Revisión de los factores que intervienen en la interpretación de la densitometría ósea (aparato, regiones de interés, información aportada por la técnica, curvas de referencia de normalidad poblacional) y su indicación (criterios de indicación de densitometría de diferentes organismos). Se relacionan 5 estudios con las aportaciones en relación a la interpretación de la densitometría y su indicación.En el primer estudio se evalúa la importancia de la curva de normalidad de referencia para la clasificación de personas y grupos poblacionales, comparándose, en cuello de fémur, la curva de normalidad española y la propuesta por el estudio americano NHANES III. No se observan diferencias apreciables en la clasificación de individuos, pero sí en la identificación de grupos poblacionales.En el segundo estudio se evalúa la necesidad de realizar una densitometría ósea en mujeres posmenopáusicas con una fractura vertebral clínica. Se observa que tres cuartas partes de las mujeres con fractura vertebral clínica tienen osteoporosis, y casi todo el resto tiene osteopneia. Se concluye que en este grupo de pacientes podría obviarse la realización de una densitometría ósea con fines diagnósticos en caso de dificultad de acceso a la técnica.El tercer y cuarto estudios estudian la frecuencia con que debería indicarse una densitometría ósea en consultas extrahospitalarias de Reumatología y en consultas de Atención Primaria, respectivamente, utilizando diferentes criterios. Se concluye que en ambos casos la proporción de individuos con indicación de densitometría ósea varía de forma importante según el criterio utilizado para su indicación.En el último estudio se evalúa la proporción de varones con artritis reumatoide que tienen osteoporosis según los criterios de la Organizaciçon Mundial de la Salud (aplicando a varones los criterios propuestos para mujeres posmenopáusicas) y de la International Society for Clinical Densitometry. Se concluye que la prevalencia de osteoporosis es inferior a la observada en mujeres con artritis reumatoide, sin que haya diferencias importantes entre los dos criterios utilizados.

Los glucocorticoides son fármacos ampliamente utilizados como antiinflamatorios o inmunosupresores en el tratamiento de múltiples patologías como enfermedades reumáticas y autoinmunes, respiratorias, y en el transplante de órganos. Uno de los principales efectos secundarios de su administración de forma prolongada o a dosis elevadas es la disminución de masa ósea asociada a un mayor riesgo de fracturas. En la actualidad, y dada la amplia utilización de estos medicamentos, la osteoporosis inducida por glucocorticoides constituye la principal causa de osteoporosis secundaria. En los diversos estudios realizados se ha demostrado que estos fármacos producen una inhibición de la formación ósea, sin embargo, los mecanismos celulares de la osteoporosis inducida por glucocorticoides no están aún bien establecidos.El objetivo de nuestro estudio fue analizar "in vitro" el efecto de los glucocorticoides sobre la proliferación y la función celular de osteoblastos humanos, para estudiar los mecanismos celulares de la osteoporosis inducida por los glucocorticoides. En la primera parte de nuestro estudio se estableció el cultivo de osteoblastos a partir de hueso trabecular humano obtenido de pacientes que precisaban colocación de una prótesis articular, excluyendo previamente aquellos con sospecha de osteoporosis. Una vez establecida la línea celular, se estudió el efecto de dosis suprafisiológicas de glucocorticoides (dexametasona 10-6 M y 10-7 M) sobre la proliferación celular de osteoblastos humanos, valorada a través de la síntesis de DNA por la incorporación de timidina tritiada; sobre la síntesis de procolágeno tipo I intracelular, por técnica de inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal antiprocolágeno I; y sobre la secreción de los propéptidos amino (PINP) y carboxi (PICP) terminal del procolágeno tipo I en el medio de cultivo por técnica de radioimmunoanálisis. Se valoraron los resultados a las 24 y 48 horas de incubación y se compararon con los del grupo control, cultivo de osteoblastos humanos sin adición de glucocorticoides. Cuando analizamos los resultados, observamos una disminución de la síntesis de procolágeno I intracelular en los cultivos de osteoblastos tratados con dexametasona (DEX), que ya era evidente a las 24 y fue máxima a las 48 horas de incubación (32 ± 5% y 35 ± 6%, respectivamente) (p<0.05). Asimismo, se observó una disminución en la secreción de ambos propéptidos derivados del procolágeno I (PINP y PICP) en el sobrenadante de los cultivos tratados con DEX a las 24 h (PINP: 20 ± 8%; PICP: 22 ± 10%), que persistía a las 48 h (PINP: 19 ± 5%; PICP: 14 ± 3%) (p<0.05). No se hallaron diferencias significativas entre ambas concentraciones de glucocorticoides. Los niveles de PINP y de PICP se correlacionaron de forma significativa entre sí en el medio de cultivo (r = 0.827) y con la síntesis de procolágeno I intracelular (PINP r = 0.515; PICP r = 0.486) (p<0.001). No se observó una disminución de la proliferación celular sino que se produjo un discreto incremento de incorporación de timidina tritiada en relación con el tiempo de exposición en las células tratadas con y sin adición de glucocorticoides, aunque este incremento sólo fue significativo en el grupo control y en el tratado con DEX 10-6 M (p<0.05).De los resultados de nuestro estudio podemos concluir que los glucocorticoides a dosis suprafisiológicas producen una inhibición precoz de la síntesis de procolágeno I en osteoblastos humanos, no asociada a una disminución de la proliferación celular; que la actividad osteoblástica en sobrenadante valorada mediante PINP y PICP se correlaciona directamente con la síntesis intracelular de procolágeno I, y, por último, que tanto la determinación de la inmunorreactividad intracelular para procolágeno I mediante inmunocitoquímica como de los propéptidos del procolágeno I en el medio de cultivo son métodos útiles para analizar la función osteoblástica "in vitro". / Glucocorticoids are drugs frequently employed as anti-inflammatory or immunosuppressive agents in a variety of disorders such a bronchial asthma and rheumatic diseases, as well as after organ transplantation. Among their side effects, bone loss is often observed in long-lasting or in high-dose treatment. Currently, glucocorticoid-induced osteoporosis is the main cause of secondary osteoporosis. It is well-known that glucocorticoids induce an inhibition of bone formation, however, the cellular mechanisms of glucocorticoid-induced osteoporosis are not well established.The effects of glucocorticoids on DNA synthesis and cellular function were assessed in cultures of human osteoblastic cells by using indirect immunoperoxidase staining with a type I antiprocollagen antibody and by measuring procollagen type I N and C propeptides (PINP, PICP) in the culture medium by radiometric methods. Likewise, we analyzed the correlation between intracellular immunostaining and procollagen propeptides released into the culture medium, as well as the correlation between PINP and PICP. Human osteoblasts were cultured with and without addition of dexamethasone (DEX) at two supraphysiological concentrations, 10-6 M and 10-7 M, for 24 and 48 h. Treatment with DEX at 10-6 M was associated with a significant decrease in the percentage of cells showing intracellular type I procollagen immunoreactivity at 24 and 48 h (p<0.05). Similar effects were observed with 10-7 M DEX. Dexamethasone 10-6 M and 10-7 M also induced significant decreases in PINP and PICP values after 24 and 48 h of treatment (p<0.05). The decrease in intracellular procollagen immunoreactivity and propeptide secretion was not associated with a reduction in DNA synthesis. A highly significant correlation was observed between the values of PINP and PICP in the culture medium as well as between the values of intracellular immunostaining and PINP and PICP (p<0.001). In conclusion, our results suggest that supraphysiological doses of glucocorticoids produce a direct inhibition on osteoblastic function through their effect on type I procollagen synthesis, that was not associated with a reduction in DNA synthesis. Immunoperoxidase detection of type I intracellular procollagen as well as the quantification of PINP and PICP in the culture medium are reliable methods of assessing osteoblast function.

L'osteoporosi, una malaltia complexa determinada tant per factors genètics com ambientals, està caracteritzada per una reduïda densitat mineral òssia (DMO), un deteriorament de la microarquitectura òssia i un augment del risc de patir fractures osteoporòtiques. En el present treball ens vam plantejar estudiar les causes genètiques que determinen l'aparició de l'osteoporosi mitjançant la realització d'estudis d'associació i estudis funcionals. Els gens candidats clàssics per a l'osteoporosi que hem analitzat han estat el gen COL1A1, el gen ESR1, el gen VDR i el gen TGFB1. Els estudis d'associació s'han dut a terme en la cohort BARCOS formada per dones postmenopàusiques de l'àrea de Barcelona. Els resultats obtinguts en la cohort BARCOS han estat incorporats en el projecte GENOMOS (metaanàlisi prospectiva amb 20.000 mostres). En la cohort BARCOS vam observar que polimorfismes de canvi puntual de nucleòtid (SNP) del gen COL1A1 així com també determinats haplotips i la interacció entre ells o bé amb SNPs del gen VDR es trobaven associats a la DMO. Pel que fa al gen ESR1, vam trobar que l'haplotip LPX es trobava associat a la DMO femoral. Els resultats del projecte GENOMOS, van mostrar que només el polimorfisme Sp1 del gen COL1A1 es trobava associat a la DMO. En el projecte GENOMOS, els polimorfismes XbaI (ERSR1), Cdx2 (VDR) i Sp1 (COL1A1) es van trobar associats al risc de patir fractures.En la cohort BARCOS també vam analitzar l'efecte de SNPs situats en gens candidats no clàssics (RUNX2 i IL6R). Pel que fa a RUNX2 vam trobar que un SNP del promotor 2, però no un SNP del promotor 1 es trobava associat a la DMO femoral. Aquesta ha estat la primera vegada que SNPs del gen IL6R s'han analitzat en relació a fenotips osteoporòtics. Vam observar que SNPs i haplotips en aquest gen es trobaven associats a la DMO femoral i a l'índex de massa corporal (IMC). Com a segon objectiu ens vam plantejar completar l'estudi funcional dels SNPs del promotor del gen COL1A1 (-1997 G/T i -1663 indelT) en relació a les proteïnes CIZ/NMP4 i BMP2. Prèviament s'havia descrit que la proteïna CIZ/NMP4, un factor de transcripció arquitectònic que inhibeix la via osteoblastogènica de la BMP2, s'unia a la regió nucleotídica on es troba el SNP -1663 indelT. En les cèl·lules Saos-2 vam observar que el patró de transcripció de diferents construccions del promotor del gen COL1A1 fusionat al gen de la luciferasa era similar tant si aquestes eren tranfectades de manera estable o bé de forma transitòria. En estudiar l'efecte de la BMP2 sobre l'activitat transcripcional del gen COL1A1, vam observar que mentre el promotor basal disminuïa la seva activitat en presència de BMP2, les altres construccions analitzades l'augmentaven. Les construccions que eren estimulades en major grau presentaven la regió del promotor on es troben els polimorfismes. Tot i això, analitzant els diferents haplotips, vam observar que aquests no participaven en l'estimulació induïda per BMP2. In silico la regió estimulada per BMP2, presenta dues possibles caixes d'unió de factors de transcripció de la via de la BMP2. En mutagenitzar-les per separat, però, aquestes no van semblar participar en l'estimulació induïda per la BMP2. Seguidament vam analizar el patró d'expressió de CIZ/NMP4 en diversos teixits humans i vam observar que diverses isoformes s'expressaven simultàniament en tots ells i també en les cèl·lules d'osteosarcoma humanes Saos-2 i MG-63. Es van identificar les isoformes 11H, CIZ6.1, 21H i 21H-I1. Aquestes dues últimes van ser clonades i sobrexpressades de manera estable en les cèl·lules Saos-2, les quals es van transfectar transitòriament amb el promotor del gen COL1A1 i es van tractar amb BMP2. Els resultats van indicar que CIZ/NMP4 augmentava lleugerament la transcripció del gen COL1A1 en absència de BMP2. En presència de BMP2, i contràriament al què s'esperava, vam observar que la sobrexpressió de CIZ/NMP4 no tenia cap efecte. / "ASSOCIATION AND FUNCTIONAL STUDIES WITH CANDIDATE GENES FOR OSTEOPOROSIS" TEXT:Osteoporosis, a complex disease determined by genetic and environmental factors, is characterized by a reduced bone mineral density (BMD) and an increased risk of fracture. In this thesis we studied the genetic component of osteoporosis through association and functional studies. The classical candidate genes for osteoporosis we analyzed were COL1A1, ESR1, VDR and TGFB1. The association studies were performed with the BARCOS cohort, a group of postmenopausal women from Barcelona. The results obtained in this cohort were included in a prospective metaanalysis called GENOMOS (20,000 samples). In the BARCOS cohort we observed that SNPs in the COL1A1 gene, their haplotypes and interactions, and interactions with SNPs in the VDR gene were associated with BMD. The haplotype LPX (ESR1) was also associated with BMD. In GENOMOS, although several SNPs were found to be associated with fracture risk, the Sp1 polymorphism (COL1A1) was the only one associated with BMD. In the BARCOS cohort we also found that one SNP situated in promoter 2 of RUNX2 gene, but not one situated in promoter 1, was associated with BMD. Finally, this was the first time that SNPs in IL6R gene were analyzed in relation to osteoporosis and we found that they were associated with BMD and also with body mass index (BMI). The second aim of this thesis was the functional study of two SNPs situated in the promoter of COL1A1 gene in relation to CIZ/NMP4 and BMP2 proteins. It was known that CIZ/NMP4, an architectural transcription factor that inhibits the BMP2 osteoblastogenic pathway, binded to the COL1A1 promoter. We observed that the transcription pattern of differnt constructs of COL1A1 promoter was similar between transient and stable transfections. BMP2 stimulated all these constructs, except for the basal promoter. The constructs that were stimulated more, contained the region where the SNPs lie, but when the haplotypes were analyzed no differences were observed between them. In this region there are two putative transcription factor sites for the BMP2 pathway, but they seemed not to participate in the BMP2 stimulation. Several isoforms of CIZ/NMP4 were simultaneously expressed in different tissues. We identified 11H, CIZ6.1, 21H and 21H-I1 isoforms. These two last were stably overexpressed in Saos-2 cells, which were then transiently tranfected with COL1A1 promoter and treated with BMP2. In absence of BMP2, overexpression of CIZ/NMP4 isoforms slightly increased COL1A1 transcription.