Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Texto parcialmente disponibilizado pelo autor. Conteúdo restrito: Apêndices. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-26T15:02:39Z No. of bitstreams: 1 2017_DonaldManigat_PARCIAL.pdf: 621102 bytes, checksum: 1f0b1edf50dddf5686b5208b044257b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-11T18:31:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DonaldManigat_PARCIAL.pdf: 621102 bytes, checksum: 1f0b1edf50dddf5686b5208b044257b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-11T18:31:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DonaldManigat_PARCIAL.pdf: 621102 bytes, checksum: 1f0b1edf50dddf5686b5208b044257b7 (MD5) Previous issue date: 2017-08-11 / A identificação e caracterização de moléculas capazes de modular a resposta inflamatória pulpar, facilitando ou mesmo promovendo o reparo dentinário oferecem imenso potencial para aumentar o sucesso na manutenção da vitalidade do dente. Neste sentido, os receptores gama e beta/delta ativados por proliferadores peroxissomais (PPARγ e PPAR β/δ), por apresentarem efeitos anti-inflamatórios, configuram-se como alvos farmacológicos potenciais. Enquanto a expressão do PPAR β/δ e sua participação na fisiopatologia pulpar ainda não foram exploradas, a capacidade do PPARγ em modular alguns aspectos inflamatórios em células da polpa já foi demonstrada. Porém, aspectos celulares relacionados com o reparo dentinário não foram avaliados. Assim, como objetivo da primeira parte deste trabalho, investigou-se o efeito da rosiglitazona (RSG), um agonista total do PPARγ sobre a viabilidade (MTT), apoptose (anexina-V FITC /iodeto de propídeo), migração (scratch) e diferenciação osteo/odontogênica de células da polpa dentária humana (vermelho de alizarina S e expressão gênica). Os resultados mostraram que RSG não interferiu na viabilidade, na apoptose ou na migração de células pulpares. Quanto a diferenciação, os resultados com coloração indicaram que RSG estimulou formação precoce de matriz mineralizada e a análise da expressão gênica revelou um aumento significativo da expressão de osteopontina nos grupos tratados com RSG. Como objetivos da segunda parte, a expressão do PPAR β/δ por células pulpares foi verificada (RT-PCRq e imunofluorescência). Posteriormente, essas células foram tratadas com LPS (Escherichia coli) ou H2O2 e o potencial do GW0742, agonista total do PPAR β/δ, em modular a inflamação foi explorado, por meio de análise da expressão gênica de citocinas e metaloproteinases (RT-PCRq), por análise da atividade de gelatinases (zimografia) e por ensaio de quimiotaxia com cocultura em transwell, sendo macrófagos murinos imortalizados RAW 264.7 as células submetidas a atração quimiotática por células pulpares. Células RAW 264.7 também foram estimuladas com LPS e a expressão gênica de citocinas inflamatórias foi analisada (RT-PCRq). Por fim, o efeito do GW0742 sobre o reparo começou a ser investigado neste estudo, por meio da análise da migração de células pulpares (scracth). Os resultados mostraram expressão de PPAR β/δ (transcrito e proteína). O tratamento com GW0742 reprimiu a expressão do RNAm de IL6, IL1β , MCP1 e MMP1 em células pulpares estimuladas com LPS ou H2O2, e de Il6 e Tnfα em células RAW 264.7 estimuladas com LPS. GW0742 reduziu a atividade de MMP2 e de MMP9, em células pulpares estimuladas com 2μg/mL ou 10 μg/mL de LSP, respectivamente. Além disso, o tratamento com GW0742 reduziu significativamente a capacidade de células pulpares estimuladas com LPS em recrutar macrófagos RAW 264.7. Por fim, GW0742 não interferiu na migração de células pulpares. Os resultados da primeira parte deste trabalho sugerem que RSG parece não alterar eventos celulares relacionados com o reparo dentinário. Quanto a segunda parte, esta indica que GW0742 possa modular a resposta inflamatória pulpar, sugerindo um efeito anti-inflamatório do receptor PPAR β/δ ativado. / Identification and characterization of molecules able to dampen inflammatory events within the dental pulp, facilitating or even promoting dentinal repair offer immense potential to increase the success in maintaining the tooth vitality. Due to anti-inflammatory properties, the peroxisome proliferator-activated receptors gamma and beta/dela (PPARγ and PPAR β/δ) could be envisioned as putative therapeutic targets. While neither PPAR β/δ expression nor its participation within the pulp pathophysiology were explored, the ability of PPARγ to modulate some inflammatory aspects in pulp cells has been demonstrated previously. However, cellular aspects related to dentine repair were not assessed. Thus, the aim of the first part of this study was to evaluate the effects of rosiglitazone (RSG), a PPARγ full agonist, on human dental pulp cells (hDPCs) viability (MTT), apoptosis (annexin-V FITC and propidium iodide), migration (scratch) and osteo/odontogenic differentiation (alizarin red and RT-qPCR). RSG did not affect cell viability, apoptosis/necrosis or cell migration. Whereas, alizarin red S showed that RSG stimulated early formation of mineralized matrix. Gene expression analysis revealed a significant increase in osteopontina mRNA expression at the RSG-treated groups. As the aim of the second part of this study, hDPCs PPAR β/δ expression was verified (RT-qPCR; immunofluorescence). Thereafter, hDPCs were treated with LPS or H2O2, and the anti-inflammatory ability of GW0742, a PPAR β/δ full agonist, was assessed by cytokine and metalloproteinases mRNA expression assay (RT-qPCR), gelatinase activity assay (zymography), and chemotaxis assay with transwell co-culture. In this system, an immortalized murine macrophage cell line, RAW 264.7, was attracted by hDPCs. In addition, RAW 264.7 cells were treated with LPS and GW0742, and cytokines mRNA expression was assessed (RT-qPCR). Finally, the effect of GW0742 on pulp repair was initiated through hDPCs migration assay (scracth). The results showed hDPCs PPAR β/δ expression (transcript and protein). GW0742 repressed IL6, IL1β, MCP1 and MMP1 gene expression in LPS/H2O2 treated hDPCs. Il6 and Tnfα mRNA expression was repressed by GW0742 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. GW0742 reduced MMP2 and MMP9 activity in pulp cells stimulated with 2μg / mL or 10μg / mL of LSP, respectively. In addition, treatment with GW0742 significantly reduced the ability of LPS-stimulated pulp cells to recruit RAW 264.7 macrophages. Finally, GW0742 did not impair hDPCs migration. The results of the first part of this study suggested that RSG appear does not impair cellular events related with dentin repair. The second part indicates that GW0742 can modulate pulp inflammatory response, suggesting an anti-inflammatory effect of activated PPARβ/δ receptor.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:42Z : No. of bitstreams: 1 Publico-095b.pdf: 1249697 bytes, checksum: 8c8ce9855784ad0a5e4eeb7a1f312da1 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:42Z : No. of bitstreams: 2 Publico-095b.pdf: 1249697 bytes, checksum: 8c8ce9855784ad0a5e4eeb7a1f312da1 (MD5) Publico-095c.pdf: 915902 bytes, checksum: 72ec65580d60438f4e985c3ef18b5040 (MD5) / O presente estudo tem como objetivo avaliar, em pacientes com a síndrome dos ovários policísticos, os efeitos clínicos, endócrinos e metabólicos da rosiglitazona, antes e após doze semanas de tratamento. Foram avaliados, além do padrão menstrual e do hiperandrogenismo, o perfil hormonal (FSH, LH, 17 beta-estradiol, testosterona total e livre, 17 hidroxiprogesterona, sulfato de dehidroepiandrosterona), os níveis séricos de IGF-1, IGFBP-3, SHBG (globulina ligadora de hormônios sexuais), as repercussões no risco cardiovascular (circunferência abdominal, HDL-colesterol, triglicérides, pressão arterial sistêmica, glicemia e insulina), o fluxo sangüíneo dos ovários pela ultrassonografia transvaginal e os aspectos histomorfológicos do endométrio após o tratamento. O estudo foi prospectivo, randomizado, duplo-cego e controlado com placebo. Foram incluídas 33 pacientes, subdivididas em dois grupos: 1) Grupo Placebo (XZ), com 17 pacientes e 2) Grupo Rosiglitazona (ZX), com 16 pacientes, que fizeram uso de uma cápsula de 4 mg, por via oral, duas vezes ao dia, por 12 semanas. Concluímos que o tratamento com rosiglitazona por três meses determinou: 1) melhora do padrão menstrual e dos sintomas e sinais clínicos relacionados com o hiperandrogenismo; 2) redução dos níveis de testosterona livre, androstenediona e do fator de crescimento insulinóide tipo 1; 3) elevação dos índices da proteína carreadora de esteróides sexuais (SHBG); 4) melhora da resistência insulínica, evidenciada pela sobrecarga glicêmica de 2 horas; 5) redução do número de mulheres com síndrome metabólica e 6) predomínio de endométrio secretor. Não houve variação significante do volume e do fluxo ovariano após o tratamento com rosiglitazona. Sugere-se que a rosiglitazona constitui alternativa para a correção da resistência insulínica, diminuindo a ocorrência de síndrome metabólica. Além disso, melhora o padrão menstrual e o hiperandrogenismo. / The objectives of the present study are to evaluate the clinical, endocrine and metabolic effects of the rosiglitazone in patients with polycystic ovarian syndrome before and after twelve weeks of treatment. It was be evaluated, besides menstrual pattern and the hyperandrogenism, the hormonal profile (FSH, LH, 17 B-estradiol, total and free testosterone, 17 hydroxiprogesterone, dehudroepiandrosterone sulphate) and the seric levels of IGF-1, IGFBP-3, SHBG (globulin that links sexual hormones); examine the repercussions of cardiovascular risk (abdominal circumference, HDLs cholesterol, triglycerides, systemic arterial pressure, glycemy and insulin); verify thru transvaginal ultrasonography, the ovary blood flow and the endometrial histomorphologic aspects after treatment. The study was prospective, randomized, doubleblinded, using placebo as control. 33 patients were included and divided in two groups 1) Placebo Group (XZ), with 17 patients and 2) Rosiglitazone Group (ZX), with 16 patients, who used a capsule with 4mg, oral way, twice a day, for 12 weeks. We concluded that the treatment with rosiglitazone during three months determined: 1) improved the menstrual pattern and the symptoms and clinic signs related with hyperandrogenism; 2) a decrease in androstenedione, free testosterone and type 1 growth factor insulinoid values; 3) increase of the sexual steroids carry protein (SHBG) index; 4) improvement of the insulinic resistance, shown by the 2 hours glycemic overload; 5) a number reduction of women with metabolic syndrome and 6) the endometrium secrecy pattern got predominant. No significance variation in ovarian volume and flow were found after treatment with rosiglitazone. It’s suggested that rosiglitazone is a alternative way to correct insulinic resistance, decreasing the occurrence of the metabolic syndrome. Besides, it increases the menstrual pattern and hyperandrogenism. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A resistência à insulina está associada com o aumento do teor de gordura intramiocelular (GIMC) e com níveis séricos da adiponectina (ADP) diminuídos. A ADP por sua vez está envolvida na oxidação de gordura muscular. Entretanto, a relação entre ambas continua controversa. O objetivo deste estudo é explorar a relação entre a ADP e a GIMC em adultos não diabéticos, além de estudar o papel da rosiglitasona (RSG) sobre a distribuição da gordura entre os compartimentos musculares. Este estudo compreende duas fases: uma fase transversal (corte-transversal) e uma fase longitudinal, de intervenção terapêutica com uma droga, num desenho aberto. Laboratório de Pesquisas Clínicas e Experimentais em Biologia Vascular (Biovasc) - UERJ. Material e métodos Na fase transversal, 24 pacientes obesos, não diabéticos, com síndrome metabólica (SM) e 9 controles magros e saudáveis foram estudados. Foi realizada a Espectroscopia de Prótons por Ressonância Nuclear Magnética (1H-ERNM) para quantificar a gordura extramiocelular (GEMC) e a GIMC. Estas, associadas à ADP e aos parâmetros antropométricos e bioquímicos, foram avaliadas e comparadas nos dois grupos. Durante a fase longitudinal, 15 destes pacientes foram reestudados, através da 1H-ERNM, após o tratamento com RSG por 6 meses. Da mesma forma, as variáveis antropométricas e metabólicas foram reavaliadas. Fase transversal: os pacientes com SM apresentaram maior índice de massa corporal (IMC), cintura abdominal, relação cintura-quadril (RCQ), e níveis de glicemia, insulina e triglicerídeos e menores níveis de HDL-c, quando comparados com o grupo controle. Da mesma forma o HOMA-RI [3.25 (2.58-4.13) vs 1.02 (0.73-1.29); p<0.0001] e a GIMC [266.1 (189.9-296.3) vs 72.85 (55.3-109.4) unidades arbitrárias-UA, p<0.0001] estavam aumentados enquanto o QUICKI [0.32 (0.31-0.33) vs 0.38 (0.37-0.40); p<0.0001] e a ADP [8.6 (4.05-15.95) vs 21.1 (12.9-24.4) &#956;g/ml; p=0.02) estavam diminuídos. O teor de GIMC associou-se diretamente com a glicose, insulina, triglicerídeos e HOMA-RI e inversamente com o HDL-c, QUICKI e, mais importantemente, com a ADP (r = -0.41; p<0.05). Fase longitudinal: após o tratamento com RSG, o peso corporal e a circunferência do quadril aumentaram, respectivamente [100.9 (91.12-138.7) vs 107,0 (79.6-142.8) kg e 118 (107-126) cm vs 122 (110-131) cm]; enquanto a RCQ diminuiu [0.93 (0.87-1.00) vs 0.89 (0.82-0.97); P<0.001 para todos]. Adicionalmente, a glicemia, a insulina e o HOMA-RI diminuíram significativamente, enquanto a ADP aumentou mais de 3 vezes [9.7 (3.7-17.7) vs 38.0 (19.3-42.4) &#956;g/ml]. Finalmente, a GIMC não se modificou [267.54 (213.94-297.94) vs 305.75 (230.80-424.75) UA], mas a GEMC aumentou de forma significativa [275.53 (210.39-436.66) vs 411.39 (279.92-556.59) UA; P<0.01] diminuindo a razão GIMC sobre GEMC [GIMC/GEMC; 1.07 (0.78-1.23) vs. 0.71 (0.53-0.96); p<0.01]. A ADP correlacionou-se inversamente com o teor da GIMC em adultos obesos não diabéticos com SM. Este achado tem possíveis implicações para o papel da ADP na oxidação da gordura muscular, na RI e na SM. O tratamento com RSG aumentou a massa corporal e a circunferência do quadril e diminuiu a RCQ. Além disso, diminuiu a razão GIMC/GEMC, por aumentar a GEMC sem alterar significativamente a GIMC. Isto sugere que este medicamento pode prevenir a deposição da gordura no compartimento intramiocelular ao aumentar os depósitos periféricos e o extramiocelular. / Insulin resistance (IR) is associated with intramyocellular lipid (IMCL) content and low serum adiponectin (ADP) levels. ADP is also involved in muscle fat oxidation but the relationship between them is still controversial. We aimed to further explore the relationship between ADP and IMCL content in non-diabetic adults and the role of rosiglitazone (RSG) in muscle fat compartment distribution in an adult population of obese nondiabetic metabolic syndrome patients. This study comprises two phases: a cross-sectional and a longitudinal, open-label, drug-interventional one. Laboratory for Clinical and Experimental Research on Vascular Biology (Biovasc) at the State University of Rio de Janeiro. During the cross-sectional phase, 24 obese, nondiabetic patients with metabolic syndrome (MS) and 9 lean healthy controls were studied. Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMRS) was performed to quantify IMCL, as well as extramyocellular lipid (EMCL) content. The latter plus serum ADP, anthropometrics and biochemical parameters were evaluated and compared in these two groups. During the longitudinal phase, fifteen of the MS patients were studied by means of 1HNMRS before and after treatment with 8mg/day of RSG for 6 months. Anthropometrical and metabolic variables were assessed. Measurements and main results cross-sectional phase: MS patients had higher body mass index (BMI), waist, waist-to-hip ratio (WHR), glucose, insulin and triglycerides and lower HDL-c as compared to controls. HOMA-IR (3.25 [2.58-4.13] vs 1.02 [0.73-1.29]; p<0.0001) and IMCL content (266.1 [189.9-296.3] vs 72.85 [55.3-109.4) AU, p<0.0001] were higher, and QUICKI (0.32 [0.31-0.33] vs 0.38 [0.37-0.40]; p<0.0001) and ADP (8.6 [4.05-15.95] vs 21.1 [12.9-24.4] &#956;g/ml; p=0.02) lower in MS compared to controls. IMCL content was directly associated with glucose, insulin, triglycerides and HOMAxiii IR and inversely to HDLc, QUICKI and, more importantly, with ADP (r = -0.41; p<0.05). Longitudinal phase: After RSG treatment, body weight and hip circumference increased [100.9 (91.12-138.7) vs 107,0 (79.6-142.8) kg and 118 (107-126) cm vs 122 (110-131) cm] respectively, while WHR decreased [0.93 (0.87-1.00) vs 0.89 (0.82-0.97); P<0.001 for all]. Additionally, fasting plasma glucose, insulin and HOMA-IR significantly decreased while adiponectin increased over 3 fold [9.7 (3.7-17.7) vs 38.0 (19.3-42.4) &#956;g/ml]. Finally, IMCL did not change [267.54 (213.94-297.94) vs 305.75 (230.80-424.75) arbitrary units (AU)] while EMCL increased [275.53 (210.39-436.66) vs 411.39 (279.92-556.59) AU; P<0.01] therefore decreasing IMCL to EMCL ratio (IMCL/EMCL) [1.07 (0.78-1.23) vs. 0.71 (0.53-0.96); p<0.01]. ADP is inversely related to IMCL content in non-diabetic adults. This finding has possible implications for the role of ADP in muscle fat oxidation, IR and MS. RSG treatment increased body weight and hip circumference decreasing WHR and decreased IMCL/EMCL ratio by increasing EMCL without any significant change on IMCL, thus suggesting that this drug may prevent IMCL fat deposition by increasing EMCL and peripheral deposits.

A resistência à insulina está associada com o aumento do teor de gordura intramiocelular (GIMC) e com níveis séricos da adiponectina (ADP) diminuídos. A ADP por sua vez está envolvida na oxidação de gordura muscular. Entretanto, a relação entre ambas continua controversa. O objetivo deste estudo é explorar a relação entre a ADP e a GIMC em adultos não diabéticos, além de estudar o papel da rosiglitasona (RSG) sobre a distribuição da gordura entre os compartimentos musculares. Este estudo compreende duas fases: uma fase transversal (corte-transversal) e uma fase longitudinal, de intervenção terapêutica com uma droga, num desenho aberto. Laboratório de Pesquisas Clínicas e Experimentais em Biologia Vascular (Biovasc) - UERJ. Material e métodos Na fase transversal, 24 pacientes obesos, não diabéticos, com síndrome metabólica (SM) e 9 controles magros e saudáveis foram estudados. Foi realizada a Espectroscopia de Prótons por Ressonância Nuclear Magnética (1H-ERNM) para quantificar a gordura extramiocelular (GEMC) e a GIMC. Estas, associadas à ADP e aos parâmetros antropométricos e bioquímicos, foram avaliadas e comparadas nos dois grupos. Durante a fase longitudinal, 15 destes pacientes foram reestudados, através da 1H-ERNM, após o tratamento com RSG por 6 meses. Da mesma forma, as variáveis antropométricas e metabólicas foram reavaliadas. Fase transversal: os pacientes com SM apresentaram maior índice de massa corporal (IMC), cintura abdominal, relação cintura-quadril (RCQ), e níveis de glicemia, insulina e triglicerídeos e menores níveis de HDL-c, quando comparados com o grupo controle. Da mesma forma o HOMA-RI [3.25 (2.58-4.13) vs 1.02 (0.73-1.29); p<0.0001] e a GIMC [266.1 (189.9-296.3) vs 72.85 (55.3-109.4) unidades arbitrárias-UA, p<0.0001] estavam aumentados enquanto o QUICKI [0.32 (0.31-0.33) vs 0.38 (0.37-0.40); p<0.0001] e a ADP [8.6 (4.05-15.95) vs 21.1 (12.9-24.4) &#956;g/ml; p=0.02) estavam diminuídos. O teor de GIMC associou-se diretamente com a glicose, insulina, triglicerídeos e HOMA-RI e inversamente com o HDL-c, QUICKI e, mais importantemente, com a ADP (r = -0.41; p<0.05). Fase longitudinal: após o tratamento com RSG, o peso corporal e a circunferência do quadril aumentaram, respectivamente [100.9 (91.12-138.7) vs 107,0 (79.6-142.8) kg e 118 (107-126) cm vs 122 (110-131) cm]; enquanto a RCQ diminuiu [0.93 (0.87-1.00) vs 0.89 (0.82-0.97); P<0.001 para todos]. Adicionalmente, a glicemia, a insulina e o HOMA-RI diminuíram significativamente, enquanto a ADP aumentou mais de 3 vezes [9.7 (3.7-17.7) vs 38.0 (19.3-42.4) &#956;g/ml]. Finalmente, a GIMC não se modificou [267.54 (213.94-297.94) vs 305.75 (230.80-424.75) UA], mas a GEMC aumentou de forma significativa [275.53 (210.39-436.66) vs 411.39 (279.92-556.59) UA; P<0.01] diminuindo a razão GIMC sobre GEMC [GIMC/GEMC; 1.07 (0.78-1.23) vs. 0.71 (0.53-0.96); p<0.01]. A ADP correlacionou-se inversamente com o teor da GIMC em adultos obesos não diabéticos com SM. Este achado tem possíveis implicações para o papel da ADP na oxidação da gordura muscular, na RI e na SM. O tratamento com RSG aumentou a massa corporal e a circunferência do quadril e diminuiu a RCQ. Além disso, diminuiu a razão GIMC/GEMC, por aumentar a GEMC sem alterar significativamente a GIMC. Isto sugere que este medicamento pode prevenir a deposição da gordura no compartimento intramiocelular ao aumentar os depósitos periféricos e o extramiocelular. / Insulin resistance (IR) is associated with intramyocellular lipid (IMCL) content and low serum adiponectin (ADP) levels. ADP is also involved in muscle fat oxidation but the relationship between them is still controversial. We aimed to further explore the relationship between ADP and IMCL content in non-diabetic adults and the role of rosiglitazone (RSG) in muscle fat compartment distribution in an adult population of obese nondiabetic metabolic syndrome patients. This study comprises two phases: a cross-sectional and a longitudinal, open-label, drug-interventional one. Laboratory for Clinical and Experimental Research on Vascular Biology (Biovasc) at the State University of Rio de Janeiro. During the cross-sectional phase, 24 obese, nondiabetic patients with metabolic syndrome (MS) and 9 lean healthy controls were studied. Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMRS) was performed to quantify IMCL, as well as extramyocellular lipid (EMCL) content. The latter plus serum ADP, anthropometrics and biochemical parameters were evaluated and compared in these two groups. During the longitudinal phase, fifteen of the MS patients were studied by means of 1HNMRS before and after treatment with 8mg/day of RSG for 6 months. Anthropometrical and metabolic variables were assessed. Measurements and main results cross-sectional phase: MS patients had higher body mass index (BMI), waist, waist-to-hip ratio (WHR), glucose, insulin and triglycerides and lower HDL-c as compared to controls. HOMA-IR (3.25 [2.58-4.13] vs 1.02 [0.73-1.29]; p<0.0001) and IMCL content (266.1 [189.9-296.3] vs 72.85 [55.3-109.4) AU, p<0.0001] were higher, and QUICKI (0.32 [0.31-0.33] vs 0.38 [0.37-0.40]; p<0.0001) and ADP (8.6 [4.05-15.95] vs 21.1 [12.9-24.4] &#956;g/ml; p=0.02) lower in MS compared to controls. IMCL content was directly associated with glucose, insulin, triglycerides and HOMAxiii IR and inversely to HDLc, QUICKI and, more importantly, with ADP (r = -0.41; p<0.05). Longitudinal phase: After RSG treatment, body weight and hip circumference increased [100.9 (91.12-138.7) vs 107,0 (79.6-142.8) kg and 118 (107-126) cm vs 122 (110-131) cm] respectively, while WHR decreased [0.93 (0.87-1.00) vs 0.89 (0.82-0.97); P<0.001 for all]. Additionally, fasting plasma glucose, insulin and HOMA-IR significantly decreased while adiponectin increased over 3 fold [9.7 (3.7-17.7) vs 38.0 (19.3-42.4) &#956;g/ml]. Finally, IMCL did not change [267.54 (213.94-297.94) vs 305.75 (230.80-424.75) arbitrary units (AU)] while EMCL increased [275.53 (210.39-436.66) vs 411.39 (279.92-556.59) AU; P<0.01] therefore decreasing IMCL to EMCL ratio (IMCL/EMCL) [1.07 (0.78-1.23) vs. 0.71 (0.53-0.96); p<0.01]. ADP is inversely related to IMCL content in non-diabetic adults. This finding has possible implications for the role of ADP in muscle fat oxidation, IR and MS. RSG treatment increased body weight and hip circumference decreasing WHR and decreased IMCL/EMCL ratio by increasing EMCL without any significant change on IMCL, thus suggesting that this drug may prevent IMCL fat deposition by increasing EMCL and peripheral deposits.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Prorgama de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-03-26T16:34:53Z No. of bitstreams: 1 2015_FloraAparecidaMilton.pdf: 14443405 bytes, checksum: 2f69813bfbeca0cccbad7f9286096b83 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2015-05-04T13:51:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FloraAparecidaMilton.pdf: 14443405 bytes, checksum: 2f69813bfbeca0cccbad7f9286096b83 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-04T13:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FloraAparecidaMilton.pdf: 14443405 bytes, checksum: 2f69813bfbeca0cccbad7f9286096b83 (MD5) / A prevalência de obesidade, associada à resistência insulínica e diabetes tipo 2 vem aumentando nas últimas décadas. As tiazolidinadionas (TZDs) são agonistas do receptor gama ativado por proliferadores peroxissomais (PPARγ) com eficiente ação sensibilizadora da insulina. Contudo, o uso das TZDs está associado a efeitos adversos como o ganho de peso, retenção de líquido, edema, insuficiência cardíaca congestiva e perda óssea. GQ-16 é um agonista parcial e específico do PPARγ que melhorou a tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina de camundongos submetidos a dieta hiperlipidica de forma semelhante à rosiglitazona, mas, ao contrário dessa, não induziu ganho de peso ou edema. Considerando que um dos principais alvos farmacológicos das TZDs é o tecido adiposo, o objetivo desse estudo foi determinar o efeito de GQ-16 no transcriptoma de adipócitos 3T3-L1 maduros e comparar sua ação com a da rosiglitazona. A análise realizada pela técnica de microarranjo revelou que esses ligantes modificam a expressão gênica de forma diferenciada. Enquanto a rosiglitazona modificou a expressão de 1156 genes, GQ-16 regulou a expressão de apenas 89. Dos 544 genes regulados positivamente pela rosiglitazona (47%), somente 22 (4,2%) foram regulados pelo GQ-16. No mesmo sentido, dos 612 genes regulados negativamente pela rosiglitazona (53%), apenas 24 (4%) foram reprimidos pelo GQ-16. Assim, 46 genes foram regulados simultaneamente pela rosiglitazona e GQ-16, ou seja, uma concordância de somente 4%. Além disso, GQ-16 regulou a expressão de 43 genes (18 ativados e 25 reprimidos) não controlados pela rosiglitazona. A maior semelhança entre o GQ-16 e a rosiglitazona foi sobre a repressão de genes relacionados à resposta inflamatória como o Dcn, Vcam1, Orm2 e Lox, por exemplo. A comparação do GQ-16 com outros agonistas parciais de PPARγ (MRL24 e SR1664) revelou efeitos similares, tanto sobre os genes ativados quanto os reprimidos. Nós propomos que o reduzido efeito sobre genes relacionados à adipogênese e a habilidade do GQ-16 em reprimir eficientemente alguns genes responsivos ao PPARγ relacionados ao processo inflamatório, podem contribuir para o efeito sistêmico sobre a sensibilidade à insulina sem ganho de peso. Novos estudos são necessários para examinar se as similaridades entre a regulação transcricional do GQ-16 e da rosiglitazona estariam envolvidos no efeito terapêutico do GQ-16. / The prevalence of obesity associated with increased insulin resistance and type 2 diabetes has been increasing in the last decades. Thiazolidinediones (TZDs) are peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) agonists that improve insulin resistance. However, TZDs have well-established side effects such as weight gain, fluid retention and edema, congestive heart failure and bone loss. GQ-16 is a specific PPARγ partial agonist that improves glucose tolerance and insulin sensitivity in a murine model of obesity and diabetes similarly to rosiglitazone, but does so without inducing weight gain or edema. Since one of the main pharmacological targets of TZDs is adipocyte tissue, the aim of this study was to determine how GQ- 16 influences PPARγ activity at the transcriptome wide level on PPARγ-dependent gene expression in mature 3T3-L1 adipocytes and also to compared these effects with rosiglitazone. Microarray analysis revealed these ligands modify gene expression in a different manner. Rosiglitazone changed the expression of 1156 genes whereas GQ-16 only changed the expression of 89 genes. Of the 544 genes upregulated by rosiglitazone (47%), only 22 (4.2%) were also regulated by GQ-16. Similarly, of the 612 genes repressed by rosiglitazone (53%), only 24 (4%) were by GQ-16. Therefore, just 46 genes were regulated by both ligands. Furthermore, GQ- 16 regulated the expression of 43 genes (18 activated and 25 repressed) that were not controlled by rosiglitazone. Whereas GQ-16 showed weak effects upon most rosiglitazone regulated genes, a subset of weakly rosiglitazone induced and strongly rosiglitazone repressed genes displayed disproportionately stronger responses to GQ-16. The greatest similarity between GQ-16 and rosiglitazone was upon repressed genes related to inflammatory response such as Dcn, Vcam, Orm2 and Lox, for example. Comparison of GQ-16 with other PPARγ partial agonists (MRL24 and SR1664) revealed similar effects on transcriptional repression. We propose that the ability of GQ-16 displays a continuum of partial agonist effects and that the ability of GQ-16 to efficiently repress some PPARγ responsive genes may partly explain systemic effects on insulin sensitivity without weight gain. Further studies are necessary to examine whether the similarities between transcriptional regulation of GQ-16 and rosiglitazone were involved in the therapeutic effect of GQ-16.

As tiazolidinedionas (TZDs), ligantes sintéticos dos receptores nucleares PPAR&gamma;, têm sido amplamente utilizadas no tratamento da resistência à insulina, dislipidemias e síndrome metabólica. Estas drogas melhoram a homeostase da glicose promovendo redistribuição de gordura dos estoques viscerais para o subcutâneos, aumento da secreção de adiponectina, redução da lipemia, lipotoxicidade e da inflamação do tecido adiposo. Um estudo recente mostrou que o tratamento de ratos com a TZD rosiglitazona (RSG) induz um aumento na atividade dos complexos 1 e 2 da mTOR, que desempenham função importante no controle do metabolismo lipídico, adiposidade e função endócrina do tecido adiposo. Assim, o presente estudo teve como objetivo central elucidar o envolvimento especificamente do complexo 1 da mTOR de adipócitos nas alterações morfológicas, metabólicas e secretórias do tecido adiposo branco e marrom induzidas pela ativação farmacológica de PPAR&gamma; em camundongos. Para isto, camundongos com deleção de raptor (mTORC1) exclusivamente em adipócitos alimentados com dieta hiperlipídica foram tratados ou não com RSG (30 mg/kg/dia) por 8 semanas. Nossos dados mostraram que tanto o mTORC1 quanto o agonista de PPAR&gamma; são importantes reguladores da adiposidade, onde observamos que a deleção genética de mTORC1 em adipócitos conteve o aumento de adiposidade. Além disso, RSG mostrou-se eficente em reduzir a massa dos depósitos viscerais retroperitoneal a epididimal sem alterar o depósito subcutâneo inguinal. RSG aumentou significativamente a massa do tecido adiposo marrom, efeito esse que foi completamente abolido pela deficiência do complexo 1 da mTOR. Deficiência de mTORC1 em adipócitos promoveu aumento no conteúdo de UCP1 (expressão gênica e proteica), efeito este que não foi alterado pelo tratamento com RSG. Outros efeitos de RSG mostraram-se dependentes de mTORC1 como o aumento de frequência de adipócitos de menor área, aumento dos níveis de adiponectina e redução dos níveis de BCAA séricos, além da expressão gênica de CD36 e PEPCK, lipídeos mitocondriais como a cardiolipina e fosfatidiletanolamina e mediadores lipídicos como as ceramidas de cadeia longa no tecido adiposo branco. Por outro lado encontramos efeitos de RSG independentes de mTORC1, como a redução nos níveis séricos de TAG, redução de expressão gênica de fatores inflamatórios, tais como IL1 e TNF, NLRP3, DUSP6, além de PGC1 e FAS, insulina plasmática, melhora na homeostase glicêmica. Concluímos assim que mTORC1 em adipócitos é importante mediador de ações de agonista de PPAR&gamma;. / Thiazolidinediones (TZDs), synthetic ligands of nuclear receptors PPAR&gamma;, have been widely used in the treatment of insulin resistance, dyslipidemia and metabolic syndrome. These drugs improve glucose homeostasis by promoting redistribution of fat from visceral to subcutaneous depots, increasing adiponectin secretion, reducing lipemia, lipotoxicity, and inflammation of adipose tissue. A recent study showed that the treatment of rats with TZD rosiglitazone (RSG) induces an increase in the activity of mTOR complexes 1 and 2, which play an important role in the control of lipid metabolism, adiposity and endocrine function of adipose tissue. Thus, we investigated herein the specific involvement of adipocyte mTOR complex 1 in the morphological, metabolic and secretory alterations of white and brown adipose tissue induced by pharmacological activation of PPAR&gamma; in mice. For this, mice with raptor deletion (mTORC1) exclusively in adipocytes and littermate controls were fed a hyperlipidic diet and treated or not with RSG (30 mg/ kg/ day) for 8 weeks. Our data showed that both mTORC1 and PPAR&gamma; agonist are important adiposity regulators, where we observed that the genetic deletion of mTORC1 in adipocytes prevented the increase in adiposity. In addition, RSG was effective in reducing the masses of visceral fat depots retroperitoneal and epididymal without altering the mass of the subcutaneous fat depot inguinal. RSG induced an expressive increase in brown adipose tissue mass, such, an effect that was blocked by mTOR 1 complex deficiency. mTORC1 ablation in adipocytes increased UCP1 content (gene and protein expression). Interesting, RSG lost its ability to reduce the percentage of smaller adipocytes, to increase serum levels of adiponectin and reduce those of BCAA, as well as to increase mRNA levels of CD36 and PEPCK, mitochondrial lipids such as cardiolipin and phosphatidylethanolamine, lipid mediators as long chain ceramides in white adipose tissue. Other effects of RSG such as reducing serum TAG and insulin levels, adipose tissue inflammation, such as IL1 and TNF, and improving glucose homeostasis were not affected by mTOR complex 1 deficiency. We conclude thus that mTORC1 is important mediator of some actions of PPAR&gamma; agonism.

Estudos de metabolismo in vitro possuem o intuito de caracterizar e quantificar possíveis metabólitos, elucidar as vias metabólicas e sugerir modelos a serem seguidos para a realização de estudos in vivo. Com o intuito de estudar o metabolismo in vitro não estereosseletivo da rosiglitazona (RSG) empregando fração microssomal de fígado de ratos,foi desenvolvida uma metodologia por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção UV em 245 nm, para analisar a RSG e seus principais metabólitos, p-hidroxi rosiglitazona (?-OH-R) e N-desmetil rosiglitazona (N-Dm-R). Os analitos foram separados em fase reversa, utilizando uma coluna X-Terra MS C-18 (partículas de 3,5 ?m) e fase móvel composta por água:acetonitrila:ácido acético (85:15:0,5, v/v/v), na vazão de 1 mL min-1. Matrizes biológicas contém um grande excesso de proteínas, lipídeos e outros materiais endógenos que interferem na análise de fármacos e metabólitos, tornando necessário um procedimento adequado de preparação das amostras antes da análise cromatográfica. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca (HF-LPME) é uma técnica promissora para a preparação de amostras em estudos de metabolismo in vitro, pois, além de promover o clean-up, promove também o enriquecimento dos analitos na amostra. A HF-LPME foi aplicada pela primeira vez para a extração simultânea desse fármaco e seus metabólitos. O sistema de três fases foi escolhido como o mais apropriado, empregando uma solução de ácido clorídrico como fase aceptora e 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método foi validado e foi linear no intervalo de 50-6000 ng mL-1, apresentando limites de quantificação de 50 ng mL-1 e recuperações acima de 47 % para a RSG e seus metabólitos (?-OH-R e N-Dm-R). O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro com fração microssomal de fígado de ratos. Nesse estudo, foi possível estimar as constantes de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade inicial máxima (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R apresentaram valores de Vmax de 87,30 ± 8,04 e 51,64 ± 12,25 ?mol min-1 mg proteína-1, respectivamente, enquanto que os valores de Km foram de 58,14 ± 11,85 e 77,84 ± 36,77 mmol L-1, respectivamente. Outros metabólitos foram observados nos cromatogramas e a identificação foi feita por espectrometria de massas: ?rto-hidroxi-rosiglitazona e N-desmetil-hidroxi-rosiglitazona. A RSG é comercializada como uma mistura racêmica, apesar de possuir sua atividade antidiabética relacionada essencialmente com o enantiômero (S). O centro quiral desse fármaco possui um grupo carbonila, por isso, o enantiômero (R) pode se converter no enantiômero (S) ou vice-versa, via tautomerismo cetoenólico. Dados da literatura indicavam que essa racemização poderia ser lenta o suficiente para possibilitar o estudo dos enantiômeros isoladamente. Entretanto, até o momento não há dados sobre a disposição cinética ii e metabolismo enantiosseletivos desse fármaco. Sendo assim, propôs-se o desenvolvimento de metodologias analíticas para estudar a racemização da RSG e seus metabólitos e avaliar a possibilidade de estudar seu metabolismo in vitro de forma estereosseletiva. O método foi desenvolvido empregando HPLC com detecção em 245 nm. A separação dos enantiômeros do fármaco e metabólitos, também quirais, foi obtida empregando uma coluna Chiralcel OJ-H e fase móvel constituída por metanol:etanol (90:10; v/v), na vazão de 0,3 mL min-1. O estudo de racemização mostrou que o fármaco e seus metabólitos são racemizados nas condições em que o estudo de metabolismo é conduzido. Finalmente, para estudar o metabolismo in vitro da pioglitazona (PGZ), foi desenvolvido um método para análise desse fármaco e de seus principais metabólitos, a hidroxi-pioglitazona (M-IV) e a ceto-pioglitazona (M-III) empregando a eletroforese capilar (CE). As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando tampão fosfato de sódio 50 mmol L-1, pH 2,5, detecção em 190 nm, tensão de 30 kV e temperatura do capilar de 35 °C. A HF-LPME também foi empregada para a preparação das amostras. O sistema de três fases foi escolhido, empregando solução de ácido clorídrico como fase aceptora e o 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método validado foi linear no intervalo de 200 - 25000 ng mL-1 para PGZ e 200 - 2000 ng mL-1 para os metabólitos, apresentando limites de quantificação de 200 ng mL-1 e recuperações acima de 19 % para a RSG e seus metabólitos M-IV e M-III. O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro contendo fração microssomal de fígado de ratos, mas nesse estudo, não foi possível observar a formação dos metabólitos. Entretanto, esse método pode ser usado em outros modelos de metabolismo in vitro (microssomas humanos), nos quais se observa a formação desses metabólitos em concentrações maiores. / In vitro metabolism studies have been used to characterize and to quantify possible metabolites, to elucidate metabolic pathways and to suggest models to perform in vivo studies. So the purpose of this study was to evaluate the in vitro rosiglitazone (RSG) metabolism employing microsomal fraction obtained from rat livers. A high- performance liquid chromatography (HPLC) method with UV detection at 245 nm was developed to analyze RSG and the main metabolites, p-hydroxy rosiglitazone (?-OH-R) e N-desmethyl rosiglitazone (N-Dm-R). The analytes were separated under reversed phase conditions, using a X-Terra MS C-18 column (3.5 ?m particle size) and a mobile phase consisting of water:acetonitrile:acetic acid (85:15:0.5, v/v/v), at a flow rate of 1 mL min-1. Biological matrices contain a large excess of proteins, lipids and other endogenous compounds that interfere in the analysis of drugs and metabolites. So, a suitable sample preparation technique is required. Hollow-fiber liquid phase microextraction (HF-LPME) is a promising technique for the preparation of biological samples. Besides the clean-up, analytes enrichment is also achieved. HF-LPME for the simultaneous analysis of RSG and its main metabolites is described for the first time. The three-phase extraction was performed using hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated and it was linear over the concentration range of 50-6000 ng mL-1, with quantification limits of 50 ng mL-1 and recoveries above 47 %. The validated method was used to estimate Michaelis-Menten (Km) constant and maximum initial velocity (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R showed Vmax values of 87.30 ± 8.04 and 51.64 ± 12.25 ?mol min-1 mg protein-1, respectively, while the Kmvalues were 58.14 ± 11.85 e 77.84 ± 36.77 mmol L-1, respectively. Other possible metabolites were observed in the chromatograms and they were identified by mass spectrometry: ?rtho-hydroxy-rosiglitazone e N-desmethyl-hydroxy-rosiglitazone. RSG is marketed as a racemic mixture although the antidiabetic activity is related essentially to the (S)-enantiomer. The chiral center has a carbonyl group, therefore the (R)-enantiomer could be transformed to the (S)-enantiomer or vice-versa by keto-enolic tautomerism. The literature indicates that this racemization is slow enough to allow the evaluation of the properties of the isolated enantiomers. However, there is no information in the literature about enantioselective RSG kinetic disposition and metabolism. Considering this facts, an analytical procedure was developed to study the racemization of RSG and its metabolites under different conditions and to determine if the enantioselective metabolism would be performed. The method was developed by HPLC with detection at 245 nm. The chiral separation of RSG and metabolites was achieved on a Chiralcel OJ-H column, with the mobile phase consisting of methanol:ethanol (90:10,v/v). The results obtained showed that the racemization occurs under the conditions used in in vitro iv metabolism studies. Finally, to study the in vitro metabolism of pioglitazone (PGZ), another method was developed by capillary electrophoresis (CE) to determine this drug and its main metabolites, hydroxy-pioglitazone (M-IV) and keto-pioglitazone (M-III). The analyses were conducted using a fused silica capillary (50 ?m inner diameter and 40 cm effective length), sodium phosphate buffer 50 mmol L-1, pH 2.5, detection at 190 nm, voltage of 30 kV and capillary temperature of 35°C. HF-LPME was also used for sample preparation with hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated showing to be linear in the concentration range of 200 - 25000 ng mL-1 for PGZ and 200 - 2000 ng mL-1 for the metabolites. Quantification limits were 200 ng mL-1 for all analytes and the recoveries were higher than 19%. The validated method was used to study the in vitro metabolism of PGZ by rat liver microsomal fraction, but it was not possible to observe the formation of the metabolites in this study. However this method could be used in other in vitro metabolism models (human microssomes), in which higher concentrations of these metabolites are observed. Keywords:

O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo que desempenha funções essenciais para a sobrevivência do indivíduo, sendo composto predominantemente por osteócitos. Dentre os tecidos mineralizados do corpo, o cemento é um dos menos estudados e compreendidos. A apoptose em células do tecido ósseo têm sido relatada após o uso de Tiazolidinedionas (TZD), uma classe de medicamentos utilizada no tratamento do diabetes melitus tipo 2, representadas pela Rosiglitazona. Assim, os objetivos desse estudo foram: avaliar, in vivo, um protocolo de administração sistêmica da Rosiglitazona em camundongos a fim de estimular a apoptose de osteócitos em maxilares; o efeito da apoptose de osteócitos induzida por Rosiglitazona na formação e progressão de lesões periapicais em camundongos nos períodos experimentais de 7, 21 e 42 dias; e demonstrar a ocorrência de apoptose em cementócitos de camundongos os quais receberam ou não a Rosiglitazona. Foram utilizados camundongos wild type (C57BL/6) com 4 a 5 semanas de idade. No primeiro estudo, a etapa 1 foi realizada para definição de protocolo de administração sistêmica da Rosiglitazona para indução de apoptose em maxilares de camundongos. Os animais (n=24) receberam a Rosiglitazona via oral por 1, 2 ou 3 semanas (gavagem, dose de 10mg/kg) ou não (PBS+10%DMSO). Foram utilizadas as técnicas de TUNEL e DAPI para quantificação de células apoptóticas. Posteriormente, na etapa 2, lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de camundongos wild type (C57BL/6) (n=60) após a administração ou não da Rosiglitasona. A câmara pulpar dos dentes foi exposta à microbiota da cavidade bucal pelos períodos de 7, 21 e 42 dias e os grupos foram divididos da seguinte forma: G1) veículo + lesão 7 dias; G2) veículo + lesão 21 dias; G3) veículo + lesão 42 dias; G4) TZD + lesão 7 dias; G5) TZD + lesão 21 dias; G6) TZD + lesão 42 dias. Foram realizadas avaliações em microscopia convencional para análise descritiva das lesões periapicais; microscopia de fluorescência para mensuração das lesões periapicais; histoenzimologia para a atividade da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e marcação de osteoclastos; absortometria radiológica de dupla energia (DXA) para avaliação da densidade mineral óssea (DMO) em osso longo e análise da expressão gênica de marcadores de osteócitos (Sost, Hyou1 e Dmp1). No segundo estudo, foram utilizadas as técnicas de TUNEL e DAPI para quantificação de cementócitos apoptóticos em dentes de camundongos wild type (n=12) que receberam ou não a Rosiglitazona. Na etapa 1 do primeiro estudo, pôde-se observar que a administração sistêmica da Rosiglitazona por 2 semanas promoveu a apoptose de osteócitos de forma mais expressiva quando comparada ao período de 1 semana, porém sem diferença significativa com o período de 3 semanas (p>0,05). Já na etapa 2, nos grupos os quais receberam a Rosiglitazona, pôde-se observar uma tendência a lesões periapicais maiores, porém sem diferença estatisticamente significante em comparação com animais que não receberam esse medicamento (p>0,05), além de promover, aos 21 dias de progressão da lesão periapical, maior número de osteoclastos e maior expressão dos genes Sost e Hyou1, sem diferença estatisticamente significante para a expressão do gene Dmp1, bem como na DMO dos fêmures. Adicionalmente, no segundo estudo, foi observado que, em camundongos que receberam a Rosiglitazona por 2 semanas, os cortes histológicos corados em TUNEL e DAPI demonstraram maior razão de cementócitos apoptóticos/cementócitos totais comparado ao grupo controle. Após as metodologias empregadas e os parâmetros analisados, pôde-se concluir que o uso sistêmico da Rosiglitazona estimulou a apoptose de osteócitos e cementócitos interferindo na formação e progressão de lesões periapicais em camundongos. / The bone tissue is a specialized type of connective tissue that provides essential functions for the survival of the individual, composed predominantly of osteocytes. Among the mineralized tissues in the body, the cementum is one of the most poorly studied and understood. Apoptosis in the bone tissue have been reported after the use of Thiazolidinediones (TZD), a class of drugs used in the treatment of diabetes mellitus type 2, represented by Rosiglitazone. Thus, the aims of this study were: evaluate, in vivo, a protocol for systemic administration of Rosiglitazone in mice in order to stimulate the apoptosis of osteocytes in jaws; the effect of apoptosis of osteocytes induced by Rosiglitazone in the formation and progression of periapical lesions in mice in the experimental periods of 7, 21 and 42 days; and demonstrate the occurrence of apoptosis in cementocytes of mice which received or not the Rosiglitazone. We used mice wild type (C57BL/6) with 4 to 5 weeks of age. In the first study, the phase 1 was performed for the protocol definition of systemic administration of Rosiglitazone for induction of apoptosis in mice jaws. The animals (n=24) received the Rosiglitazone orally for 1, 2 or 3 weeks (gavage, dose of 10mg/kg) or not (PBS+10%DMSO). We used the techniques of TUNEL and DAPI for quantification of apoptotic cells. Subsequently, in phase 2, periapical lesions were induced in the first lower molars of wild type (C57BL/6) mice (n=60) after the administration or not of Rosiglitasone. The pulp chamber was exposed to the oral microbiota during 7, 21 and 42 days, and the groups were divided as follows: G1) vehicle + periapical lesions 7 days; G2) vehicle + periapical lesions 21 days; (G3) vehicle + periapical lesions 42 days; (G4) TZD + periapical lesions 7 days; G5) TZD + periapical lesions 21 days; (G6) TZD + periapical lesions 42 days. Evaluations were conducted in conventional microscopy for descriptive analysis of periapical lesions; fluorescence microscopy for measurement of periapical lesions; histoenzimology to the activity of acid phosphatase resistant tartrate (TRAP) for osteoclasts measurement; dual-energy x-ray absorptiometry (DXA) for evaluation of bone mineral density (BMD) in long bone and analysis of gene expression of osteocytes markers (Sost, Hyou1 and Dmp1). In the second study, TUNEL and DAPI techniques were used for the quantification of apoptotic cementocytes in wild type (n = 12) mice that received Rosiglitazone or not. In the phase 1 of the first study it was observed that the systemic administration of Rosiglitazone for 2 weeks showed the apoptosis of osteocytes in a more expressive manner when compared to the period of 1 week with no significant difference with the period of 3 weeks (p>0,05). On phase 2, in the groups which received the Rosiglitazone, it was observed a tendency of larger periapical lesions, but without statistically significant difference compared with animals that did not receive this drug (p>0,05), besides promoting, at 21 days of periapical lesion progression, greater number of osteoclasts and greater expression of genes Sost and Hyou1, and absence of statistically significant differences in the expression of the gene Dmp1 nor in the BMD of the femurs. In addition, in the second study, it was observed that, in mice that received the Rosiglitazone for 2 weeks, sections stained by TUNEL and DAPI showed significantly higher ratio of apoptotic cementocytes/total cementocytes compared to control group. After the methodologies used and the parameters analyzed, it can be concluded that the systemic use of Rosiglitazone stimulated the apoptosis of osteocytes and cementocytes interfering in the formation and progression of periapical lesions in mice.

O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo que desempenha funções essenciais para a sobrevivência do indivíduo, sendo composto predominantemente por osteócitos. Dentre os tecidos mineralizados do corpo, o cemento é um dos menos estudados e compreendidos. A apoptose em células do tecido ósseo têm sido relatada após o uso de Tiazolidinedionas (TZD), uma classe de medicamentos utilizada no tratamento do diabetes melitus tipo 2, representadas pela Rosiglitazona. Assim, os objetivos desse estudo foram: avaliar, in vivo, um protocolo de administração sistêmica da Rosiglitazona em camundongos a fim de estimular a apoptose de osteócitos em maxilares; o efeito da apoptose de osteócitos induzida por Rosiglitazona na formação e progressão de lesões periapicais em camundongos nos períodos experimentais de 7, 21 e 42 dias; e demonstrar a ocorrência de apoptose em cementócitos de camundongos os quais receberam ou não a Rosiglitazona. Foram utilizados camundongos wild type (C57BL/6) com 4 a 5 semanas de idade. No primeiro estudo, a etapa 1 foi realizada para definição de protocolo de administração sistêmica da Rosiglitazona para indução de apoptose em maxilares de camundongos. Os animais (n=24) receberam a Rosiglitazona via oral por 1, 2 ou 3 semanas (gavagem, dose de 10mg/kg) ou não (PBS+10%DMSO). Foram utilizadas as técnicas de TUNEL e DAPI para quantificação de células apoptóticas. Posteriormente, na etapa 2, lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de camundongos wild type (C57BL/6) (n=60) após a administração ou não da Rosiglitasona. A câmara pulpar dos dentes foi exposta à microbiota da cavidade bucal pelos períodos de 7, 21 e 42 dias e os grupos foram divididos da seguinte forma: G1) veículo + lesão 7 dias; G2) veículo + lesão 21 dias; G3) veículo + lesão 42 dias; G4) TZD + lesão 7 dias; G5) TZD + lesão 21 dias; G6) TZD + lesão 42 dias. Foram realizadas avaliações em microscopia convencional para análise descritiva das lesões periapicais; microscopia de fluorescência para mensuração das lesões periapicais; histoenzimologia para a atividade da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e marcação de osteoclastos; absortometria radiológica de dupla energia (DXA) para avaliação da densidade mineral óssea (DMO) em osso longo e análise da expressão gênica de marcadores de osteócitos (Sost, Hyou1 e Dmp1). No segundo estudo, foram utilizadas as técnicas de TUNEL e DAPI para quantificação de cementócitos apoptóticos em dentes de camundongos wild type (n=12) que receberam ou não a Rosiglitazona. Na etapa 1 do primeiro estudo, pôde-se observar que a administração sistêmica da Rosiglitazona por 2 semanas promoveu a apoptose de osteócitos de forma mais expressiva quando comparada ao período de 1 semana, porém sem diferença significativa com o período de 3 semanas (p>0,05). Já na etapa 2, nos grupos os quais receberam a Rosiglitazona, pôde-se observar uma tendência a lesões periapicais maiores, porém sem diferença estatisticamente significante em comparação com animais que não receberam esse medicamento (p>0,05), além de promover, aos 21 dias de progressão da lesão periapical, maior número de osteoclastos e maior expressão dos genes Sost e Hyou1, sem diferença estatisticamente significante para a expressão do gene Dmp1, bem como na DMO dos fêmures. Adicionalmente, no segundo estudo, foi observado que, em camundongos que receberam a Rosiglitazona por 2 semanas, os cortes histológicos corados em TUNEL e DAPI demonstraram maior razão de cementócitos apoptóticos/cementócitos totais comparado ao grupo controle. Após as metodologias empregadas e os parâmetros analisados, pôde-se concluir que o uso sistêmico da Rosiglitazona estimulou a apoptose de osteócitos e cementócitos interferindo na formação e progressão de lesões periapicais em camundongos. / The bone tissue is a specialized type of connective tissue that provides essential functions for the survival of the individual, composed predominantly of osteocytes. Among the mineralized tissues in the body, the cementum is one of the most poorly studied and understood. Apoptosis in the bone tissue have been reported after the use of Thiazolidinediones (TZD), a class of drugs used in the treatment of diabetes mellitus type 2, represented by Rosiglitazone. Thus, the aims of this study were: evaluate, in vivo, a protocol for systemic administration of Rosiglitazone in mice in order to stimulate the apoptosis of osteocytes in jaws; the effect of apoptosis of osteocytes induced by Rosiglitazone in the formation and progression of periapical lesions in mice in the experimental periods of 7, 21 and 42 days; and demonstrate the occurrence of apoptosis in cementocytes of mice which received or not the Rosiglitazone. We used mice wild type (C57BL/6) with 4 to 5 weeks of age. In the first study, the phase 1 was performed for the protocol definition of systemic administration of Rosiglitazone for induction of apoptosis in mice jaws. The animals (n=24) received the Rosiglitazone orally for 1, 2 or 3 weeks (gavage, dose of 10mg/kg) or not (PBS+10%DMSO). We used the techniques of TUNEL and DAPI for quantification of apoptotic cells. Subsequently, in phase 2, periapical lesions were induced in the first lower molars of wild type (C57BL/6) mice (n=60) after the administration or not of Rosiglitasone. The pulp chamber was exposed to the oral microbiota during 7, 21 and 42 days, and the groups were divided as follows: G1) vehicle + periapical lesions 7 days; G2) vehicle + periapical lesions 21 days; (G3) vehicle + periapical lesions 42 days; (G4) TZD + periapical lesions 7 days; G5) TZD + periapical lesions 21 days; (G6) TZD + periapical lesions 42 days. Evaluations were conducted in conventional microscopy for descriptive analysis of periapical lesions; fluorescence microscopy for measurement of periapical lesions; histoenzimology to the activity of acid phosphatase resistant tartrate (TRAP) for osteoclasts measurement; dual-energy x-ray absorptiometry (DXA) for evaluation of bone mineral density (BMD) in long bone and analysis of gene expression of osteocytes markers (Sost, Hyou1 and Dmp1). In the second study, TUNEL and DAPI techniques were used for the quantification of apoptotic cementocytes in wild type (n = 12) mice that received Rosiglitazone or not. In the phase 1 of the first study it was observed that the systemic administration of Rosiglitazone for 2 weeks showed the apoptosis of osteocytes in a more expressive manner when compared to the period of 1 week with no significant difference with the period of 3 weeks (p>0,05). On phase 2, in the groups which received the Rosiglitazone, it was observed a tendency of larger periapical lesions, but without statistically significant difference compared with animals that did not receive this drug (p>0,05), besides promoting, at 21 days of periapical lesion progression, greater number of osteoclasts and greater expression of genes Sost and Hyou1, and absence of statistically significant differences in the expression of the gene Dmp1 nor in the BMD of the femurs. In addition, in the second study, it was observed that, in mice that received the Rosiglitazone for 2 weeks, sections stained by TUNEL and DAPI showed significantly higher ratio of apoptotic cementocytes/total cementocytes compared to control group. After the methodologies used and the parameters analyzed, it can be concluded that the systemic use of Rosiglitazone stimulated the apoptosis of osteocytes and cementocytes interfering in the formation and progression of periapical lesions in mice.

Estudos de metabolismo in vitro possuem o intuito de caracterizar e quantificar possíveis metabólitos, elucidar as vias metabólicas e sugerir modelos a serem seguidos para a realização de estudos in vivo. Com o intuito de estudar o metabolismo in vitro não estereosseletivo da rosiglitazona (RSG) empregando fração microssomal de fígado de ratos,foi desenvolvida uma metodologia por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção UV em 245 nm, para analisar a RSG e seus principais metabólitos, p-hidroxi rosiglitazona (?-OH-R) e N-desmetil rosiglitazona (N-Dm-R). Os analitos foram separados em fase reversa, utilizando uma coluna X-Terra MS C-18 (partículas de 3,5 ?m) e fase móvel composta por água:acetonitrila:ácido acético (85:15:0,5, v/v/v), na vazão de 1 mL min-1. Matrizes biológicas contém um grande excesso de proteínas, lipídeos e outros materiais endógenos que interferem na análise de fármacos e metabólitos, tornando necessário um procedimento adequado de preparação das amostras antes da análise cromatográfica. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca (HF-LPME) é uma técnica promissora para a preparação de amostras em estudos de metabolismo in vitro, pois, além de promover o clean-up, promove também o enriquecimento dos analitos na amostra. A HF-LPME foi aplicada pela primeira vez para a extração simultânea desse fármaco e seus metabólitos. O sistema de três fases foi escolhido como o mais apropriado, empregando uma solução de ácido clorídrico como fase aceptora e 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método foi validado e foi linear no intervalo de 50-6000 ng mL-1, apresentando limites de quantificação de 50 ng mL-1 e recuperações acima de 47 % para a RSG e seus metabólitos (?-OH-R e N-Dm-R). O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro com fração microssomal de fígado de ratos. Nesse estudo, foi possível estimar as constantes de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade inicial máxima (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R apresentaram valores de Vmax de 87,30 ± 8,04 e 51,64 ± 12,25 ?mol min-1 mg proteína-1, respectivamente, enquanto que os valores de Km foram de 58,14 ± 11,85 e 77,84 ± 36,77 mmol L-1, respectivamente. Outros metabólitos foram observados nos cromatogramas e a identificação foi feita por espectrometria de massas: ?rto-hidroxi-rosiglitazona e N-desmetil-hidroxi-rosiglitazona. A RSG é comercializada como uma mistura racêmica, apesar de possuir sua atividade antidiabética relacionada essencialmente com o enantiômero (S). O centro quiral desse fármaco possui um grupo carbonila, por isso, o enantiômero (R) pode se converter no enantiômero (S) ou vice-versa, via tautomerismo cetoenólico. Dados da literatura indicavam que essa racemização poderia ser lenta o suficiente para possibilitar o estudo dos enantiômeros isoladamente. Entretanto, até o momento não há dados sobre a disposição cinética ii e metabolismo enantiosseletivos desse fármaco. Sendo assim, propôs-se o desenvolvimento de metodologias analíticas para estudar a racemização da RSG e seus metabólitos e avaliar a possibilidade de estudar seu metabolismo in vitro de forma estereosseletiva. O método foi desenvolvido empregando HPLC com detecção em 245 nm. A separação dos enantiômeros do fármaco e metabólitos, também quirais, foi obtida empregando uma coluna Chiralcel OJ-H e fase móvel constituída por metanol:etanol (90:10; v/v), na vazão de 0,3 mL min-1. O estudo de racemização mostrou que o fármaco e seus metabólitos são racemizados nas condições em que o estudo de metabolismo é conduzido. Finalmente, para estudar o metabolismo in vitro da pioglitazona (PGZ), foi desenvolvido um método para análise desse fármaco e de seus principais metabólitos, a hidroxi-pioglitazona (M-IV) e a ceto-pioglitazona (M-III) empregando a eletroforese capilar (CE). As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando tampão fosfato de sódio 50 mmol L-1, pH 2,5, detecção em 190 nm, tensão de 30 kV e temperatura do capilar de 35 °C. A HF-LPME também foi empregada para a preparação das amostras. O sistema de três fases foi escolhido, empregando solução de ácido clorídrico como fase aceptora e o 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método validado foi linear no intervalo de 200 - 25000 ng mL-1 para PGZ e 200 - 2000 ng mL-1 para os metabólitos, apresentando limites de quantificação de 200 ng mL-1 e recuperações acima de 19 % para a RSG e seus metabólitos M-IV e M-III. O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro contendo fração microssomal de fígado de ratos, mas nesse estudo, não foi possível observar a formação dos metabólitos. Entretanto, esse método pode ser usado em outros modelos de metabolismo in vitro (microssomas humanos), nos quais se observa a formação desses metabólitos em concentrações maiores. / In vitro metabolism studies have been used to characterize and to quantify possible metabolites, to elucidate metabolic pathways and to suggest models to perform in vivo studies. So the purpose of this study was to evaluate the in vitro rosiglitazone (RSG) metabolism employing microsomal fraction obtained from rat livers. A high- performance liquid chromatography (HPLC) method with UV detection at 245 nm was developed to analyze RSG and the main metabolites, p-hydroxy rosiglitazone (?-OH-R) e N-desmethyl rosiglitazone (N-Dm-R). The analytes were separated under reversed phase conditions, using a X-Terra MS C-18 column (3.5 ?m particle size) and a mobile phase consisting of water:acetonitrile:acetic acid (85:15:0.5, v/v/v), at a flow rate of 1 mL min-1. Biological matrices contain a large excess of proteins, lipids and other endogenous compounds that interfere in the analysis of drugs and metabolites. So, a suitable sample preparation technique is required. Hollow-fiber liquid phase microextraction (HF-LPME) is a promising technique for the preparation of biological samples. Besides the clean-up, analytes enrichment is also achieved. HF-LPME for the simultaneous analysis of RSG and its main metabolites is described for the first time. The three-phase extraction was performed using hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated and it was linear over the concentration range of 50-6000 ng mL-1, with quantification limits of 50 ng mL-1 and recoveries above 47 %. The validated method was used to estimate Michaelis-Menten (Km) constant and maximum initial velocity (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R showed Vmax values of 87.30 ± 8.04 and 51.64 ± 12.25 ?mol min-1 mg protein-1, respectively, while the Kmvalues were 58.14 ± 11.85 e 77.84 ± 36.77 mmol L-1, respectively. Other possible metabolites were observed in the chromatograms and they were identified by mass spectrometry: ?rtho-hydroxy-rosiglitazone e N-desmethyl-hydroxy-rosiglitazone. RSG is marketed as a racemic mixture although the antidiabetic activity is related essentially to the (S)-enantiomer. The chiral center has a carbonyl group, therefore the (R)-enantiomer could be transformed to the (S)-enantiomer or vice-versa by keto-enolic tautomerism. The literature indicates that this racemization is slow enough to allow the evaluation of the properties of the isolated enantiomers. However, there is no information in the literature about enantioselective RSG kinetic disposition and metabolism. Considering this facts, an analytical procedure was developed to study the racemization of RSG and its metabolites under different conditions and to determine if the enantioselective metabolism would be performed. The method was developed by HPLC with detection at 245 nm. The chiral separation of RSG and metabolites was achieved on a Chiralcel OJ-H column, with the mobile phase consisting of methanol:ethanol (90:10,v/v). The results obtained showed that the racemization occurs under the conditions used in in vitro iv metabolism studies. Finally, to study the in vitro metabolism of pioglitazone (PGZ), another method was developed by capillary electrophoresis (CE) to determine this drug and its main metabolites, hydroxy-pioglitazone (M-IV) and keto-pioglitazone (M-III). The analyses were conducted using a fused silica capillary (50 ?m inner diameter and 40 cm effective length), sodium phosphate buffer 50 mmol L-1, pH 2.5, detection at 190 nm, voltage of 30 kV and capillary temperature of 35°C. HF-LPME was also used for sample preparation with hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated showing to be linear in the concentration range of 200 - 25000 ng mL-1 for PGZ and 200 - 2000 ng mL-1 for the metabolites. Quantification limits were 200 ng mL-1 for all analytes and the recoveries were higher than 19%. The validated method was used to study the in vitro metabolism of PGZ by rat liver microsomal fraction, but it was not possible to observe the formation of the metabolites in this study. However this method could be used in other in vitro metabolism models (human microssomes), in which higher concentrations of these metabolites are observed. Keywords: