As a functional unit involved in both maintaining endocrine homeostasis and also producing mature eggs, the ovary plays a central role in female reproduction. The development and function of the ovarian follicles are controlled by gonadotropins released from the pituitary. It is widely accepted that the action of gonadotropins on ovarian follicles is mediated by paracrine/autocrine factors produced by the somatic cells surrounding the oocyte. Increasing evidence indicates that the Igf system is involved in mediating the action of gonadotropins in the ovary. Previously, we identified a gonad-specific Igf subtype (Igf3) distinct from Igf1 and Igf2. This fmding further highlights the importance of the Igf system in the fish ovary. In this thesis, efforts were made to understand the role of the Igf system in ovary using zebrafish as the model organism, and attention was focused on Igf3. / Because the expression of Igf3 is correlated with the LH receptor in zebrafish follicles, the regulation of igf3 by gonadotropins was subsequently studied in the ovary. The expression of igf3 was significantly up-regulated in both ovarian fragments and isolated follicles upon treatment with hCG in dose- and time-dependent manners. Treatment with 8-Br-cAMP or IBMX mimicked the effects of hCG on the expression of igf3 in follicles of different stages. / Four Igfs are present in zebrafish, and our results show that all four igfs are expressed in the ovary of zebrafish and exhibit the differential expression profiles during folliculogenesis. Using a primary culture of zebrafish follicle cells, we demonstrated that hCG stimulated igf2b and igf3 expression but suppressed igf2a expression. Moreover, the effect of gonadotropin could be mimicked by IBMX, which increased the intracellular levels of cAMP, suggesting the possible involvement of cAMP in the gonadotropin-based regulation and differential expression of igf2a, igf2b and igf3. These results also show that the Igf3 is the Igf subtype most sensitive to gonadatropin and cAMP. / In addition, the expression patterns of igf1, igf2a, igf2b, igf3, igf1ra and igf1rb were also studied during zebrafish embryogenesis. The unique temporal and spatial expression patterns of igf1, igf2a, igf2b, igf3, igf1ra and igf1rb were revealed by both real-time PCR and whole mount in situ hybridization, the results suggest divergent functions for these Igfs in early zebrafish development. / Taken together, the present studies provide substantial information about the Igf system, especially that of Igf3 in the zebrafish ovary. Data were gathered regarding Igf3 expression, regulation and functions, which is not only helpful for the understanding of the role of the Igf system in fish reproduction, but also contributes toward uncovering the ovarian signaling network involved in oocyte maturation across vertebrates. This study of igfs gene expression provides direct information to the study of Igf signaling in zebrafish. / To study the function of Igf3, bioactive recombinant Igf3 proteins were prepared using a bacterial expression system. Incubation of follicles with recombinant zebrafish Igf3 significantly enhanced oocyte maturation in time-, dose- and stage-dependent manners. The potential mechanisms of Igf3-induced oocyte maturation were then investigated. Igf3 stimulated oocyte maturation via a steroid-independent manner. Igf3 induced oocyte maturation through Igf1rs and the PI3 kinase, PDE3 and MAP kinase were necessary for Igf3-mediated oocyte maturation in zebrafish. / We first examined the gene expression patterns of Igf3 in the ovary. The igf3 gene in zebrafish was found to be alternatively spliced into two transcripts, with transcript variant 1 exclusively expressed in the gonads and transcript variant 2 only expressed during early development. Using specific antibodies developed for zebrafish Igf3, both the prepropeptide and the mature peptide forms of Igf3 were found to be predominantly expressed in the zebrafish ovary. Real-time PCR and in situ hybridization revealed that igf3 mRNA levels were relatively low in the early follicles but significantly increased after the mid vitellogenic stage (midstage III) and were high in the full grown follicles. In the full grown follicles, igf3 mRNA was detected primarily in the somatic follicular cells, with a low level of expression in the oocytes. Igf3 immunoreactivity was confined to the follicular cells alone. / Li, Jianzhen. / Advisers: Hui Zhao; Hon Ki Christopher Cheng. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-06, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 122-150). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA161.pdf: 119035 bytes, checksum: a5dfaf04161545272882e1423c258dc0 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The in vitro embryo production has a strong commercial and preservationist impact in Brazil. However, there are still barriers to be overcome, since the in vitro maturation does not mimic the in vivo maturation. The maturation optimization increases the embryo competence and quality, making them more cryotolerants. The meiotic blockage, after oocytes removal from their follicular environment, may be a good alternative. Three experiments (n = 2848) evaluated the Cordicepim as a meiotic blocker in bovine oocytes in different culture media, and its influence on embryonic development. Follicles 3-8 mm diameter, were punctured from abattoir ovaries and allocated into 4 groups: Control (TCM-199 + pyruvate, FSH, LH and SFB); MIVCord (TCM-199 + Pyruvate, FH, LH, FCS, Cordicepim); TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) and TCMCont (TCM-199), followed by standard maturation (IVM) for 20 or 24 h. The effect of meiosis blockage in embryo production was assessed by cleavage and blastocyst rate, and total number of cells assessed. To evaluate the stage of maturation, oocytes were stained with Hoechst and evaluated by microscopy. Quantitative data were analyzed by ANOVA and Tukey test and the qualitative data by chi-square, with 5% significance. Cordicepim did not affect cleavage (60.7 vs. 56.4%) and blastocysts (30.7 vs. 24.8%) rates when added to supplemented medium (MIVCord). However, there was a reduction in cleavage (42%) and blastocysts (12.1%) rates when added to a medium without supplements (TCMCord). On the kinetics of maturation after 6 hours of pre culture, only TCMCord group maintained most oocytes blocked. Cell density of the produced embryos (26 h maturation) in MIVcont groups (189.2 ± 11.4), MIVCord (187.1 ± 12.1) and TCMCont (171.2 ± 10.4) did not differ and were higher than TCMCord group (119.7 ± 11.4). Already, with 30 h maturation cell density was similar between embryos from control group (224.2 ± 17.5) and TCMCord group (240.1 ± 10.4). However, even with 30 h maturation, only 64.8% of the oocytes completed maturation in TCMCord group, while 100% maturated in Control group. We conclude that 6 h of culture in cordicepim in the absence of gonadotropins, partially inhibits the meiosis in oocytes, and this inhibition is not successfully reversed even after 24 hours of maturation pattern in the absence of cordicepim. The cordicepim reduces embryo production when in vitro maturation is performed for 26 h. However, within 30 h maturation time, the Cordicepim does not affect embryo production rate. Yet, the cordicepim prevents the cumulus cells expansion in an irreversible manner / A produção in vitro de embriões tem um forte impacto comercial e preservacionista no Brasil. Entretanto ainda existem barreiras a serem superadas, já que a maturação in vivo não é totalmente mimetizada pela maturação in vitro. A otimização da maturação pode aumentar a competência e a qualidade embrionária, tornando-os mais criotolerantes. Uma boa alternativa pode ser o bloqueio meiótico reversível. Três experimentos (n = 2848) avaliaram o Cordicepim como bloqueador meiótico para oócitos bovinos, em diferentes meios de cultivo e sua influência no desenvolvimento embrionário. Folículos de 3-8 mm, obtidos por aspiração de ovários de frigorífico foram distribuídos em 4 grupos: Controle (TCM-199 + piruvato, FSH, LH e SFB) MIVCord (TCM-199 +Piruvato, FH, LH, SFB, Cordicepim) TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) e TCMCont (TCM-199), seguido de maturação padrão (MIV) por 20 ou 24 horas. O efeito do bloqueio meiótico na produção de embriões foi avaliado pela taxa de clivagem, blastocisto e número total de células. Para avaliação do estágio de maturação, os oócitos foram corados com Hoechst e avaliados por microscopia. Os dados quantitativos foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey e os qualitativos ao qui-quadrado, com 5% de significância. O Cordicepim não influenciou as taxas de clivagem (60,7 vs 56,4%) e blastocistos (30,7 vs 24,8%), quando empregado em meio suplementado (MIVCord). Porém, houve uma redução na taxa de clivagem (42%) e blastocistos (12,1%), quando empregado em meio sem suplementos (TCMCord). Na cinética de maturação nuclear após 6 horas de pré-maturação, apenas o grupo TCMCord manteve a maioria dos oócitos bloqueados (67%). A densidade celular dos embriões produzidos (26 h maturação) nos grupos controle (189,2 ± 11,4), MIVCord (187,1 ± 12,1) e TCMCont (171,2 ± 10,4) não diferiram entre si e foram superiores ao grupo TCMCord (119,7 ± 11,4). Já com 30 h de maturação a densidade celular dos embriões foi semelhante entre os grupos controle 30 (224,2 ± 17,5) e TCMCord 30 (240,1 ± 10,4). Porém, mesmo com 24 h de maturação padrão, apenas 64,8% dos oócitos do grupo TCMCord 30 completaram a maturação, enquanto no grupo controle 100% maturaram. Conclui-se que 6 h de pré-maturação em cordicepim, na ausência de suplementos, inibe parcialmente a meiose em oócitos bovinos, porém esta inibição não é revertida com êxito mesmo após 24 horas de maturação padrão na ausência de cordicepim. O cordicepim reduz a produção de embriões in vitro com 26 h de maturação. Já com 30 h de maturação, o Cordicepim não influencia a taxa de produção embrionária. Ainda, o cordicepim impede de forma irreversível a expansão das células do cumulus

As técnicas de cultivo de folículos e oócitos in vitro, com o objetivo de se obter oócitos maduros para procedimentos de Reprodução Assistida (RA), têm sido aplicadas em diferentes contextos. O sucesso destes procedimentos está diretamente relacionado ao sistema de cultivo utilizado. A utilização de células da granulosa (CG) humanas cultivadas in vitro como um suporte para o co-cultivo destes oócitos imaturos e folículos tem sido descrita por alguns autores. A criopreservação destas células, considerando-se o contexto de sua obtenção em procedimentos de RA, permitiria a viabilização da aplicação destas células na prática clínica diária. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi padronizar o congelamento de células da granulosa (CG) humanas para aplicação em sistemas de co-cultivos de folículos e oócitos imaturos. Foram obtidas CG de 20 voluntárias em tratamento de reprodução assistida, células de 10 voluntárias foram cultivadas em meio ?-MEM suplementado para interrupção da luteinização e congeladas após 48 horas em container \"Cryostep\" (grupo 2C- 2 cultivos) (etapa 2) e células de 10 voluntárias foram congeladas em container \"Cryostep\" sem cultivo prévio (grupo CD- congelamento direto) (etapa 3). Após o descongelamento estas células foram (re)cultivadas por 144 horas, com troca de meio em 48, 96 e 144 horas para avaliações da produção de estradiol (E2) e progesterona (P4) (ng/mL). Verificamos redução na contagem celular e na viabilidade celular tanto no método de congelamento direto (CD) quanto no método com dois cultivos (2C) após o descongelamento (p<0,05), e isso se refletiu na produção de estradiol e progesterona que foi maior nas culturas de células frescas em relação às células criopreservadas (p<0,05). Porém, a relação de E2/célula foi mantida após o descongelamento, sugerindo que esta redução na produção se deve à redução no número de células, as que sobrevivem se mantém normofuncionantes (p=0,23).O CD foi mais eficiente pois permitiu uma maior recuperação celular e uma melhor viabilidade quando comparado ao grupo 2C. A relação estradiol/progesterona foi mantida em todos os tempos de cultivo, fresco, CD e 2C (p>0,05), indicando que a característica funcional destas células foi preservada após o descongelamento. Concluímos que a criopreservação de CG humanas obtidas durante a captação de oócitos compromete a contagem celular e a viabilidade geral da cultura, entretanto, a capacidade funcional e a característica destas células se mantêm preservadas (manutenção das relações E2/célula e E2/P4) / Follicle and oocyte in vitro culture techniques, aiming to obtain mature oocytes for Assisted Reproductive Treatments (ART), have been applied to different contexts. The success of these procedures depends on the culture system used. The use of human granulosa cells (GC) in co-culture systems for follicle and oocyte maturation have been described by some authors. The cryopreservation of these cells, considering the context in which they are obtained during ART, would enable the usage of these cells in such procedures in daily clinical practice. Thus, the objective of this study was to standardize the freezing protocol for human granulosa cells (GC) for future applications in co-culture systems for follicle and oocyte maturation. Twenty volunteers submitted to ART donated their granulosa cells after oocyte retrieval, 10 were cultivated previously in order to interrupt the luteinization process and then frozen \"Cryostep\" container (group 2C- two cultures) (step 2) and 10 were directly frozen with no previous culture in the \"Cryostep\" container (group DF- direct freeze) (step 3). After thawing these cells were (re)cultured for 144 hours, with medium exchange at 48, 96 and 144 hours to evaluate the estradiol (E2) and progesterone (P4) production (ng/mL). After thawing, there was a reduction in the cell number (p<0,05) and cell viability in both methods, the direct freezing (DF) and the two cultures (2C) (p<0,05); this had an impact in the production of estradiol and progesterone, which were higher in fresh cultures than in the frozen ones (p<0,05). However, the E2/cell ratio was maintained after thawing (p=0.23), suggesting that this impairment in steroid production was probably due to the reduction in the cell count. The cells that survive remain functionally normal. The DF was more efficient since it allowed greater cell recovery and better viability when compared to 2C. The estradiol/progesterone ratio was maintained in all culture times, in the fresh, DF or 2C groups (p>0.05), indicating that the functional characteristic of these cells was preserved post-thawing. We conclude that cryopreservation of human GC obtained during oocyte retrieval compromises the cell count and the overall viability of the culture; however, the functional capacity and the characteristic of these cells are preserved (maintenance of E2/cell and E2/P4 relations)

Maternally supplied mRNAs encode for necessary developmental regulators that pattern early embryos in many species until zygotic transcription is activated. In Caenorhabditis elegans, post-transcriptional regulatory mechanisms guide early development during embryogenesis. Maternal transcripts remain in a translationally silenced state until fertilization. A suite of RNA-binding proteins (RBP’s) regulate these maternally supplied mRNAs during oogenesis, the oocyte-to-embryo transition, and early embryogenesis. Identifying the target specificity of these RNA-binding proteins will reveal their contribution to patterning of the embryo. We are studying post-transcriptional regulation of maternal mRNAs during oocyte maturation, which is an essential part of meiosis that prepares oocytes for fertilization. Although the physiological events taking place during oocyte maturation have been well studied, the molecular mechanisms that regulate oocyte maturation are not well understood. OMA-1 and OMA-2 are essential CCCH-type tandem zinc finger (TZF) RBP’s that function redundantly during oocyte maturation. This dissertation shows that I defined the RNA-binding specificity of OMA-1, and demonstrated that OMA-1/2 are required to repress the expression of 3ʹUTR reporters in developing oocytes. The recovered sequences from in vitro selection demonstrated that OMA-1 binds UAA and UAU repeats in a cooperative fashion. Interestingly, OMA-1 binds with high affinity to a conserved region of the glp-1 3ʹUTR that is rich in UAA and UAU repeats. Multiple RNA-binding proteins regulate translation of GLP-1 protein, a homolog of Notch receptor. In addition to previously identified RBP’s, we showed that OMA-1 and OMA-2 repress glp-1 reporter expression in C. elegans oocytes. Mapping the OMA-1 dependent regulatory sites in the glp-1 mRNA and characterizing the interplay between OMA-1 and other factors will help reveal how multiple regulatory signals coordinate the transition from oocyte to embryo but the abundance of OMA-1 binding motifs within the glp-1 3ʹUTR makes it infeasible to identify sites with a functional consequence. I therefore first developed a strategy that allowed us to generate transgenic strains efficiently using a library adaptation of MosSCI transgenesis in combination with rapid RNAi screening to identify RBP-mRNA interactions with a functional consequence. This allowed me to identify five novel mRNA targets of OMA-1 with an in vivo regulatory connection. In conclusion, the findings in this dissertation provide new insights into OMA-1 mediated mRNA regulation and provide new tools for C. elegans transgenesis. Development of library MosSCI will advance functional mapping of OMA-1 dependent regulatory sites in the target mRNAs. Extending this strategy to map functional interactions between mRNA targets and RNAbinding proteins in will help reveal how multiple regulatory binding events coordinate complex cellular events such as oocyte to embryo transition and cell-fate specification.

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A infertilidade é uma condição clínica que acomete até 15% dos casais em idade reprodutiva. Como forma de tratamento para essa parcela da população a Medicina Reprodutiva dispõe de várias técnicas de Reprodução Assistida que visam auxiliar o casal na obtenção da gestação. O primeiro passo para obtenção de sucesso na Medicina Reprodutiva é o correto diagnóstico da infertilidade e, do ponto de vista didático, as causas de infertilidade podem ser classificadas em: feminina, masculina, mista ou desconhecida. A causa feminina de infertilidade apresenta como importante fator o ovariano, representado, principalmente, por alterações no processo de maturação do oócito e/ou no processo de foliculogênese. Com relação à maturação do oócito, um dos possíveis tratamentos oferecidos pela Medicina Reprodutiva é a aplicação da técnica de maturação in vitro (MIV). Infelizmente a MIV não apresenta resultados animadores, e um dos motivos é a falta de um método adequado de seleção dos gametas de humanos que podem ser destinados à ela. No entanto, várias técnicas de seleção de oóticos já foram descritas para espécies animais; dentre elas destaca-se a coloração dos complexos cumuli-oócitos com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB). A sua aplicação na espécie humana permanece com ressalvas, uma vez que a comunidade científica preocupa-se com os possíveis efeitos tóxicos dessa substância. Nesta Tese, conseguimos demonstrar, através da avaliação de ensaios de viabilidade e de proliferação celular, e da expressão gênica e proteica, a inocuidade dessa substância para o modelo de cultura primária de células foliculares ovarianas luteinizadas, indicando que o protocolo de coloração com BCB é seguro para a espécie humana. Adicionalmente, conseguimos caracterizar e padronizar o cultivo dessas células, que são amplamente utilizadas em estudos na área da Medicina Reprodutiva. Com relação ao outro fator ovariano de infertilidade (o processo de foliculogênese), sabe-se que a depleção acelerada dos folículos ovarianos pode provocar falência ovariana precoce (FOP), uma condição clínica que acomete até 1% das mulheres em idade reprodutiva e leva à infertilidade. Uma das causas da FOP é a alteração no gene Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) e consequentemente em sua proteína (FMRP). Muito do conhecimento do controle dessa proteína provem de experimentos em neurônios, onde o seu controle já foi elucidado. Nesta Tese, conseguimos demonstrar que o controle dessa proteína nas células ovarianas de humanos é similar ao controle que ocorre nos neurônios, envolvendo a via de sinalização S6K. / Infertility is a clinical condition that affects up to 15% of couples of reproductive age. Reproductive medicine applies many assisted reproductive technologies (ARTs) in order to help them to achieve pregnancy. The first step for infertility treatment success is the correct infertility diagnosis, which is divided into four categories: female, male, mixed or unknown. Female infertility is chiefly represented by ovarian dysfunctions, which are generally related to oocyte maturation and/or folliculogenesis. With regard to oocyte maturation, in vitro oocyte maturation (IVM) is one ART that can be applied but, unfortunately, nowadays it does not present suitable results, since we do not have an effective method of selecting competent human oocytes. On the other hand, in animal reproduction brilliant cresyl blue (BCB) staining has already been described as an appropriate method for oocyte selection. However its clinical applicability to humans is some away off, owing to concerns about its safety. In this thesis we have demonstrated (through many cellular viability and proliferation assays and gene and protein expression), that BCB staining, applying the correct protocol, seems to be safe for use in humans (using the primary culture of human ovarian follicular cells as an experimental model). Additionally, we have characterized and standardized the primary culture of human ovarian follicular cells, and this experimental model is widely applied in reproductive medicine experiments. With regard to folliculogenesis, it is well known that premature ovarian failure/insufficiency (POF/POI) is one condition that can be caused by follicle depletion (when folliculogenesis occurs too fast). This condition affects about 1% of females of reproductive age, causing infertility. Genetic alterations, such as in the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene and its protein FMRP, are considered as one cause of POF/POI. Most of our knowledge about FMRP cellular control comes from studies on neurons, and in these cells we have a clue about its control. In this thesis, we have shown that FMRP control on human granulosa cells is similar to its control on neurons, and this involves the S6K pathway.

A infertilidade é uma condição clínica que acomete até 15% dos casais em idade reprodutiva. Como forma de tratamento para essa parcela da população a Medicina Reprodutiva dispõe de várias técnicas de Reprodução Assistida que visam auxiliar o casal na obtenção da gestação. O primeiro passo para obtenção de sucesso na Medicina Reprodutiva é o correto diagnóstico da infertilidade e, do ponto de vista didático, as causas de infertilidade podem ser classificadas em: feminina, masculina, mista ou desconhecida. A causa feminina de infertilidade apresenta como importante fator o ovariano, representado, principalmente, por alterações no processo de maturação do oócito e/ou no processo de foliculogênese. Com relação à maturação do oócito, um dos possíveis tratamentos oferecidos pela Medicina Reprodutiva é a aplicação da técnica de maturação in vitro (MIV). Infelizmente a MIV não apresenta resultados animadores, e um dos motivos é a falta de um método adequado de seleção dos gametas de humanos que podem ser destinados à ela. No entanto, várias técnicas de seleção de oóticos já foram descritas para espécies animais; dentre elas destaca-se a coloração dos complexos cumuli-oócitos com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB). A sua aplicação na espécie humana permanece com ressalvas, uma vez que a comunidade científica preocupa-se com os possíveis efeitos tóxicos dessa substância. Nesta Tese, conseguimos demonstrar, através da avaliação de ensaios de viabilidade e de proliferação celular, e da expressão gênica e proteica, a inocuidade dessa substância para o modelo de cultura primária de células foliculares ovarianas luteinizadas, indicando que o protocolo de coloração com BCB é seguro para a espécie humana. Adicionalmente, conseguimos caracterizar e padronizar o cultivo dessas células, que são amplamente utilizadas em estudos na área da Medicina Reprodutiva. Com relação ao outro fator ovariano de infertilidade (o processo de foliculogênese), sabe-se que a depleção acelerada dos folículos ovarianos pode provocar falência ovariana precoce (FOP), uma condição clínica que acomete até 1% das mulheres em idade reprodutiva e leva à infertilidade. Uma das causas da FOP é a alteração no gene Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) e consequentemente em sua proteína (FMRP). Muito do conhecimento do controle dessa proteína provem de experimentos em neurônios, onde o seu controle já foi elucidado. Nesta Tese, conseguimos demonstrar que o controle dessa proteína nas células ovarianas de humanos é similar ao controle que ocorre nos neurônios, envolvendo a via de sinalização S6K. / Infertility is a clinical condition that affects up to 15% of couples of reproductive age. Reproductive medicine applies many assisted reproductive technologies (ARTs) in order to help them to achieve pregnancy. The first step for infertility treatment success is the correct infertility diagnosis, which is divided into four categories: female, male, mixed or unknown. Female infertility is chiefly represented by ovarian dysfunctions, which are generally related to oocyte maturation and/or folliculogenesis. With regard to oocyte maturation, in vitro oocyte maturation (IVM) is one ART that can be applied but, unfortunately, nowadays it does not present suitable results, since we do not have an effective method of selecting competent human oocytes. On the other hand, in animal reproduction brilliant cresyl blue (BCB) staining has already been described as an appropriate method for oocyte selection. However its clinical applicability to humans is some away off, owing to concerns about its safety. In this thesis we have demonstrated (through many cellular viability and proliferation assays and gene and protein expression), that BCB staining, applying the correct protocol, seems to be safe for use in humans (using the primary culture of human ovarian follicular cells as an experimental model). Additionally, we have characterized and standardized the primary culture of human ovarian follicular cells, and this experimental model is widely applied in reproductive medicine experiments. With regard to folliculogenesis, it is well known that premature ovarian failure/insufficiency (POF/POI) is one condition that can be caused by follicle depletion (when folliculogenesis occurs too fast). This condition affects about 1% of females of reproductive age, causing infertility. Genetic alterations, such as in the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene and its protein FMRP, are considered as one cause of POF/POI. Most of our knowledge about FMRP cellular control comes from studies on neurons, and in these cells we have a clue about its control. In this thesis, we have shown that FMRP control on human granulosa cells is similar to its control on neurons, and this involves the S6K pathway.

A infertilidade é uma condição clínica que acomete até 15% dos casais em idade reprodutiva. Como forma de tratamento para essa parcela da população a Medicina Reprodutiva dispõe de várias técnicas de Reprodução Assistida que visam auxiliar o casal na obtenção da gestação. O primeiro passo para obtenção de sucesso na Medicina Reprodutiva é o correto diagnóstico da infertilidade e, do ponto de vista didático, as causas de infertilidade podem ser classificadas em: feminina, masculina, mista ou desconhecida. A causa feminina de infertilidade apresenta como importante fator o ovariano, representado, principalmente, por alterações no processo de maturação do oócito e/ou no processo de foliculogênese. Com relação à maturação do oócito, um dos possíveis tratamentos oferecidos pela Medicina Reprodutiva é a aplicação da técnica de maturação in vitro (MIV). Infelizmente a MIV não apresenta resultados animadores, e um dos motivos é a falta de um método adequado de seleção dos gametas de humanos que podem ser destinados à ela. No entanto, várias técnicas de seleção de oóticos já foram descritas para espécies animais; dentre elas destaca-se a coloração dos complexos cumuli-oócitos com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB). A sua aplicação na espécie humana permanece com ressalvas, uma vez que a comunidade científica preocupa-se com os possíveis efeitos tóxicos dessa substância. Nesta Tese, conseguimos demonstrar, através da avaliação de ensaios de viabilidade e de proliferação celular, e da expressão gênica e proteica, a inocuidade dessa substância para o modelo de cultura primária de células foliculares ovarianas luteinizadas, indicando que o protocolo de coloração com BCB é seguro para a espécie humana. Adicionalmente, conseguimos caracterizar e padronizar o cultivo dessas células, que são amplamente utilizadas em estudos na área da Medicina Reprodutiva. Com relação ao outro fator ovariano de infertilidade (o processo de foliculogênese), sabe-se que a depleção acelerada dos folículos ovarianos pode provocar falência ovariana precoce (FOP), uma condição clínica que acomete até 1% das mulheres em idade reprodutiva e leva à infertilidade. Uma das causas da FOP é a alteração no gene Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) e consequentemente em sua proteína (FMRP). Muito do conhecimento do controle dessa proteína provem de experimentos em neurônios, onde o seu controle já foi elucidado. Nesta Tese, conseguimos demonstrar que o controle dessa proteína nas células ovarianas de humanos é similar ao controle que ocorre nos neurônios, envolvendo a via de sinalização S6K. / Infertility is a clinical condition that affects up to 15% of couples of reproductive age. Reproductive medicine applies many assisted reproductive technologies (ARTs) in order to help them to achieve pregnancy. The first step for infertility treatment success is the correct infertility diagnosis, which is divided into four categories: female, male, mixed or unknown. Female infertility is chiefly represented by ovarian dysfunctions, which are generally related to oocyte maturation and/or folliculogenesis. With regard to oocyte maturation, in vitro oocyte maturation (IVM) is one ART that can be applied but, unfortunately, nowadays it does not present suitable results, since we do not have an effective method of selecting competent human oocytes. On the other hand, in animal reproduction brilliant cresyl blue (BCB) staining has already been described as an appropriate method for oocyte selection. However its clinical applicability to humans is some away off, owing to concerns about its safety. In this thesis we have demonstrated (through many cellular viability and proliferation assays and gene and protein expression), that BCB staining, applying the correct protocol, seems to be safe for use in humans (using the primary culture of human ovarian follicular cells as an experimental model). Additionally, we have characterized and standardized the primary culture of human ovarian follicular cells, and this experimental model is widely applied in reproductive medicine experiments. With regard to folliculogenesis, it is well known that premature ovarian failure/insufficiency (POF/POI) is one condition that can be caused by follicle depletion (when folliculogenesis occurs too fast). This condition affects about 1% of females of reproductive age, causing infertility. Genetic alterations, such as in the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene and its protein FMRP, are considered as one cause of POF/POI. Most of our knowledge about FMRP cellular control comes from studies on neurons, and in these cells we have a clue about its control. In this thesis, we have shown that FMRP control on human granulosa cells is similar to its control on neurons, and this involves the S6K pathway.

Holothuria scabra est l'holothurie comestible à haute valeur marchande la plus distribuée et la plus exploitée dans l'Indo-Pacifique tropical. Dès lors, et à cause de la demande croissante des pays importateurs et consommateurs, les stocks naturels de l'espèce sont confrontés actuellement un problème de surexploitation. A Madagascar, les situations économique, sociale et politique difficiles ainsi que l'insuffisance d'un plan efficace pour l'aménagement de cette exploitation, rendent la situation plus délicate encore. La surexploitation se traduit par la diminution de la production, la raréfaction de certaines espèces, la dégradation de la qualité du produit et entraîne une forte concurrence entre les exploitants et le non respect de la législation existante. Un plan d'aménagement de cette exploitation est proposé dans ce travail. Celui-ci concerne la gestion de la pêche, la restauration et la pérennisation des stocks naturels, et la valorisation des produits. L'holothuriculture est considérée comme la solution d'avenir pour pallier une demande sans cesse croissante en trépang, restaurer les stocks naturels et sauver les espèces d'holothuries menacées d'extinction. <p>\ / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie animale / info:eu-repo/semantics/nonPublished