El electroencefalograma (EEG) registra la actividad eléctrica del córtex cerebral y su trazado cambia reflejando el efecto de los anestésicos. El límite espectral 95% (LE95%) extraído del EEG mediante análisis espectral, ha sido ampliamente empleado para cuantificar el efecto de fármacos anestésicos (opiáceos e hipnóticos) de forma empírica. El Indice Biespectral linear (L-Bis) obtenido a partir de la aplicación de análisis biespectral y espectral, ha sido empleado también en la cuantificación del efecto de fármacos anestésicos. El parámetro canónico univariante de los opiáceos (PCUopi) ha sido obtenido mediante Correlación Canónica Semilinear para extraer de la señal del EEG la información referente al efecto cortical de los opiáceos. El objetivo de este trabajo es comparar la eficacia del PCUopi como cuantificador del efecto de opiáceos (fentanilo, alfentanilo, sufentanilo, trefentanilo y remifentanilo) e hipnóticos (propofol) sobre el EEG.El registro EEG recogido en diversos estudios previamente realizados, fue digitalizado y analizado de nuevo. Se calculó el PCUopi y el LE95% para cada individuo en cada fármaco opiáceo. Se calculó el PCUopi y el L-Bis para cada individuo en el grupo propofol. Se valoró la capacidad de cada parámetro para extraer del trazado del EEG la información relevante respecto al efecto farmacológico, mediante la comparación del valor de R2 (relación señal-ruido) obtenido con cada parámetro en cada individuo. En segundo lugar se valoró la capacidad de cada parámetro para ser usado como indicador farmacodinámico mediante la estimación de los parámetros farmacodinámicos para cada fármaco estudiado. Finalmente se valoró a priori la capacidad del PCUopi para ser empleado en la clínica en pacientes reales, realizándose para ello simulaciones del curso temporal del efecto farmacológico de cada uno de los opiáceos y del propofol.El PCUopi presentó valores superiores de R2 al LE95% de forma global para todos los opiáceos y de forma individual para todos menos para el sufentanilo. El L-Bis presentó valores de R2 superiores al PCUopi en el caso del propofol. Se estimaron los parámetros farmacodinámicos ke0, C50 y alfa. En base a ello alfentanilo y remifentanilo son los opiáceos con inicio del efecto más rápido tras un bolus,seguidos de trefentanilo, fentanilo y sufentanilo. De acuerdo a sus valores de C50 sufentanilo, fentanilo, remifentanilo, trefentanilo y alfentanilo sería el orden de mayor a menor potencia farmacológica. La desaparición del efecto tras la administración de un bolus es más rápida para remifentanilo, seguido de alfentanilo, trefentanilo, fentanilo y sufentanilo.Empleando un modelo sigmoidal de efecto máximo, el efecto electroencefalográfico del propofol medido con el L-Bis, alcanza su punto máximo aproximadamente 3.75 minutos tras la administración de un bolus. La desaparición del efecto tras una infusión continua es rápida, con una vida media sensible al contexto de alrededor de 5 minutos incluso tras infusiones de duración superior a las 3 horas.Otras simulaciones en las que se ha valorado la evolución del PCUopi en diferentes situaciones clínicas demuestran que a las concentraciones de opiáceo empleadas habitualmente en clínica, los cambios esperados en el PCUopi son mínimos. El PCUopi cambia de forma significativa si las concentraciones de opiáceo son elevadas, en un rango que no se emplea habitualmente en clínica. La presencia de propofol a concentraciones habituales, induce cambios significativos y evidentes en el PCUopi lo que hace pensar que se trata de un parámetro sensible pero poco específico para el efecto de los opiáceos en el entorno clínico.PCUopi permite cuantificar el efecto de los opiáceos y del propofol sobre el EEG. El PCUopi es un descriptor óptimo del efecto de los opiáceos sobre el EEG, estadísticamente superior en su efectividad al LE95%. El L-Bis es un descriptor del efecto electroencefalográfico del propofol superior en eficacia al PCUopi. La integración de modelos farmacocinéticos y farmacodinámicos basados en el EEG como variable subrogada del efecto de opiáceos y propofol permite extraer conclusiones sobre su perfil de uso en clínica.

Los objetivos principales de esta Tesis doctoral fueron: 1) cuantificar los efectos agudos y crónicos de fármacos opiáceos (mi-, delta- y kappa-selectivos) así como los cambios inducidos durante los estados de abstinencia (procesos de tolerancia y dependencia) sobre la vía de señalización del receptor Fas (formas de expresión de Fas, proteína de acople FADD y caspasas efectoras) en cerebro de rata; 2) identificar el tipo de receptor opioide involucrado en la modulación del complejo de señalización Fas/FADD mediante la utilización de ratones deficientes en receptores opioides (mi-, delta- y kappa-KO), e investigar la posible existencia de un tono opioide endógeno regulando las proteínas de esta vía en el cerebro; 3) averiguar si la modulación del complejo Fas y/o FADD por fármacos opiáceos implica (como mecanismo molecular) la participación de MAPK ERK1/2, analizando la reversión de un efecto opioide tras inhibición selectiva de los enzimas MEK1/2, tanto "in vitro" (PD98059) en células SH-SY5Y, como "in vivo" (SL 327) en cerebro de rata; 4) cuantificar en cerebro humano "postmortem" el estatus de la vía Fas/FADD y caspasas efectoras, así como los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC/PKA/CREB) y de las MAPK (Ras/Raf/MEK/ERK) en la corteza prefrontal de adictos a opiáceos, como modelo experimental más directo al problema de la adicción en humanos.Las diversas proteínas de estudio se cuantificaron mediante técnicas inmunológicas cuantitativas (separación electroforética seguida de Western blot) empleando anticuerpos específicos. Los principales resultados y conclusiones mayores de este trabajo de Tesis doctoral son:1. La adicción a opiáceos en cerebro de rata se asocia con incrementos en la densidad del receptor apoptótico Fas y con decrementos de la proteína FADD, transductora de la señal de muerte, sin que además se alteren las caspasas efectoras 8 y 3, lo que sugiere que los procesos de adicción a estos fármacos no están asociados con la inducción de apoptosis cerebral mediados por esta vía.2. La modulación de Fas (receptor nativo) por opiáceos depende mayormente del receptor mi-opioide, y la regulación de sus formas agregadas (trímeros relevantes en el inicio de la señalización) así como la de FADD se asocia con el receptor delta-opioide, lo que demuestra una modulación diferencial de los componentes de esta vía por el sistema opioide que podría tener repercusiones terapéuticas.3. La modulación inhibitoria de FADD por agonistas delta-opiáceos es dependiente, a través de un mecanismo indirecto, de la activación de las quinasas MAPK ERK1/2, vía de señalización que a su vez se ha relacionado con la regulación de varios mecanismos anti-apoptóticos. 4. La adicción a opiáceos en cerebro humano se asocia con una disminución en la densidad de FADD en la corteza prefrontal (efectos a corto y largo plazo) sin que se alteren las diversas formas del receptor Fas y ciertas caspasas efectoras, lo que de nuevo demuestra una probable menor actividad de esta proteína acopladora de Fas en este modelo humano de adicción a opiáceos. 5. La adicción a opiáceos en cerebro humano (efectos a largo plazo) también se asocia con una aparente normalización de los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC I, PKA, CREB y pCREB) y con una marcada inhibición de la vía de las MAPK (formas fosforiladas de MEK y de ERK1/2), lo que sugiere la inducción de alteraciones de plasticidad neuronal en estos cerebros humanos.En su conjunto, los resultados de esta Tesis demuestran la clara participación del complejo Fas/FADD en la adicción a opiáceos, tanto en los procesos de tolerancia como de dependencia física, lo que añade un nuevo nivel de complejidad a la señalización de los receptores opioides, probablemente mediatizando efectos no-apoptóticos relacionados con fenómenos de plasticidad neuronal. / The aim of this PhD work was to investigate the interactions between opioids receptors and the signaling pathway of the Fas/FADD (Fas Associated-Death Domain) receptor, involved in the regulation of apoptosis and neuronal plasticity. The main results and conclusions are: 1) opiate addiction in rat brain is associated with a strong up-regulation of the pro-apoptotic Fas receptor and a moderate down-regulation of the anti-apoptotic Bcl-2 oncoprotein, without altering the content of caspases-8/3, suggesting that possible apoptotic signals engaged by Fas activation would be offset by decreased signal transduction through FADD and effector caspases-8/3; 2) the mi-opioid receptors appears to be associated with a tonic stimulation of monomeric Fas receptor, whereas the delta-opioid receptors tonically inhibits the basal density of trimeric Fas as well as that of FADD. This suggests posible homeostatic interactions between mi- and delta-opioid receptors in the control of Fas receptor machinery, being a major task of the delta-receptor to restrain the activation of Fas signalling; 3) the direct involvement of the two MAP kinases (sequential activation of MEK and ERK) in the in vivo regulation of FADD by the opiate; 4) opiate addiction in human brain is associated with a down-regulation of the inmunodensity of FADD in the prefrontal cortex (short-term and long-term abuse) without altering Fas receptor and effector caspases-8/3; 5) opiate addiction in human brain (long-term abuse) is associated with a normal regulation of the components of the cyclic AMP pathway components (AC I, PKA, CREB, pCREB) and with an important down-regulation of the MAPK (specially pMEK and pERK) pathway components in the prefrontal cortex, suggesting alterations in the neuronal plasticity in those human brains. In summary, the results of this PhD work demonstrated a clear participation of the complex Fas/FADD in opiate addiction, suggesting a new level of complexity in the signaling mediated through the activation of opioids receptors, probably mediating non-apoptotic effects related with neuronal plasticity.