Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A estimulação elétrica de baixa intensidade (EE) tem sido utilizada para o reparo ósseo, mas pouco se sabe sobre seus efeitos no tecido ósseo após a menopausa. Os osteócitos provavelmente desempenham um importante papel mediando este estímulo físico, e poderiam agir como transdutores através da liberação de sinais bioquímicos como o óxido nítrico (NO). O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da EE no metabolismo ósseo de ratas ovarectomizadas, e se o NO poderia ser um mediador destes efeitos. Sessenta ratas (200-220g) foram divididas em 6 grupos: SHAM; SHAM tratado com 6mg/d de L-NAME, um inibidor da NO sintase (SHAM-L-NAME); ovarectomizado (OVX); OVX tratado com L-NAME (OVX-L-NAME) ou submetido a uma estimulação elétrica no corpo todo do animal (OVX-EE) ou ambos (OVX-EE-L-NAME) por 12 semanas. A densidade mineral óssea (DMO) global, de coluna e membro posterior foram medidas através de densitometria óssea antes e ao final do protocolo. Após o sacrifício, as tíbias foram retiradas para análises histomorfométricas e imunohistoquímicas. A apoptose de osteócitos (técnicas de caspase-3 e TUNEL) e expressões da NO sintase endotelial (eNOS) e indutível (iNOS) foram analisadas por imunohistoquímica. As ratas OVX demonstraram significante (p<0.05 vs SHAM) diminuição da DMO final global, de coluna e de membro posterior, medidas por densitometria, redução de volume ósseo (10% vs 25%) e número de trabéculas (1.7 vs 3.9), e aumento das superfícies de reabsorção (4.7% vs 3.2%) e mineralização (15.9% vs 7.7%), medidas por histomorfometria. No entanto, após a EE, todos estes parâmetros foram semelhantes aos valores do grupo SHAM e significantemente diferentes de OVX. A EE não foi capaz de prevenir a redução de volume ósseo e número de trabéculas causadas pela OVX na presença de L-NAME (OVX-L-NAME vs OVXEE-L-NAME), como o fez na ausência deste inibidor da NOS. Porém, o L-NAME não bloqueou os efeitos da EE na reabsorção óssea (superfícies de reabsorção e de osteoclastos) em ratas OVX. A eNOS e iNOS foram: expressas de forma semelhante no córtex das tíbias de SHAM, não expressas em OVX, e similarmente expressas em OVX-EE quando comparadas ao SHAM. As expressões de eNOS e iNOS não foram detectadas no tecido ósseo de nenhum grupo tratado com L-NAME. Nas ratas OVX, a porcentagem de osteócitos apoptóticos (24%) foi significantemente maior do que em SHAM (11%) e OVX-EE (8%). Todos os grupos tratados com L-NAME tiveram uma diminuição na porcentagem de osteócitos apoptóticos. Assim, nosso estudo evidenciou que a EE previne alguns efeitos causados pela OVX no tecido ósseo preservando a DMO, estrutura e microarquitetura ósseas, expressão de eNOS e iNOS e viabilidade de osteócitos. Além disso, foi demonstrado que o L-NAME bloqueia parcialmente os efeitos da EE na estrutura óssea (mas não na reabsorção) e na expressão de eNOS e iNOS em ratas OVX, sugerindo que o NO possa ser um mediador dos efeitos positivos da EE no tecido ósseo. No entanto, não foi possível identificar se os efeitos positivos da EE na viabilidade de osteócitos foram mediados pelo NO, pois os efeitos do L-NAME nestas células foram semelhantes àqueles causados pela EE. / Low Intensity Electrical Stimulation (LIES) has been used for bone repair but little is known about its effects on bone after menopause. Osteocytes probably play a role in mediating this physical stimulus and they could act as transducers through the release of biochemical signals, such as nitric oxide (NO). The aim of the present study was to investigate the effects of LIES on bone metabolism in ovariectomized rats, and if NO could be a mediator of these effects. Sixty rats (200-220g) were divided into 6 groups: SHAM; SHAM treated with 6mg/d of LNAME, an inhibitor of NO synthase (SHAM-L-NAME); ovariectomized (OVX); OVX treated with L-NAME (OVX-L-NAME) or subjected to a whole body electrical stimulation (OVX-LIES) or both (OVX-LIES-L-NAME) for 12 weeks. Global, spine and posterior limb bone mineral density (BMD) were measured by bone densitometry before and at the end of protocol. After sacrifice, tibias were collected for histomorphometric and immunohistochemistry analysis. Osteocyte apoptosis (caspase-3 and TUNEL techniques) and expressions of endothelial NO synthase (eNOS) and inducible NOS (iNOS) were assessed by immunostaining. OVX rats showed significant (p<0.05 vs SHAM) decreased final global, spine and limb BMDs, measured by densitometry, decreased bone volume (10% vs 25%) and trabecular number (1.7 vs 3.9), and increased eroded surfaces (4.7% vs 3.2%) and mineralization surfaces (15.9% vs 7.7%), measured by histomorphometry. In contrast, after LIES, all these parameters tended to be similar to SHAM and significantly different from OVX. LIES was not able to prevent the reduction of bone volume and trabecular number caused by OVX in the presence of L-NAME (OVX-L-NAME vs OVX-LIES-L-NAME), as it did in the absence of this NOS inhibitor. However, L-NAME did not block the effects of LIES on bone resorption (eroded surface and osteoclasts surface) in OVX rats. eNOS and iNOS were: similarly expressed in tibiae cortices of SHAM, not expressed in OVX and correspondingly expressed in OVX+LIES when compared to SHAM. eNOS and iNOS expressions were not detected on bone of none of L-NAME treated groups. In OVX, the percentage of apoptotic osteocytes (24%) was significantly increased when compared to SHAM (11%) and OVX-LIES (8%). All LNAME treated groups showed a diminished percentage of apoptotic osteocytes. In conclusion, our study showed that LIES counteracts some effects of OVX on bone tissue preserving BMD, bone structure and microarchitecture, iNOS and eNOS expression and osteocyte viability. Moreover, it was demonstrated that L-NAME partially blocks the effects of LIES on bone structure (but not on bone resorption) and on iNOS and eNOS expressions in OVX rats, suggesting that NO may be a mediator of the positive effects of LIES on bone. However, it was not possible to identify if the known positive effects of LIES on osteocyte viability were mediated by NO, since the effects of L-NAME on these cells were similar to those caused by LIES. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo que desempenha funções essenciais para a sobrevivência do indivíduo, sendo composto predominantemente por osteócitos. Dentre os tecidos mineralizados do corpo, o cemento é um dos menos estudados e compreendidos. A apoptose em células do tecido ósseo têm sido relatada após o uso de Tiazolidinedionas (TZD), uma classe de medicamentos utilizada no tratamento do diabetes melitus tipo 2, representadas pela Rosiglitazona. Assim, os objetivos desse estudo foram: avaliar, in vivo, um protocolo de administração sistêmica da Rosiglitazona em camundongos a fim de estimular a apoptose de osteócitos em maxilares; o efeito da apoptose de osteócitos induzida por Rosiglitazona na formação e progressão de lesões periapicais em camundongos nos períodos experimentais de 7, 21 e 42 dias; e demonstrar a ocorrência de apoptose em cementócitos de camundongos os quais receberam ou não a Rosiglitazona. Foram utilizados camundongos wild type (C57BL/6) com 4 a 5 semanas de idade. No primeiro estudo, a etapa 1 foi realizada para definição de protocolo de administração sistêmica da Rosiglitazona para indução de apoptose em maxilares de camundongos. Os animais (n=24) receberam a Rosiglitazona via oral por 1, 2 ou 3 semanas (gavagem, dose de 10mg/kg) ou não (PBS+10%DMSO). Foram utilizadas as técnicas de TUNEL e DAPI para quantificação de células apoptóticas. Posteriormente, na etapa 2, lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de camundongos wild type (C57BL/6) (n=60) após a administração ou não da Rosiglitasona. A câmara pulpar dos dentes foi exposta à microbiota da cavidade bucal pelos períodos de 7, 21 e 42 dias e os grupos foram divididos da seguinte forma: G1) veículo + lesão 7 dias; G2) veículo + lesão 21 dias; G3) veículo + lesão 42 dias; G4) TZD + lesão 7 dias; G5) TZD + lesão 21 dias; G6) TZD + lesão 42 dias. Foram realizadas avaliações em microscopia convencional para análise descritiva das lesões periapicais; microscopia de fluorescência para mensuração das lesões periapicais; histoenzimologia para a atividade da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e marcação de osteoclastos; absortometria radiológica de dupla energia (DXA) para avaliação da densidade mineral óssea (DMO) em osso longo e análise da expressão gênica de marcadores de osteócitos (Sost, Hyou1 e Dmp1). No segundo estudo, foram utilizadas as técnicas de TUNEL e DAPI para quantificação de cementócitos apoptóticos em dentes de camundongos wild type (n=12) que receberam ou não a Rosiglitazona. Na etapa 1 do primeiro estudo, pôde-se observar que a administração sistêmica da Rosiglitazona por 2 semanas promoveu a apoptose de osteócitos de forma mais expressiva quando comparada ao período de 1 semana, porém sem diferença significativa com o período de 3 semanas (p>0,05). Já na etapa 2, nos grupos os quais receberam a Rosiglitazona, pôde-se observar uma tendência a lesões periapicais maiores, porém sem diferença estatisticamente significante em comparação com animais que não receberam esse medicamento (p>0,05), além de promover, aos 21 dias de progressão da lesão periapical, maior número de osteoclastos e maior expressão dos genes Sost e Hyou1, sem diferença estatisticamente significante para a expressão do gene Dmp1, bem como na DMO dos fêmures. Adicionalmente, no segundo estudo, foi observado que, em camundongos que receberam a Rosiglitazona por 2 semanas, os cortes histológicos corados em TUNEL e DAPI demonstraram maior razão de cementócitos apoptóticos/cementócitos totais comparado ao grupo controle. Após as metodologias empregadas e os parâmetros analisados, pôde-se concluir que o uso sistêmico da Rosiglitazona estimulou a apoptose de osteócitos e cementócitos interferindo na formação e progressão de lesões periapicais em camundongos. / The bone tissue is a specialized type of connective tissue that provides essential functions for the survival of the individual, composed predominantly of osteocytes. Among the mineralized tissues in the body, the cementum is one of the most poorly studied and understood. Apoptosis in the bone tissue have been reported after the use of Thiazolidinediones (TZD), a class of drugs used in the treatment of diabetes mellitus type 2, represented by Rosiglitazone. Thus, the aims of this study were: evaluate, in vivo, a protocol for systemic administration of Rosiglitazone in mice in order to stimulate the apoptosis of osteocytes in jaws; the effect of apoptosis of osteocytes induced by Rosiglitazone in the formation and progression of periapical lesions in mice in the experimental periods of 7, 21 and 42 days; and demonstrate the occurrence of apoptosis in cementocytes of mice which received or not the Rosiglitazone. We used mice wild type (C57BL/6) with 4 to 5 weeks of age. In the first study, the phase 1 was performed for the protocol definition of systemic administration of Rosiglitazone for induction of apoptosis in mice jaws. The animals (n=24) received the Rosiglitazone orally for 1, 2 or 3 weeks (gavage, dose of 10mg/kg) or not (PBS+10%DMSO). We used the techniques of TUNEL and DAPI for quantification of apoptotic cells. Subsequently, in phase 2, periapical lesions were induced in the first lower molars of wild type (C57BL/6) mice (n=60) after the administration or not of Rosiglitasone. The pulp chamber was exposed to the oral microbiota during 7, 21 and 42 days, and the groups were divided as follows: G1) vehicle + periapical lesions 7 days; G2) vehicle + periapical lesions 21 days; (G3) vehicle + periapical lesions 42 days; (G4) TZD + periapical lesions 7 days; G5) TZD + periapical lesions 21 days; (G6) TZD + periapical lesions 42 days. Evaluations were conducted in conventional microscopy for descriptive analysis of periapical lesions; fluorescence microscopy for measurement of periapical lesions; histoenzimology to the activity of acid phosphatase resistant tartrate (TRAP) for osteoclasts measurement; dual-energy x-ray absorptiometry (DXA) for evaluation of bone mineral density (BMD) in long bone and analysis of gene expression of osteocytes markers (Sost, Hyou1 and Dmp1). In the second study, TUNEL and DAPI techniques were used for the quantification of apoptotic cementocytes in wild type (n = 12) mice that received Rosiglitazone or not. In the phase 1 of the first study it was observed that the systemic administration of Rosiglitazone for 2 weeks showed the apoptosis of osteocytes in a more expressive manner when compared to the period of 1 week with no significant difference with the period of 3 weeks (p>0,05). On phase 2, in the groups which received the Rosiglitazone, it was observed a tendency of larger periapical lesions, but without statistically significant difference compared with animals that did not receive this drug (p>0,05), besides promoting, at 21 days of periapical lesion progression, greater number of osteoclasts and greater expression of genes Sost and Hyou1, and absence of statistically significant differences in the expression of the gene Dmp1 nor in the BMD of the femurs. In addition, in the second study, it was observed that, in mice that received the Rosiglitazone for 2 weeks, sections stained by TUNEL and DAPI showed significantly higher ratio of apoptotic cementocytes/total cementocytes compared to control group. After the methodologies used and the parameters analyzed, it can be concluded that the systemic use of Rosiglitazone stimulated the apoptosis of osteocytes and cementocytes interfering in the formation and progression of periapical lesions in mice.

O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo que desempenha funções essenciais para a sobrevivência do indivíduo, sendo composto predominantemente por osteócitos. Dentre os tecidos mineralizados do corpo, o cemento é um dos menos estudados e compreendidos. A apoptose em células do tecido ósseo têm sido relatada após o uso de Tiazolidinedionas (TZD), uma classe de medicamentos utilizada no tratamento do diabetes melitus tipo 2, representadas pela Rosiglitazona. Assim, os objetivos desse estudo foram: avaliar, in vivo, um protocolo de administração sistêmica da Rosiglitazona em camundongos a fim de estimular a apoptose de osteócitos em maxilares; o efeito da apoptose de osteócitos induzida por Rosiglitazona na formação e progressão de lesões periapicais em camundongos nos períodos experimentais de 7, 21 e 42 dias; e demonstrar a ocorrência de apoptose em cementócitos de camundongos os quais receberam ou não a Rosiglitazona. Foram utilizados camundongos wild type (C57BL/6) com 4 a 5 semanas de idade. No primeiro estudo, a etapa 1 foi realizada para definição de protocolo de administração sistêmica da Rosiglitazona para indução de apoptose em maxilares de camundongos. Os animais (n=24) receberam a Rosiglitazona via oral por 1, 2 ou 3 semanas (gavagem, dose de 10mg/kg) ou não (PBS+10%DMSO). Foram utilizadas as técnicas de TUNEL e DAPI para quantificação de células apoptóticas. Posteriormente, na etapa 2, lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de camundongos wild type (C57BL/6) (n=60) após a administração ou não da Rosiglitasona. A câmara pulpar dos dentes foi exposta à microbiota da cavidade bucal pelos períodos de 7, 21 e 42 dias e os grupos foram divididos da seguinte forma: G1) veículo + lesão 7 dias; G2) veículo + lesão 21 dias; G3) veículo + lesão 42 dias; G4) TZD + lesão 7 dias; G5) TZD + lesão 21 dias; G6) TZD + lesão 42 dias. Foram realizadas avaliações em microscopia convencional para análise descritiva das lesões periapicais; microscopia de fluorescência para mensuração das lesões periapicais; histoenzimologia para a atividade da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e marcação de osteoclastos; absortometria radiológica de dupla energia (DXA) para avaliação da densidade mineral óssea (DMO) em osso longo e análise da expressão gênica de marcadores de osteócitos (Sost, Hyou1 e Dmp1). No segundo estudo, foram utilizadas as técnicas de TUNEL e DAPI para quantificação de cementócitos apoptóticos em dentes de camundongos wild type (n=12) que receberam ou não a Rosiglitazona. Na etapa 1 do primeiro estudo, pôde-se observar que a administração sistêmica da Rosiglitazona por 2 semanas promoveu a apoptose de osteócitos de forma mais expressiva quando comparada ao período de 1 semana, porém sem diferença significativa com o período de 3 semanas (p>0,05). Já na etapa 2, nos grupos os quais receberam a Rosiglitazona, pôde-se observar uma tendência a lesões periapicais maiores, porém sem diferença estatisticamente significante em comparação com animais que não receberam esse medicamento (p>0,05), além de promover, aos 21 dias de progressão da lesão periapical, maior número de osteoclastos e maior expressão dos genes Sost e Hyou1, sem diferença estatisticamente significante para a expressão do gene Dmp1, bem como na DMO dos fêmures. Adicionalmente, no segundo estudo, foi observado que, em camundongos que receberam a Rosiglitazona por 2 semanas, os cortes histológicos corados em TUNEL e DAPI demonstraram maior razão de cementócitos apoptóticos/cementócitos totais comparado ao grupo controle. Após as metodologias empregadas e os parâmetros analisados, pôde-se concluir que o uso sistêmico da Rosiglitazona estimulou a apoptose de osteócitos e cementócitos interferindo na formação e progressão de lesões periapicais em camundongos. / The bone tissue is a specialized type of connective tissue that provides essential functions for the survival of the individual, composed predominantly of osteocytes. Among the mineralized tissues in the body, the cementum is one of the most poorly studied and understood. Apoptosis in the bone tissue have been reported after the use of Thiazolidinediones (TZD), a class of drugs used in the treatment of diabetes mellitus type 2, represented by Rosiglitazone. Thus, the aims of this study were: evaluate, in vivo, a protocol for systemic administration of Rosiglitazone in mice in order to stimulate the apoptosis of osteocytes in jaws; the effect of apoptosis of osteocytes induced by Rosiglitazone in the formation and progression of periapical lesions in mice in the experimental periods of 7, 21 and 42 days; and demonstrate the occurrence of apoptosis in cementocytes of mice which received or not the Rosiglitazone. We used mice wild type (C57BL/6) with 4 to 5 weeks of age. In the first study, the phase 1 was performed for the protocol definition of systemic administration of Rosiglitazone for induction of apoptosis in mice jaws. The animals (n=24) received the Rosiglitazone orally for 1, 2 or 3 weeks (gavage, dose of 10mg/kg) or not (PBS+10%DMSO). We used the techniques of TUNEL and DAPI for quantification of apoptotic cells. Subsequently, in phase 2, periapical lesions were induced in the first lower molars of wild type (C57BL/6) mice (n=60) after the administration or not of Rosiglitasone. The pulp chamber was exposed to the oral microbiota during 7, 21 and 42 days, and the groups were divided as follows: G1) vehicle + periapical lesions 7 days; G2) vehicle + periapical lesions 21 days; (G3) vehicle + periapical lesions 42 days; (G4) TZD + periapical lesions 7 days; G5) TZD + periapical lesions 21 days; (G6) TZD + periapical lesions 42 days. Evaluations were conducted in conventional microscopy for descriptive analysis of periapical lesions; fluorescence microscopy for measurement of periapical lesions; histoenzimology to the activity of acid phosphatase resistant tartrate (TRAP) for osteoclasts measurement; dual-energy x-ray absorptiometry (DXA) for evaluation of bone mineral density (BMD) in long bone and analysis of gene expression of osteocytes markers (Sost, Hyou1 and Dmp1). In the second study, TUNEL and DAPI techniques were used for the quantification of apoptotic cementocytes in wild type (n = 12) mice that received Rosiglitazone or not. In the phase 1 of the first study it was observed that the systemic administration of Rosiglitazone for 2 weeks showed the apoptosis of osteocytes in a more expressive manner when compared to the period of 1 week with no significant difference with the period of 3 weeks (p>0,05). On phase 2, in the groups which received the Rosiglitazone, it was observed a tendency of larger periapical lesions, but without statistically significant difference compared with animals that did not receive this drug (p>0,05), besides promoting, at 21 days of periapical lesion progression, greater number of osteoclasts and greater expression of genes Sost and Hyou1, and absence of statistically significant differences in the expression of the gene Dmp1 nor in the BMD of the femurs. In addition, in the second study, it was observed that, in mice that received the Rosiglitazone for 2 weeks, sections stained by TUNEL and DAPI showed significantly higher ratio of apoptotic cementocytes/total cementocytes compared to control group. After the methodologies used and the parameters analyzed, it can be concluded that the systemic use of Rosiglitazone stimulated the apoptosis of osteocytes and cementocytes interfering in the formation and progression of periapical lesions in mice.