Universiẗat, Diss., 2001--München.

University, Diss., 2000--Osnabrück.

Universiẗat, Diss., 1992--Paderborn.

Würzburg, Univ., Diss., 2005.

Universiẗat, Diss., 2001--Tübingen.

University, Diss., 2003--Heidelberg.

Single molecule localization microscopy has seen a remarkable growth since its first experimental implementations about a decade ago. Despite its technical challenges, it is already widely used in medicine and biology and is valued as a unique tool to gain molecular information with high specificity. However, common illumination techniques do not allow the use of single molecule sensitive super-resolution microscopy techniques such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) for whole cell imaging. In addition, they can potentially alter the quantitative information. In this thesis, I combine dSTORM imaging in three dimensions with lattice lightsheet illumination to gain quantitative molecular information from cells unperturbed by the illumination and cover slip effects. Lattice light-sheet illumination uses optical lattices for beam shaping to restrict the illumination to the detectable volume. I describe the theoretical background needed for both techniques and detail the experimental realization of the system as well as the software that I developed to efficiently evaluate the data. Eventually, I will present key datasets that demonstrate the capabilities of the developed microscope system with and without dSTORM. My main goal here was to use these techniques for imaging the neural cell adhesion molecule (NCAM, also known as CD56) in whole cells. NCAM is a plasma membrane receptor known to play a key role in biological processes such as memory and learning. Combining dSTORM and lattice light-sheet illumination enables the collection of quantitative data of the distribution of molecules across the whole plasma membrane, and shows an accumulation of NCAM at cell-cell interfaces. The low phototoxicity of lattice light-sheet illumination further allows for tracking individual NCAM dimers in living cells, showing a significant dependence of its mobility on the actin skeleton of the cell. / Die Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie hat seit der ersten experimentellen Umsetzung vor etwa 10 Jahren einen bemerkenswerten Aufschwung erfahren. Trotz des hohen technischen Anspruchs findet sie bereits weite Verbreitung in der Biologie und Medizin und wird als einzigartiges Werkzeug geschätzt, um molekulare Information mit hoher Spezifität zu erlangen. Dennoch erschweren die gebräuchlichen Beleuchtungsmethoden die Anwendung von Methoden der Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie wie dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) auf das Volumen ganzer Zellen, denn hier kann die Beleuchtung selbst die quantitativen Daten beeinflussen. In dieser Arbeit kombiniere ich dreidimensionale dSTORM-Bildgebung mit Gitterlichtblattbeleuchtung (engl. lattice light-sheet illumination) um quantitative, molekulare Information ohne durch die Beleuchtung verursachte Störungen zu gewinnen. Die Gitterlichtblattbeleuchtung nutzt optische Gitter zur Strahlformung, um das beleuchtete Volumen auf das detektierbare Volumen zu beschränken. Ich stelle den nötigen, theoretischen Hintergrund für beide Methoden dar und beschreibe die experimentelle Umsetzung sowie die von mir zur effizienten Datenauswertung entwickelte Software. Schließlich präsentiere ich verschiedene Datensätze, die die Fähigkeiten des Systems mit und ohne dSTORM demonstrieren. Mein Hauptziel war hierbei, beide Methoden zu nutzen, um das neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM, engl. neural cell adhesion molecule) in ganzen Zellen abzubilden. NCAM (auch bekannt als CD56) ist ein Rezeptor auf der Plasmembran, der für seine Schlüsselrolle im Zusammenhang mit biologischen Prozessen wie Lernen und Gedächtnis bekannt ist. Die Kombination von dSTORM und Gitterlichtblattbeleuchtung ermöglicht das sammeln quantitativer Daten der Verteilung über die komplette Plasmamembran, wobei sich eine Akkumulation an Zell-Zell Kontaktflächen zeigt. Die niedrige Photoschädigung der Gitterlichtblattbeleuchtung ermöglicht weiterhin das Verfolgen von einzelnen NCAM-Dimeren in lebenden Zellen. Dort zeigt sich eine signifikante Abhängigkeit ihrer Mobilität vom Aktinskelett der Zelle.

Der Schwerpunkt der vorliegenden kumulativen Dissertation ist die optische Untersuchung von funktionalen Ribletstrukturen und die Entwicklung eines optischen Sensors zur Erfassung von funktionskritischen Formabweichungen. Ein Teil dieser Arbeit ist in den im Anhang aufgeführten Publikationen bereits veröffentlicht. In Kapitel 2 werden die Untersuchungen zur Licht-Materie-Wechselwirkung mit der Ribletstruktur vorgestellt. Im Mittelpunkt steht dabei zunächst die Entwicklung eines experimentellen Aufbaus zur Charakterisierung der Struktur und insbesondere zur Detektion von Degradationen im Sub-Mikrometerbereich, wie sie im Einsatz an Flugzeugoberflächen zu erwarten ist. Der Aufbau besteht aus einer Lichtquelle und drei Detektionseinheiten, die bei senkrechtem Lichteinfall die resultierende Streuung der Ribletstruktur in Richtung 0° und ±45° aufnehmen. Es werden Anforderungen an die Lichtquelle des Sensors bestimmt, darunter Werte für Mindest- und Maximalintensität für ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis, eine senkrechte Lichtpolarisation, Strahldurchmesser von 1 mm bis 1,5 mm und es wird der geringe Einfluss von Wellenlänge und Strahldivergenz gezeigt. Darüber hinaus werden ultrakurze Laserpulse im Ribletsensor eingesetzt und die Verwendung im Kontext der Qualitätskontrolle diskutiert. Hierbei wird insbesondere der Einfluss von Pulsdauer und Bandbreite von linear gechirpten Pulsen auf die Entstehung eines stationären Interferenzmusters im 45°-Signal untersucht. Die Ergebnisse von Experimenten und Simulation zeigen übereinstimmend, dass der Interferenzkontrast entscheidend von der zeitlichen und spektralen Überlagerung der bei Reflexion an den Ribletflanken gegeneinander verzögerten Teilpulse abhängt. Es ist möglich, durch geeignete Wahl der Pulsparameter die Entstehung eines Interferenzmusters zu kontrollieren. Im Sensor ist ein glattes Signal in Richtung ±45° vorteilhaft und ermöglicht die Detektion mittels Photodiodenarrays ohne Fehler aufgrund des Moiré-Effekts. Ein weiteres Thema dieser Arbeit ist die Untersuchung der Streueigenschaften von Titandioxid-Nanopartikeln in Kapitel 3. Es wird die Messmethode der diffusen Reflektanz, sowie die Auswertung mittels Tauc-Plot vorgestellt. Mithilfe dessen wird die Bandlückenenergie der untersuchten Rutil- und Anatas-Nanopartikel mit E(Rutil) = 3.04 eV und E(Anatas) = 3.19 eV bestimmt, welche mit den Literaturwerten übereinstimmen. Mithilfe dieser Werte kann eine untere Grenze des Wellenlängenbereichs bestimmt werden, in dem Untersuchungen der nichtlinearen diffusen Femtosekunden-Reflektometrie zuverlässig ausgewertet werden können. Die Ergebnisse dieser Messmethode zeigen die Frequenzkonversionseigenschaften der Nanopartikel und eignen sich als Unterscheidungsmerkmal von polaren und unpolaren Kristallstrukturen.

Time-resolved optical spectroscopy has become an important tool to investigate the dynamics of quantum mechanical processes in matter. In typical applications, a first “pump” pulse excites the system under investigation from the thermal equilibrium to an excited state, and a second variable time-delayed “probe” pulse then maps the dynamics of the excited system. Although advanced nonlinear techniques have been developed to investigate, e.g., coherent quantum effects, all of these techniques are limited in their spatial resolution. The laser focus diameter has a lower bound given by Abbe’s diffraction limit, which is roughly half the optical excitation wavelength—corresponding to about 400nm in the presented experiments. In the time-resolved experiments that have been suggested so far, averaging over the sample volume within this focus cannot be avoided. In this thesis, two approaches were developed to overcome the diffraction limit in optical spectroscopy and to enable the investigation of coherent processes on the nanoscale. In the first approach, analytic solutions were found to calculate optimal polarizationshaped laser pulses that provide optical near-field pump–probe pulse sequences in the vicinity of a nanostructure. These near-field pulse sequences were designed to allow excitation of a quantum system at one specific position at a certain time and probing at a different position at a later time. In the second approach, the concept of coherent two-dimensional (2D) spectroscopy, which has had great impact on the investigation of coherent quantum effects in recent years, was combined with photoemission electron microscopy, which yields a spatial resolution well below the optical diffraction limit. Using the analytic solutions, optical near fields were investigated in terms of spectroscopic applications. Near fields that are excited with polarization-shaped femtosecond laser pulses in the vicinity of appropriate nanostructures feature two properties that are especially interesting in the view of spectroscopic applications: On the one hand, control of the spatial distribution of the optical fields is achieved on the order of nanometers. On the other hand, the temporal evolution of these fields can be adjusted on the order of femtoseconds. In this thesis, solutions were found to calculate the optimal polarizationshaped laser pulses that control the near field in a general manner. The main idea to achieve this deterministic control was to disentangle the spatial and temporal near-field control. First, the spatial distribution of the optical near field was controlled by assigning the correct state of polarization for each frequency within the polarization-shaped laser pulse independently. The remaining total phase—not employed for spatial control—was then used for temporal near-field compression, which, in experimental applications, would lead to an enhancement of the nonlinear signal at the respective location. In contrast to the use of optical near fields, where pump–probe sequences themselves are localized below the diffraction limit and the detection does not have to provide the spatial resolution, a different approach was suggested in this thesis to gain spectroscopic information on the nanoscale. The new method was termed “Coherent two-dimensional (2D) nanoscopy” and transfers the concept of “conventional” coherent 2D spectroscopy to photoemission electron microscopy. The pulse sequences used for the investigation of quantum systems in this method are still limited by diffraction. However, the new key concept is to detect locally generated photoelectrons instead of optical signals. This yields a spatial resolution that is well below the optical diffraction limit. In “conventional” 2D spectroscopy a triple-pulse sequence initiates a four wave mixing process that creates a coherence. In a quantum mechanical process, this coherence is converted into a population by emission of an electric field, which is measured in the experiment. Contrarily, in the developed 2D nanoscopy, four-wave mixing is initiated by a quadruple-pulse sequence, which leaves the quantum system in an electronic population. This electronic population carries coherent information about the investigated quantum system and can be mapped with a spatial resolution down to a few nanometers given by the spatial resolution of the photoemission electron microscope. Hence, 2D nanoscopy can be considered a generalization of time-resolved photoemission experiments. In the future, it may be of similar beneficial value for the field of photoemission research as “conventional” 2D spectroscopy has proven to be for optical spectroscopy and nuclear magnetic resonance experiments. In a first experimental implementation of coherent 2D nanoscopy coherent processes on a corrugated silver surface were measured and unexpected long coherence lifetimes could be determined. / Zur Untersuchung von Dynamiken quantenmechanischer Prozesse in Materie hat sich die zeitaufgelöste optische Spektroskopie zu einem zentralen Werkzeug entwickelt. Eine Standardmethode ist hierbei die Anrege-Abfrage-Spektroskopie. Bei solch einem Experiment wird das zu untersuchende System zunächst mit einem Anregepuls aus dem thermischen Gleichgewicht in einen höheren Zustand angeregt. Anschließend untersucht man mit einem zweiten zeitverzögerten Abfragepuls die Dynamik des angeregten Systems. Obwohl fortgeschrittene experimentelle Methoden entwickelt wurden um kohärente Quanteneffekte zu untersuchen, sind all diese Experimente nach wie vor in ihrer räumlichen Auflösung begrenzt. Aufgrund von Beugung ist der Fokus eines Laserstrahls limitiert. Diese untere Grenze ist durch Abbe’s Auflösungsgrenze gegeben und entspricht etwa der Hälfte der optischen Anregungswellenlänge, d.h. etwa 400nm in den hier vorgestellten Experimenten. Daher kann eine Mittelung über das Probenvolumen, gegeben durch die Fokusgröße, in den bisher vorgestellten Experimenten nicht vermieden werden. In dieser Arbeit wurden zwei Ansätze verfolgt, um die Beugungsgrenze in der optischen Spektroskopie zu überwinden und die Untersuchung von kohärenten Prozessen auf der Nanometerskala zu ermöglichen. Im ersten Ansatz wurden analytische Lösungen gefunden, um optimal polarisationsgeformte Laserpulse zu berechnen, die optische Anrege-Abfrage-Nahfeld-Pulsfolgen in der Nähe einer Nanostruktur ermöglichen. Diese Nahfeld-Pulsfolgen wurden entwickelt, um ein quantenmechanisches System an einer bestimmten Position zu einem bestimmten Zeitpunkt anzuregen und an einer anderen Position zu einem späteren Zeitpunkt abzufragen. Im zweiten Ansatz wurde das Konzept der kohärenten zweidimensionalen (2D) Spektroskopie, die in den letzten Jahren großen Einfluss auf die Untersuchung von kohärenten Quanteneffekten gehabt hat, mit Photoelektronenmikroskopie kombiniert. Letztere ermöglicht eine räumliche Auflösung deutlich unter der optischen Auflösungsgrenze. Mit Hilfe der analytischen Lösungen wurden optische Nahfelder in Bezug auf spektroskopische Anwendungen untersucht. Nahfelder, die mit polarisationsgeformten Femtosekunden-Laserpulsen in der Nähe von entsprechenden Nanostrukturen angeregt werden, verfügen über zwei Eigenschaften, die besonders interessant für spektroskopische Anwendungen sind: Zum einen kann die räumliche Verteilung der optischen Felder auf der Größenordnung von Nanometern kontrolliert werden. Zum anderen kann die zeitliche Entwicklung dieser Felder in der Größenordnung von Femtosekunden manipuliert werden. In dieser Arbeit wurden Lösungen gefunden, um optimale polarisationsgeformte Laserpulse zu berechnen, die diese Nahfeld-Steuerung in einer allgemeinen Art und Weise erlauben. Die Hauptidee, um diese deterministische Steuerung zu erreichen, war die räumliche und zeitliche Nahfeld-Kontrolle zu entkoppeln. Zuerst wurde dafür die räumliche Verteilung der optischen Nahfelder durch die Zuordnung des korrekten Polarisationszustandes für jede Frequenz, innerhalb des polarisationsgeformten Laserpulses, unabhängig gesteuert. Die verbleibende totale Phase, die nicht für die räumliche Kontrolle benötigt wird, wurde dann verwendet um den nichtlinearen Fluss an den gewünschten Positionen durch zeitliche Nahfeldkomprimierung zu erhöhen. Im Gegensatz zur Verwendung von optischen Nahfeldern, in der die Anrege-Abfrage-Nahfeld-Pulsfolgen selbst unter dem Beugungslimit lokalisiert sind und die Detektion nicht räumlich aufgelöst sein muss, wurde in dieser Arbeit noch ein anderer Ansatz vorgeschlagen, um spektroskopische Informationen auf der Nanometerskala zu erhalten. Die neue Methode wurde als „kohärente zweidimensionale (2D) Nanoskopie“ beschrieben und überträgt das Konzept der „herkömmlichen“ kohärenten 2D Spektroskopie auf die Photoemissionselektronenmikroskopie. In dieser neuen Methode ist die räumliche Auflösung der zur Untersuchung des quantenmechanischen Sytems erforderlichen Pulssequenzen zwar durch Beugung begrenzt. Die wesentliche Neuerung ist allerdings, lokal erzeugte Photoelektronen anstelle von optischen Signalen zu messen. Daraus ergibt sich eine räumliche Auflösung, die weit unterhalb der optischen Beugungsgrenze liegt. Die photoemittierten Elektronen tragen dann kohärente Information über das untersuchte System und können mit einer räumlichen Auflösung von wenigen Nanometern abgebildet werden. Die Auflösung ist dabei durch das verwendete Photoemissionsmikroskop vorgegeben. Demzufolge kann 2D Nanoskopie als eine Verallgemeinerung der zeitaufgelösten Photoemissionsexperimente gesehen werden. In einer ersten experimentellen Umsetzung der kohärenten 2D Nanoskopie wurden kohärente Prozesse auf einer rauhen Silberoberfläche untersucht und dabei unerwartet langlebige Kohärenzen gemessen.

The Aurora Borealis is the visible manifestation of the complex plasma interaction between the solar wind and the Earth's magnetosphere and ionosphere. Ground based and in situ measurements demonstrate a prevalence of dynamic fine structure within auroral displays, with spatial scales down to tens of metres and time variations occurring on a fraction of a second.The fine-scale morphology is related to structuring of auroral currents and electric fields and detailed spatial, spectral and temporal observations of the aurora are crucial in understanding the electrodynamic processes taking place in the ionosphere and in its coupling to the magnetosphere. In this thesis, the low-light optical instrument ASK (Auroral Structure and Kinetics) is used to image small-scale structures in the aurora at very high spatial and temporal resolution. ASK is a multi-spectral instrument, imaging the aurora in three selected emissions simultaneously. This provides information on the energy of the precipitating electrons. The SIF (Spectrographic Imaging Facility) instrument has been used in conjunction with ASK, to give a more complete picture of the spectral characteristics of the aurora, and to determine the degree of contaminating emissions present in the same spectral interval as the emission lines observed by ASK. Data from ASK and SIF are used to study the relation between the morphology and dynamics of small-scale structures in the aurora and the energy of the precipitating electrons. By comparing electron density profiles provided by EISCAT (European Incoherent SCATter) radar measurements with modeling results, information on the characteristic energy and the energy flux of the precipitating electrons can be obtained. One of the ASK channels is imaging a metastable O+ emission, which has a lifetime of about 5 s. By tracing the afterglow in this channel optically a direct measure of the E x B drift is obtained from which the local ionospheric electric field can be calculated. ASK data has also been used to analyse the properties of a distorted auroral arc, in which auroral structuring was found to take place simultaneously at different spatial scales. The smallest features, 'ruffs', are undulations found to develop on the edge of an auroral curl, fold or shear. Detailed optical studies of black aurora, including both the type which is associated with plasma shear motions and no or weak shear motions were conducted from ASK data, to investigate the spectral properties and fine scale morphology of the black structures and to shed light on the processes behind this phenomenon. / QC 20101001