CXCR4 est capable de lier CXCL12 avec une cinétique bien supérieure à celle de ACKR3 pour ce même ligand. J’ai étudié les conséquences d’une telle asymétrie de liaison sur les propriétés de signalisation de ces récepteurs. Une analyse des différentes voies de couplage activées lors de la liaison de CXCL12 a été réalisée sur les récepteurs exprimés de façon isolée ou co-exprimés au sein d’une même cellule. Les résultats ne montrent pas de modifications majeures de leur propriété de couplage.Nous avons par ailleurs analysé la capacité de ces récepteurs à internaliser en absence ou en présence de ligand CXCL12. J’ai pu observer que les hétéro-oligomères CXCR4 / ACKR3 restaient vraisemblablement bloquer à la surface des cellules.Ces travaux ouvrent des perspectives intéressantes dans la mesure où elles constituent la première démonstration de l’existence d’oligomères CXCR4 dans des systèmes natifs.Par ailleurs l’observation d’une régulation différente de l’internalisation des hétéro-oligomères constitue une première piste conférant à ces complexes un rôle particulier dans les régulations croisées de l’activité que ces récepteurs exercent l’un sur l’autre. / During my PhD, I focused on two chemokine receptors, CXCR4 and ACKR3. They have several important physiological functions, such as chemotaxis of immune cells. However, on the other hand, when their function is disturbed, they are involved in different immunological pathologies and cancer. Both receptors recognise the same chemokine, CXCL12 and many studies have reported a crosstalk between CXCR4 and ACKR3. However, the mechanisms behind this crosstalk are still poorly understood. This crosstalk can occur because both receptors are competing for CXCL12, at the level of signalling pathways or due to the formation of complexes between CXCR4 and ACKR3 receptors, called oligomers. The oligomers might have specific pharmacological properties different from the receptor monomers. Oligomeric complexes have been described since the nineties. Most of the studies on these oligomers were performed on heterologous expression systems, but still a lot of debate exists about their existence and their role in native tissues. One of the reasons behind this controversy is that studying oligomers in a native context is complicated, especially because we often lack the molecular tools for these studies.The first objective of my PhD was to generate efficient tools to study the existence of CXCR4 and ACKR3 oligomers in native systems. In collaboration with laboratories from Amsterdam and Ghent, we have developed fluorescent nanobodies, small antibodies produced by llamas. These specific tools allow the detection of receptors endogenously expressed at the cell surface. In order to fluorescently label these nanobodies, we have used an original strategy that can specifically attach the fluorophore to the C-terminus of the nanobody. Interestingly, the fluorescent nanobodies retain high affinity and specificity for their target. With these nanobodies, I have demonstrated the existence of CXCR4 oligomers in cell lines that endogenously express CXCR4. We are currently investigating the existence of ACKR3 oligomers.The second objective of my PhD consists of defining the functional roles of these oligomers. I have shown that CXCR4/ACKR3 hetero-oligomers have specific binding characteristics. It seems that CXCL12 is binding only to ACKR3 within this hetero-oligomer and that ACKR3 impairs the CXCL12 binding to CXCR4 within the hetero-oligomer. This is interesting, since we also have demonstrated that CXCL12 is binding much faster on CXCR4 than on ACKR3.In addition, I have studied the consequences of this negative cooperativity within the CXCR4/ACKR3 hetero-oligomer on different signalling pathways. We have compared conditions where the receptor was expressed alone or when receptors were co-expressed. No major modifications have been found on their signalling properties. However, when investigating the internalisation of CXCR4 and ACKR3, it seems that CXCR4/ACKR3 hetero-oligomers remain blocked on the cellular surface.This opens interesting perspectives, since it is the first time CXCR4 oligomers have been detected at an endogenous level. Moreover, the observation of a different internalisation pattern of the hetero-oligomer is a first step to further investigate the specific roles of these oligomers in the crosstalk between the receptors.

No / The oligomerisation of L-amino acids by papain was studied in a mixer ball mill and in a planetary ball mill. The biocatalyst proved stable under the ball milling conditions providing the corresponding oligopeptides in good to excellent yields and with a variable degree of polymerisation. Both parameters were found to be dependent on the reaction conditions and on the nature of the amino acid (specifically on its side-chain size and hydrophobicity). In addition, the chemoenzymatic oligomerisation was demonstrated by utilising twin-screw extrusion technology, which allowed for a scalable continuous process. Finally, the synthesised oligo(L-Leu) 2b proved to be active as a catalyst in the Juliá–Colonna enantioselective epoxidation of chalcone derivatives. / We acknowledge RWTH Aachen University for support by the Distinguished Professorship Program funded by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. We kindly acknowledge Marcus Frings and Plamena Staleva for the HPLC analysis of products 4a–c (RWTH Aachen University) and ASEP for the TGA analysis (Queen’s University Belfast). D. E. C. and S. L. J. acknowledge the agency EPSRC, grant no. EP/R019655/1. Part of this work was performed at the Center for Chemical Polymer Technology (CPT) unit of DWI, which was supported by the EU and the federal state of North Rhine-Westphalia (grant EFRE 30 00 883 02).

Human mitochondrial ATP synthase is an enzyme containing 18 unlike subunits located in the inner mitochondrial membrane (IMM), where the catalytic F1 domain extends into the mitochondrial matrix and the FO domain, which contains the c8-ring rotor, the a-subunit and the supernumerary subunits, is anchored in the IMM. All the subunits, apart from the a- and A6L-subunits, are encoded in the nucleus and require transport into the mitochondria before being assembled. The a- and A6L-subunits are encoded on the mitochondrial genome. The respiratory complexes generate the proton motive force (PMF), which ATP synthase uses to generate ATP from ADP and Pi. Rotation of the α- and β-subunits with the central stalk γ-, δ- and ε-subunits is prevented by coupling the F1 domain to the FO domain via the peripheral stalk (the OSCP-, F6-, d- and b-subunits). ATP hydrolysis is prevented by the natural inhibitor of the enzyme, IF1, binding to the F1 domain. In addition to the aand, b-subunits, the FO domain contains the c8-ring and six supernumerary subunits not involved in the catalytic activity of ATP synthase. The roles of five of these subunits in the assembly of ATP synthase, the e-, f-, g-, DAPIT- and 6.8 kDa proteolipid-subunits, were investigated by suppressing or disrupting their expression individually. The e-subunit is the first of the supernumerary subunits to assemble, then the g-subunit followed by the f-, 6.8 kDa proteolipid- and DAPIT-subunits. All five supernumerary subunits investigated were required to facilitate the dimerisation and oligomerisation of ATP synthase. The e-, f- and g-subunits were found to be important for maintaining mitochondrial respiratory capacity.

Les α-oléfines linéaires sont des intermédiaires particulièrement importants dans l'industrie chimique et pétrochimique. Elles ont des applications variées mais sont utilisées principalement en tant que co-monomère dans la production de diverses qualités de polyéthylène. Dans ce cadre, ce sont les α-oléfines courtes (butène-1, hexène-1 et octène-1) qui sont les plus intéressantes. Aujourd’hui les α-oléfines sont produites très majoritairement par oligomérisation de l’éthylène en catalyse homogène selon deux types de procédés : Les procédés dits « on-purpose » et ceux dits « full-range ». Les procédés « on-purpose » sont sélectifs vis-à-vis d’une α-oléfine et fonctionnent avec des systèmes au chrome ou au titane. Le mécanisme décrit dans ce cas-là est de type métallacyclique. Les procédés « full-range » quant à eux permettent d’obtenir une large distribution d’α-oléfine et les procédés de ce type font intervenir des catalyseurs de nickel, de fer ou de zirconium. Le mécanisme ici est de type polymérisation dégénérée.L’objectif de cette thèse est de développer un système au Ni qui serait actif en oligomérisation de l’éthylène via un mécanisme de type métallacyclique et qui permettrait donc d’atteindre des sélectivités importantes. Dans le mécanisme métallacyclique l’étape clé est le couplage oxydant de deux molécules d’éthylène dans laquelle le degré d’oxydation du métal passe de n à n+2. Dans cette thèse les couples Ni 0/Ni II et Ni I/Ni III ont été considérés. Des précurseurs de Ni0 et NiI possédants des ligands aux propriétés variées ont été synthétisés et testés en réacteur sous forte pression d’éthylène selon différentes méthodes d’activations. Des études mécanistiques ont été réalisées grâce à différentes techniques analytiques à savoir les spectroscopies RMN et RPE, et un développement important a été réalisé en spectrométrie de masse afin de pouvoir observer des intermédiaires réactionnels. La majorité des résultats expérimentaux ont pu être rationnalisés à travers des études théoriques (DFT) permettant de faire émerger des systèmes catalytiques originaux associés à des voies d’accès et des chemins réactionnels différentiant. / Linear α-olefins are very important intermediates in the chemical and petrochemical industries. They have various applications but they are mainly used as co-monomers in the production of various grades of polyethylene. In this topic, the short LAOs (1-butene, 1-hexene and 1-octene) are the most interesting. Today LAOs are almost exclusively produced by ethylene oligomérisation with homogenous catalysts and there are two different industrial processes : “On purpose” and “Full-range” processes. “On purpose” processes are selective toward an α-olefin and catalyst used are based on Ti or Cr complexes. The mechanism described with these types of catalysts is a metallacyclic mechanism. On the other hand ethylene oligomérisation with “full-range” processes is done mainly with Ni or Zr catalysts. In these case a large distribution of olefins is obtained and the mechanism described is a degenerative polymerisation mechanism. The aim of this thesis is to develop a Ni-based system which is active in ethylene oligomérisation through a metallacylcic mechanism in order to access good selectivity toward LAOs. In the metallacyclic mechanism the key step is the oxidative coupling of the two ethylene molecules in which the oxidation state of the metal goes from n to n+2. The couples Ni0/NiII and NiI/NiIII has been investigated in this thesis. Ni 0 and Ni I precursors with various ligands have been synthesized and tested in a semi-batch reactor under high pressure of ethylene with various activation methods. Mechanistic studies have been made using various analytical methods such has NMR and EPR spectroscopies and a big effort has been made in the development of a mass spectrometry method to observe reactive intermediates. In addition, almost all the experimental observations have been rationalized thanks to molecular modeling by DFT.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs transmembranaires. Ils sont impliqués dans une large variété de processus physiologiques et par conséquent ils représentent une cible thérapeutique d'intérêt pour le développement de médicaments. Plusieurs études ont démontré que les RCPGs sont capables d'interagir entre eux pour former des complexes oligomériques. Cependant, leur existence in vivo et leur rôle fonctionnel reste sujet à débats. Afin de mieux appréhender ce phénomène, nous avons utilisé un RCPG de classe C comme modèle d'étude, le récepteur de l'acide γ-aminobutyrique (GABAB), qui est impliqué dans une grande variété de désordres neurologiques et psychiatriques. Son originalité réside dans le fait qu'il est un hétérodimère obligatoire composé de deux sous-unités : GABAB1 et GABAB2 (GB1 et GB2). La liaison de l'agoniste sur GB1 conduit à l'activation de GB2. Au cours de ma thèse, nous avons montré en utilisant une nouvelle approche biophysique basée sur un marquage fluorescent enzymatique appelé Snap-tag que, contrairement aux récepteurs métabotropiques du glutamate, le récepteur GABAB forme des dimères de dimères (tétramères). Cette organisation hétéro-oligomérique est assurée par des contacts stables entre les domaines extracellulaires des sous-unités GB1. De plus, nous avons apporté des données en faveur de l'existence physiologique de cet assemblage en utilisant des membranes de cerveau de rat et de souris. Dans une seconde partie, nous avons souhaité déterminer les conséquences fonctionnelles de cette organisation. Nos résultats suggèrent une efficacité de couplage à la protéine G réduite du récepteur GABAB lorsqu'il est associé en dimères de dimères. Collectivement, nos données rapportent pour la première fois, l'existence de larges complexes allostériques de RCPGs dans le cerveau. / The G-protein coupled receptors (GPCR) constitute the main family of transmembrane receptors. They are involved in many physiological processes and, as a consequence, they represent a therapeutic target of interest for the development of new drugs. Few studies have demonstrated that GPCRs are able to interact with each other to form oligomeric complexes. However, the existence in vivo and the functional interest of these oligomers remain a subject of intense debates. To address this issue, we have used a class C GPCR as a model, the γ-aminobutyrate B receptor (GABAB), which is involved in a wide variety of neurological and psychiatric disorders. This receptor has the particularity to be an obligatory heterodimer composed of two subunits GABAB1 and GABAB2 (GB1 and GB2). Agonist binding on GB1 leads to G-protein activation by GB2. During my thesis, we developed a new biophysical approach based on an enzyme-mediated fluorescent labeling calle d Snap-Tag and showed that, unlike metabotropic glutamate receptors, GABAB forms dimers of dimers (tetramers). This oligo-heterodimers organization is mediated via stable contacts between extracellular domains of GB1 subunits. Furthermore, we brought evidence of the physiological reality of this assembly using rat and mouse brain membranes. Then, we aimed at assessing what would be the functional rational of the GABAB dimer of heterodimers. Our results suggest that the GABAB receptor has a lower G protein-coupling efficacy when associated into dimers of dimers. Altogether, our data report for the first time, the existence of large allosteric GPCR complexes in the brain.

Von TRAIL, FasL und APRIL, drei Mitgliedern der TNF-Liganden-Familie, ist bekannt, dass Trimerstabilität und Oligomerisierungsstatus maßgeblich das Rezeptoraktivierungspotential dieser Liganden beeinflussen. Für die immunstimulatorischen TNF-Liganden CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL und GITRL war hingegen vor der Durchführung dieser Arbeit praktisch nicht bekannt, inwieweit Trimerbildung, Stabilisierung und Oligomerisierung wichtig für deren Aktitvität sind. Dies wurde in dieser Arbeit systematisch untersucht. CD40L besaß bereits als trimeres Molekül eine hohe Aktivität, die durch sekundäre Oligomerisierung nur wenig gesteigert wurde. Die spezifische Aktivität konnte durch Stabilisierung mit Hilfe der Tenascin-C (TNC)-Trimerisierungsdomäne nur geringfügig gesteigert werden. CD27L war als lösliches Flag-markiertes sowie als hexameres Fc-Protein selbst nach Quervernetzen nicht in der Lage, seinen Rezeptor CD27 zu binden und zu aktivieren. Die TNC-stabilisierte trimere Form des CD27L hingegen induzierte nach Oligomerisierung mit einem anti-Flag-Antikörper ein starkes Signal. Trimerer OX40L und trimerer 41BBL konnten nur in oligomerisierter Form ihre Rezeptoren aktivieren, wobei die Aktivität der TNC-stabilisierten Form signifikant stärker ausgeprägt war. GITRL aktivierte seinen Rezeptor bereits als stabilisiertes Trimer und Hexamer, die Aktivität konnte durch Quervernetzen nur gering gesteigert werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass CD27L, OX40L und 41BBL zu der Untergruppe der TNF-Ligandenfamilie gehört, für die eine Stabilisierung des trimeren Moleküls und dessen Oligomerisierung nötig sind, um eine starke Rezeptoraktivierung zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu zeigten CD40L und GITRL bereits oligomerisierungsunabhängig eine hohe Aktivität. GITRL benötigte allerdings die Stabilisierung des trimeren Moleküls durch die TNC-Domäne, um gute Aktivität zu zeigen. Im Weiteren wurden Antikörperfragment (scFv-)-TNF-Ligand-Fusionsproteine konstruiert und untersucht, die ein Zelloberflächenantigen binden. Eine starke Zelloberflächenantigen-spezifische Aktivierung des jeweiligen Rezeptors konnte für scFv-41BBL und für scFv-OX40L gezeigt werden, wohingegen scFv-CD40L und scFv-GITRL bereits auf antigennegativen Zellen stark aktiv waren. scFv-CD27L war selbst auf antigenpositiven Zellen inaktiv. Verwendet man an Stelle des Antikörperfragments eine extrazelluläre Proteinbindedomäne, z.B. die eines TNF-Rezeptors, erhält man Fusionsproteine, die zum einen eine selektive Aktivierung der TNF-Ligandendomäne und somit die Aktivierung des korrespondierenden Rezeptors auf der Zielzelle ermöglichen, zum anderen aber durch die Bindung an den membranständigen Liganden dessen Aktitvät neutralisieren können. Für CD40-, RANK- und B7-2-FasL konnte der immobilisationabhängige Aktivierungseffekt auf entsprechenden Zelloberflächenmolekül-exprimierenden Zellen gezeigt werden. Anhand von T47D-Zellen, die durch eine autokrine CD40L-CD40-Signalschleife vor Apoptose geschützt sind, konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von CD40-FasL an membranständigen CD40L die CD40L-CD40-Interaktion gestört und gleichzeitig Apoptose verstärkt induziert werden kann. Das Prinzip der antigenabhängigen Aktivierung von TNF-Liganden könnte Anwendung in der Tumortherapie finden, da bei Verwendung entsprechender selektiv exprimierter Marker eine lokale Rezeptoraktivierung erreicht und so Nebenwirkungen minimiert werden können. / Trimer stability and oligomerization status of TRAIL, FasL and APRIL, three members of the TNF ligand family, critically determine their receptor activating potential. However, detailed information for the immunostimmulatory ligands CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL and GITRL regarding the importance of trimer formation, stabilization and oligomerization for ligand activity was lacking. These aspects were investigated systematically in this work. CD40L was highly active as a trimeric molecule. Secondary oligomerization and/or stabilization via the tenascin-C (TNC) trimerization domain slightly enhanced its specific activity. As soluble Flag-tagged and as hexameric Fc protein CD27L failed to bind and activate its cognate receptor CD27, even after crosslinking. However, the TNC stabilized form of CD27L induced a strong signal after oligomerization with anti-Flag antibody. Receptor signaling was only activated by oligomerized molecules of trimeric OX40L and 41BBL whereas the respective TNC fusion protein showed significant stronger activity. Stabilized GITRL trimers and hexamers already activated their receptor whereas oligomerization of GITRL just slightly enhanced the specific activity. Taken together, CD27L, OX40L and 41BBL belong to a TNF ligand family subgroup which requires oligomerization and stabilization of the trimeric molecule to ensure strong receptor activation. In contrast, CD40L and GITRL already display high oligomerization-independent activity, though the latter needs stabilization by the TNC domain. Furthermore, antibody fragment (scFv)-ligand fusion proteins targeting specific cell surface antigens were designed and analyzed. Strong cell surface antigen-selective TNF receptor activation was achieved for scFv-41BBL and scFv-OX40L whereas scFv-CD40L and scFv-GITRL already induced signaling in the absence of antigen-positive cells. scFv-CD27L lacked activity even on antigen-positive cells. Using an extracellular protein binding domain for example the ligand binding domain of a TNF receptor instead of an antibody fragment resulted in fusion proteins that on the one hand activate the TNF ligand domain and thus the corresponding receptor on target cells and on the other hand neutralize membrane ligand activity by binding. The effect of cell surface immobilization-mediated activation of these fusion proteins on cells expressing the corresponding target molecule was shown here for CD40-, RANK- and B7-2-FasL. The CD40-FasL fusion protein simultaneously blocked CD40L-CD40 interaction and induced strong apoptosis in T47D cells displaying an antiapoptotic autocrine CD40L-CD40 signaling loop. The principle of antigen-dependent activation of TNF ligands could be of use in tumor treatment due to the fact that tumor specific marker targeting leads to locally restricted receptor activation on antigen positive cells, promising a reduction in potential off target effects.

Les bactéries utilisent un mode de communication appelé quorum sensing pour régulerl’expression des gènes en fonction de la densité de population et contrôler ainsi de façonmulticellulaire des processus tels que la sporulation, la compétence ou la virulence. Chez les bactériesà Gram-positif, le quorum sensing repose principalement sur la production, la sécrétion et la détectionde petits peptides de signalisation.Le projet porte sur l’étude du système quorum sensing: NprR/NprX chez Bacillus cereus, oùNprR est l’effecteur qui reconnait spécifiquement le peptide de signalisation NprX. NprR est uneprotéine bi-fonctionnelle. Seule, elle agit en tant qu’inhibiteur de la sporulation, en complexe avecNprX, elle perd sa fonction initiale au profit d’une activité facteur de transcription impliquée dans lavirulence. NprR appartient à une famille d’effecteurs de quorum sensing appelée RNPP (Rap, NprR,PlcR et PrgX) encore mal caractérisée au niveau structural. Mon projet de thèse a consisté en l’analysestructure-fonction du système NprR/NprX.Pour comprendre la régulation fonctionnelle de NprR par NprX, des études en solution (SECMALSet DLS) ont permis de mettre en évidence un switch moléculaire qui repose sur un changementd’oligomérisation. Ainsi NprX fait basculer NprR d’une conformation Apo dimérique à uneconformation compléxée tétramérique.L’étude structurale par cristallographie a aboutit à la résolution de la structure du complexeNprR/NprX. L’analyse de ce tétramère suggère la reconnaissance de 2 sites distincts sur l’ADN.L’étude structurale par SAXS, a quant à elle, permis de proposer une conformation dimérique de laforme Apo NprR, modèle conforté grâce à une étude par mutagénèse dirigée des résidus d’interface. Ils’agit d’un mode de dimérisation semblable à celui des protéines Rap (membres de la famille RNPP).La caractérisation par ITC de l’interaction NprR/NprX avec différentes formes du peptide,ainsi que l’analyse de la poche de fixation du complexe, ont permis de mieux comprendre la spécificitéd’interaction et de mettre en évidence deux résidus clés de l’effecteur : l’Asn275 essentielle à lafixation du peptide et l’Arg 126 essentielle à l’activation de la fonction facteur de transcription.Ces travaux ont contribué à une meilleure compréhension du système quorum sensingNprR/NprX grâce à l’élucidation du switch moléculaire contrôlé par NprX mais aussi à une meilleureconnaissance de la famille d’effecteurs RNPP. / Bacteria use a communication mode named quorum sensing to regulate gene expression depending on the population density and thus to control processes such as sporulation, competence or virulence in a multicellular manner. In Gram-positive bacteria, the quorum sensing relies mostly on the production, the secretion and the detection of small signaling peptides. The project focuses on the study of the quorum sensing system NprR/NprX in Bacillus cereus, where NprR is the effector, which recognizes specifically the signaling peptide NprX. NprR is a bi-functional protein. In the absence of peptide, it acts as a sporulation inhibitor while in complex with NprX, it acts as transcription factor implicated in virulence. NprR belongs to a family of quorum sensing effectors named RNPP (for the first identified members: Rap, NprR, PlcR and PrgX) still not well characterized at a structural level. My PhD project consisted to perform the structure/function analysis of the NprR/NprX system. To understand the functional regulation of NprR by NprX, I carried out different studies in solution (SEC-MALS and DLS). These results allowed me to highlight a molecular switch based on a changing of the oligomerisation state of the protein. NprX binding switches NprR from an Apo dimeric conformation to a tetrameric complex. The structural study by crystallography led to the resolution of the tetrameric NprR/NprX complex structure. The analysis of this tetramer suggests the recognition of 2 DNA binding sites. The structural study of the dimeric conformation of Apo NprR by SAXS, allowed me to propose a model similar to that of the Rap dimers (members of RNPP family). This model is supported by a directed mutagenesis study of interface residues. The characterization by ITC of the NprR/NprX interaction with different forms of the peptide, as well as the analysis of the binding pocket in the complex, led to a better understanding of the specificity of the interaction. Two key residues of the effector were highlighted: Asn275, essential to peptide binding and Arg126, essential to the activation of the transcription factor function. These results have contributed to a better understanding of the NprR/NprX quorum sensing system thanks to the elucidation of the molecular switch controlled by NprX but also in a better knowledge of the RNPP effectors family.

Die Bildung infektiöser Viruspartikel des humanen Zytomegalievirus (HCMV) ist ein mehr-stufiger Prozess. Sie beginnt mit der Verpackung der DNA in die Kapside im Kern, gefolgt von weiterer Reifung während des Transports durch das Zytoplasma und der abschließenden Freisetzung aus der Zelle. Im Zuge dieser Arbeit wurden zwei Proteine, die Einfluss auf die ebengenannten Prozesse haben, analysiert. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der funktionellen Charakterisierung des HCMV Pro-teins pUL77. Es ist bekannt, dass das homologe Protein pUL25 in alpha-Herpesvirinae essentiell für die DNA-Verpackung ist. Zunächst konnte das Protein als Kapsid-assoziiertes strukturelles Protein identifiziert werden. Es wurden Interaktionen von pUL77 mit DNA-Verpackungs- und Kapsidproteinen gezeigt. Weiterhin wurde die DNA-Bindungsfähigkeit von pUL77 in verschiedenen „in vitro“-Experimenten untersucht. Zusammengefasst weisen unsere Ergebnisse auf eine Funktion von HCMV pUL77 bei der DNA-Verpackung hin. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das HCMV Protein pUL71 charakterisiert, das in allen Herpesviren konserviert vorkommt, dessen Funktion jedoch nicht charakterisiert ist. Zunächst wurde das Protein als strukturelles Tegumentprotein mit “earlylate“ Expressionskinetik klassifiziert. Weiterhin wurden die subzelluläre Lokalisation sowie virale und zelluläre Interaktionspartner untersucht. Die Ergebnisse weisen auf eine Funktion von HCMV pUL71 bei der Reifung und beim Transport der Virionen im Zytoplasma hin. „In silico“-Vorhersagen zeigten ein „Leuzin Zipper“-Motiv in pUL71, das als mögliche Oligomerisationsdomäne dienen könnte. Mutationen wurden in dieses Motiv eingebracht und die resultierenden Proteine auf ihre Oligomerisationsfähigkeit mit „in vitro“-Methoden und in rekombinanten Viren untersucht. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass das „Leuzin Zipper“-Motiv wichtig für die Funktion von pUL71 ist und diese mit einer unbeeinträchtigten Oligomerisation des Proteins zusammen hängt. / The morphogenesis of Human cytomegalovirus (HCMV) virions starts with the capsid assem-bly and DNA insertion in the nucleus followed by maturation during transport through the cytoplasm prior to release of virus progeny. In this study we are functionally characterising two proteins that are involved in those steps. The function of essential HCMV protein pUL77 is characterised in the first part of the study. HCMV pUL77 was shown to be a structural protein associated with capsids. Furthermore, our experiments demonstrated that HCMV pUL77 interacts with DNA packaging motor compo-nents and capsid proteins. The ability of HCMV pUL77 to bind double-stranded DNA was studied in “in vitro” assays designed for this study. The homologue α-Herpesvirinae protein pUL25 is described to be involved in processes connected with DNA packaging. Data ob-tained in this study demonstrates that HCMV pUL77 might serve a similar function. In the second part of the study HCMV pUL71, conserved throughout the Herpesvirus family but to date unclassified, was functionally characterised. HCMV pUL71 was defined a struc-tural tegument protein with early-late expression kinetics. We studied the sub-cellular local-isation and interactions of pUL71 with a subset of cellular and viral proteins. Thereby we could show that HCMV pUL71 function might be connected with processes of viral egress. By in silico analyses we identified a leucine zipper motif in pUL71 that might serve as a puta-tive oligomerisation domain. In order to investigate the function of the leucine zipper motif, we performed in vitro assays and investigated the alterations of the motif in the viral context. Taken together we can conclude that (i) an intact leucine zipper motif is crucial for the func-tion of pUL71 and (ii) this function is dependent upon undisturbed oligomerisation of the pro-tein.