Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-20Bitstream added on 2014-06-13T20:20:53Z : No. of bitstreams: 1 curcelli_ec_dr_botfm.pdf: 2108875 bytes, checksum: c4aa12d19e13e38271b7b6d4e3d75acf (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Em 69 pacientes com diagnóstico de osteossarcoma ósseo, primário e secundário, submetidos a tratamento no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp (Botucatu - SP) e no Hospital Amaral Carvalho (Jaú - SP), no período de 1990 a 2004, foi verificada a possível associação entre prognóstico e fatores clínicos, epidemiológicos, histopatológicos e imuno-histoquímicos.Os pacientes foram submetidos a diferentes protocolos de tratamento e, na maioria das peças de ressecção tumoral, procedeu-se à quantificação do efeito quimioterápico neo-adjuvante de acordo com os critérios preconizados por Huvos (1991). Os dados foram coletados dos prontuários hospitalares e nas amostras da biópsia óssea, realizada prétratamento, foi verificada a ocorrência de apoptose e da expressão da proteína p53, pelo método imuno-histoquímico (Tunel e ABC).Os resultados foram submetidos à análise univariada de sobrevida com construção de curvas de Kaplan-Meier.As associações entre procedimento cirúrgico e grau de necrose e, entre recidiva e grau de necrose, foram analisadas pelo Teste de Goodman (Goodman, 1964,1965).Foi constatado que as variáveis, idade, sexo, classificação histológica e localização do tumor, não apresentaram associação com prognóstico; pacientes com tumores estádio III apresentam pior prognóstico.Abandono de tratamento está associado a pior prognóstico e relacionado à evolução clínica insatisfatória; cirurgia de amputação foi indicador indireto de mau prognóstico, pois foi realizada em pacientes com tumores avançados ou que não responderam ao tratamento quimioterápico neo-adjuvante; complicações, sobretudo recidiva local, estão relacionadas a mau prognóstico e necrose pós-quimioterapia apresentou associação significativa com sobrevida.Houve ocorrência de... / A possible association between prognosis and clinical, epidemiological, histopathological, and immunohistochemical factors was evaluated in 69 patients with confirmed diagnosis of primary and secondary bone osteosarcoma treated in the University Hospital of Botucatu Medical School, School of Medicine University Hospital, Unesp (Botucatu, SP, Brazil) and in Amaral Carvalho Hospital (Jaú, SP, Brazil), from 1990 to 2004. Patients were treated by differents treatment protocols and in the majority of resected tumour samples the effects of neoadjuvant chemotherapy were analyzed using Huvos criteria (1991). Data were collected from medical records and in pretreatment bone biopsies, apoptosis and p53 protein expression were evaluated by immunohistochemistry (Tunel and ABC). The results were submitted to univariantate analysis and global survival analyzed by Kaplan-Meier survival curves. Association between surgical procedure and necrosislevel or relapse was tested using Goodman test for differences between and in multinomial populations (Goodman, 1964, 1965). No association was found between prognosis and age, gender, tissue predominance and tumour location; patients with stage III tumours presented worse prognosis. Treatment whitdrawal implied in worse prognosis, as a consequence of unsatisfactory clinical evolution; amputation was an indirected factor of bad prognosis as a possible consequence of its indication for patients with advanced tumours or for those without response to neoadjuvant chemotherapy. Complications, especially local relapse, were related to bad prognosis; while post chemotherapy necrosis had a statistically significant association with survival. There was apoptosis and mutant protein p53 expression that initial phases of osteosarcoma, but without any association with prognosis.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27 / Objetivo: Investigar a imuno-expressão do c-kit e sua correlação com o prognóstico em pacientes portadores de Osteossarcoma e o efeito do Mesilato de Imatinibe (STI571) na proliferação e invasão de linhagens de células humanas de osteossarcoma. Material e Método Estudo retrospectivo com realização de imunohistoquímica dos blocos de parafina de 52 pacientes com osteossarcoma de extremidades de alto grau, tratados no Instituto de Oncologia Pediátrica e diagnosticados no Departamento de Patologia da UNIFESP. Somente espécimes pré-quimioterapia foram analisados. Imunoexpressão forte e citoplasmática foram considerados como positivos. A linhagem cellular MG 63 foi incubada e o efeito inibitório do STI571 na proliferação e invasão dessas células tumorais in vitro foi estudada. Resultados: 24 casos (46,15%) expressaram o c-kit, sendo que esses tumores positivos tiveram pior resposta à qumioterapia pré-operatória. Não foi encontrada correlação entre os casos c-kit positivos e sobrevida global e livre de doença. STI571 inibiu a proliferação de células de osteossarcoma in vitro, em baixas doses e a invasão dessas células, em altas doses. Conclusões: Osteossarcomas expressam c-kit e esses tumores c-kit positivos são maus respondedores (têm menos necrose) à quimioterapia pré-operatória. O Mesilato de Imatinibe inibe a proliferação de células de osteossarcomas que expressam o c-kit, mas não inibem a invasão. Esses achados permitem sugerir que o STI571 pode ser uma nova estratégia no tratamento dos pacientes portadores de osteossarcomas. / Purpose: To investigate the immunoexpression and its prognostic relevance of KIT in patients with osteosarcomas and the effect of Imatinib mesylate (STI571) on proliferation and invasion of human cell osteosarcoma line. Material and Methods: A retrospective immunohistochemical study was performed on archival formalin fixed paraffin-embedded tissue obtained from Department of Pathology of Federal University of São Paulo of 52 high-grade patients with primary osteosarcomas of extremities treated at the Instituto de Oncologia Pediátrica. Only pre-chemotherapy specimens were analysed. Strong cytoplasmic and membranous staining cases were taken as positive. The human cell line MG 63 was incubated and inhibitory effect of STI571 on cell proliferation and invasion was studied. Results: Twenty four cases (46,15%) expressed c-kit and tumours ckit positive had lower necrosis pos chemotherapy. No correlation was found between ckit expression and overall and disease free survival. STI571 inhibited the rates of cell growth of osteosaroma cells in low doses and invasion in high doses Conclusions: Tumours c-kit positives had worse response to chemotherapy and STI571 plays a role in blocking or slowing the rate of growth of osteosarcoma cells expressing ckit, but not the invasive capacity of these neoplastic cells. These data suggested that Imatinib Mesylate could be a therapeutic target of strategies against Osteosarcoma that express c-kit. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Osteosarcoma is the most common type of primary malignant bone tumors, affecting mostly children, adolescents and young adults. The standard treatment used in osteosarcomas, is done through the application of a neoadjuvant chemotherapeutic agent followed by surgical resection. Due to the low sensitivity of osteosarcoma to ionizing radiation, this treatment is not used very often and can be recommended only for post-surgical treatment. Considering the difficulties with these treatments, there is an emerging need to find new therapies for this tumor type. The nanostructured systems acting as radioisotopes carriers have promising potential in the treatment of osteosarcoma, allowing more selective employment of radiation on tumor cells and enhancing the radiosensitivity of tumors because they can maintain a higher proximity between the radioisotope and tumor cells. In the present work, it was prepared a hybrid system consisting of mesoporous hydroxyapatite nanoparticles functionalized with collagen and poly (alcohol vinyl), the incorporation of the elements yttrium and gadolinium was promoted and the anti-tumor activity of these systems on the lineage of T89, human cells of glioblastoma, was evaluated. Hydroxyapatite samples were synthesized by five different routes and characterized by the techniques of X-ray diffraction (XRD), infrared spectroscopy (FTIR), gas adsorption and transmission electron microscopy (TEM), and the results of these analyzes indicated the formation of carbonated hydroxyapatite mesoporous nanoparticles in single phase by three routes. The sample synthesized by Route 3c, due to the largest surface area and pore volume, was chosen to be submitted to the functionalization process with PVA and collagen. The functionalized samples were characterized by the techniques of XRD, FTIR, gas adsorption , CHN elemental analysis , scanning electron microscopy (SEM) and photon correlation spectroscopy, and these analyzes indicated that the functionalization process was successful. The potential for incorporation and release kinetics of yttrium and gadolinium to functionalized samples were studied with stable isotope of this element by the technique of atomic emission spectrometry with inductively coupled plasma (ICP-AES) revealing a potential merger of 44% and 100% for yttrium and gadolinium respectively and low isotope release kinetics for both systems, qualifying the material for neutron activation analysis and for in vitro cytotoxicity. Biological tests indicated qualitatively that the materials have a potential for the proposal of this work. / O osteossarcoma é o tipo mais comum entre os tumores ósseos malignos primários, atingindo principalmente crianças, adolescentes e adultos jovens. O tratamento padrão empregado em osteossarcomas, é feito através da aplicação de um agente neoadjuvante quimioterápico seguido de ressecção cirúrgica. Devido à baixa sensibilidade dos osteossarcomas à radiação ionizante, este tipo de tratamento não é utilizado com muita frequência, podendo ser recomendado apenas para o tratamento pós-cirúrgico. Considerando esta dificuldade e as limitações impostas, existe uma necessidade emergente para encontrar novas alternativas terapêuticas para esse tipo de tumor. Os sistemas nanoestruturados carreadores de radioisótopos apresentam um potencial promissor para o tratamento dos osteossarcomas, permitindo o emprego mais seletivo das radiações em células tumorais e podendo aumentar a radiossensibilidade desses tumores devido à proximidade que podem manter entre os radioisótopos e as células tumorais. No presente trabalho, foi preparado um sistema híbrido constituído por nanopartículas mesoporosas de hidroxiapatita funcionalizadas com colágeno e álcool polinivílico contendo os radioisótopos ítrio-90 e gadolinio-159 para avaliar a atividade anti-tumoral desse sistema sobre a linhagem de células T98 de fibroblasto humano. As amostras de hidroxiapatita foram sintetizadas por cinco rotas distintas e caracterizadas pelas técnicas de difração de raios X (DRX), espectroscopia na região do infravermelho (FTIR), adsorção de gases e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os resultados dessas análises indicaram a formação de nanopartículas de hidroxiapatita carbonatada de fase única e mesoporosas em quatro das cinco rotas. A amostra sintetizada pela rota 3c, por ter apresentado a maior área superficial e volume de poros, foi escolhida para ser submetida ao processo de funcionalização com PVA e colágeno. As amostras funcionalizadas foram caracterizadas pelas técnicas de DRX, FTIR, adsorção de gases, análise elementar CHN, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de correlação de fótons, que indicaram que o processo de funcionalização foi bem sucedido. O potencial de incorporação e a cinética de liberação de ítrio e gadolínio em relação à amostra funcionalizada foram estudados com os isótopos estáveis desses elementos pela técnica de espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-AES) que revelou um potencial de incorporação de 44% e 100% para o ítrio e gadolínio, respectivamente, e baixa cinética de liberação dos isótopos para os dois sistemas, credenciando o material para a ativação neutrônica e para os estudos citotoxidade in vitro. Os testes biológicos indicaram qualitativamente que os materiais possuem um potencial para a proposta desse trabalho.

O osteossarcoma é um tumor ósseo maligno comum em cães, com preferência por raças de grande porte, tem alto potencial metastático e ocorre frequentemente no esqueleto apendicular. O diagnóstico é baseado na história clínica, exame físico, achados radiológicos e histopatológicos. O tratamento consiste na ressecção cirúrgica do tumor e o protocolo de tratamento de escolha é a amputação associada à quimioterapia. O osteossarcoma apresenta semelhanças em cães e humanos, portanto o osteossarcoma canino pode ser um modelo útil para estudar esta doença em humanos. O objetivo deste trabalho foi estabelecer e caracterizar a linhagem celular primária de osteossarcoma canino. Os fragmentos tumorais foram obtidos por meio de biópsias e excereses cirúrgicas do osteosarcoma, a confirmação diagnóstica realizada pelo exame histopatológico. Os fragmentos foram cultivados em meios de cultura DMEM-H, DMEM-Low, RPMI-1640 e MEM para obtenção das linhagens. Para análise da morfologia celular foi realizada a fotodocumentação das garrafas em microscopia invertida, microscopia eletrônica de transmissão e varredura. A caracterização dos marcadores de superfície, citoplasmáticos e nucleares, análise das fases do ciclo celular e potencial elétrico mitocondrial foram realizados por citometria de fluxo. Foram obtidos 6 tumores, sendo 5 osteossarcomas e um condrossarcoma, dos quais foram obtidas 3 linhagens OST-1, OST-3, e CDS1. Os meios de cultivo DMEM-H e MEM foram eficientes para obtenção e manutenção das linhagens. Morfologicamente as células OST-1, apresentaram aspecto fusiforme enquanto as células OST-3 apresentaram pleomorfismo celular. Os marcadores de superfície, citoplasmáticos e nucleares nas células de osteossarcoma canino OST-3 apresentaram-se diferencialmente expressos, como os marcadores de origem mesenquimal, o marcador de reparo de DNA, P53, não foi expresso como também é encontrado em inúmeras linhagens de osteossarcoma. / Osteosarcoma is a common malignant bone tumor in dogs, with a preference for large breeds, has a high metastatic potential and occurs often in the appendicular skeleton. Diagnosis is based on clinical history, physical examination, radiological and histopatological findings. The treatment consists in surgical tumor resection, and treatment protocol choice is amputation associated with chemotherapy. Osteosarcoma has many similarities in dogs and humans, thus the canine osteosarcoma can be a usefull model to study this disease in humans. The aim of this work was to establish and characterize the canine osteosarcoma primary cell line. Tumor samples were obtained by surgical biopsy and the osteosarcoma confirmation was made by histopathological examination. Tumor fragments were cultured in DMEM-H, DMEM- LOW, RPMI-1640 and MEM culture media to establish the cell lines. Cell morphology analysis was carried out by photodocumentation in inverted microscopy and in transmission electron microscopy. The characterization of surface, cytoplasmic and nuclear markers and cell cycle phases, and mitochondrial electric potential analysis were performed by flow cytometry and analyzed with the Win MDI 2.8. Five osteosarcomas, 1 chondrosarcoma, and three cancer cell lines, OST-1, OST-3, and CDS1, were obtained. DMEM-H and MEM culture medium were efficient in cell lines establishing and maintenance. OST-1 cell line showed spindle shaped and OST-3 cell line showed pleomorphism. Surface, cytoplasmic and nuclear markers in the OST-3 canine osteosarcoma cell line were differentially expressed as mesenchimal origin markers, the DNA repair marker, P53, it was not expressed, it is also found in other osteossarcoma lines.

Resumo: Em 69 pacientes com diagnóstico de osteossarcoma ósseo, primário e secundário, submetidos a tratamento no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp (Botucatu - SP) e no Hospital Amaral Carvalho (Jaú - SP), no período de 1990 a 2004, foi verificada a possível associação entre prognóstico e fatores clínicos, epidemiológicos, histopatológicos e imuno-histoquímicos.Os pacientes foram submetidos a diferentes protocolos de tratamento e, na maioria das peças de ressecção tumoral, procedeu-se à quantificação do efeito quimioterápico neo-adjuvante de acordo com os critérios preconizados por Huvos (1991). Os dados foram coletados dos prontuários hospitalares e nas amostras da biópsia óssea, realizada prétratamento, foi verificada a ocorrência de apoptose e da expressão da proteína p53, pelo método imuno-histoquímico (Tunel e ABC).Os resultados foram submetidos à análise univariada de sobrevida com construção de curvas de Kaplan-Meier.As associações entre procedimento cirúrgico e grau de necrose e, entre recidiva e grau de necrose, foram analisadas pelo Teste de Goodman (Goodman, 1964,1965).Foi constatado que as variáveis, idade, sexo, classificação histológica e localização do tumor, não apresentaram associação com prognóstico; pacientes com tumores estádio III apresentam pior prognóstico.Abandono de tratamento está associado a pior prognóstico e relacionado à evolução clínica insatisfatória; cirurgia de amputação foi indicador indireto de mau prognóstico, pois foi realizada em pacientes com tumores avançados ou que não responderam ao tratamento quimioterápico neo-adjuvante; complicações, sobretudo recidiva local, estão relacionadas a mau prognóstico e necrose pós-quimioterapia apresentou associação significativa com sobrevida.Houve ocorrência de ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: A possible association between prognosis and clinical, epidemiological, histopathological, and immunohistochemical factors was evaluated in 69 patients with confirmed diagnosis of primary and secondary bone osteosarcoma treated in the University Hospital of Botucatu Medical School, School of Medicine University Hospital, Unesp (Botucatu, SP, Brazil) and in Amaral Carvalho Hospital (Jaú, SP, Brazil), from 1990 to 2004. Patients were treated by differents treatment protocols and in the majority of resected tumour samples the effects of neoadjuvant chemotherapy were analyzed using Huvos criteria (1991). Data were collected from medical records and in pretreatment bone biopsies, apoptosis and p53 protein expression were evaluated by immunohistochemistry (Tunel and ABC). The results were submitted to univariantate analysis and global survival analyzed by Kaplan-Meier survival curves. Association between surgical procedure and necrosislevel or relapse was tested using Goodman test for differences between and in multinomial populations (Goodman, 1964, 1965). No association was found between prognosis and age, gender, tissue predominance and tumour location; patients with stage III tumours presented worse prognosis. Treatment whitdrawal implied in worse prognosis, as a consequence of unsatisfactory clinical evolution; amputation was an indirected factor of bad prognosis as a possible consequence of its indication for patients with advanced tumours or for those without response to neoadjuvant chemotherapy. Complications, especially local relapse, were related to bad prognosis; while post chemotherapy necrosis had a statistically significant association with survival. There was apoptosis and mutant protein p53 expression that initial phases of osteosarcoma, but without any association with prognosis. / Orientador: Sérgio Swain Müller / Coorientador: Anete Kinumi Ueda / Banca: Ademar Lopes / Banca: Odair Carlito Michelin / Banca: Hamilton da Rosa Pereira / Banca: Mauricio Etchebehere / Doutor

O osteossarcoma é um tumor ósseo maligno comum em cães, com preferência por raças de grande porte, tem alto potencial metastático e ocorre frequentemente no esqueleto apendicular. O diagnóstico é baseado na história clínica, exame físico, achados radiológicos e histopatológicos. O tratamento consiste na ressecção cirúrgica do tumor e o protocolo de tratamento de escolha é a amputação associada à quimioterapia. O osteossarcoma apresenta semelhanças em cães e humanos, portanto o osteossarcoma canino pode ser um modelo útil para estudar esta doença em humanos. O objetivo deste trabalho foi estabelecer e caracterizar a linhagem celular primária de osteossarcoma canino. Os fragmentos tumorais foram obtidos por meio de biópsias e excereses cirúrgicas do osteosarcoma, a confirmação diagnóstica realizada pelo exame histopatológico. Os fragmentos foram cultivados em meios de cultura DMEM-H, DMEM-Low, RPMI-1640 e MEM para obtenção das linhagens. Para análise da morfologia celular foi realizada a fotodocumentação das garrafas em microscopia invertida, microscopia eletrônica de transmissão e varredura. A caracterização dos marcadores de superfície, citoplasmáticos e nucleares, análise das fases do ciclo celular e potencial elétrico mitocondrial foram realizados por citometria de fluxo. Foram obtidos 6 tumores, sendo 5 osteossarcomas e um condrossarcoma, dos quais foram obtidas 3 linhagens OST-1, OST-3, e CDS1. Os meios de cultivo DMEM-H e MEM foram eficientes para obtenção e manutenção das linhagens. Morfologicamente as células OST-1, apresentaram aspecto fusiforme enquanto as células OST-3 apresentaram pleomorfismo celular. Os marcadores de superfície, citoplasmáticos e nucleares nas células de osteossarcoma canino OST-3 apresentaram-se diferencialmente expressos, como os marcadores de origem mesenquimal, o marcador de reparo de DNA, P53, não foi expresso como também é encontrado em inúmeras linhagens de osteossarcoma. / Osteosarcoma is a common malignant bone tumor in dogs, with a preference for large breeds, has a high metastatic potential and occurs often in the appendicular skeleton. Diagnosis is based on clinical history, physical examination, radiological and histopatological findings. The treatment consists in surgical tumor resection, and treatment protocol choice is amputation associated with chemotherapy. Osteosarcoma has many similarities in dogs and humans, thus the canine osteosarcoma can be a usefull model to study this disease in humans. The aim of this work was to establish and characterize the canine osteosarcoma primary cell line. Tumor samples were obtained by surgical biopsy and the osteosarcoma confirmation was made by histopathological examination. Tumor fragments were cultured in DMEM-H, DMEM- LOW, RPMI-1640 and MEM culture media to establish the cell lines. Cell morphology analysis was carried out by photodocumentation in inverted microscopy and in transmission electron microscopy. The characterization of surface, cytoplasmic and nuclear markers and cell cycle phases, and mitochondrial electric potential analysis were performed by flow cytometry and analyzed with the Win MDI 2.8. Five osteosarcomas, 1 chondrosarcoma, and three cancer cell lines, OST-1, OST-3, and CDS1, were obtained. DMEM-H and MEM culture medium were efficient in cell lines establishing and maintenance. OST-1 cell line showed spindle shaped and OST-3 cell line showed pleomorphism. Surface, cytoplasmic and nuclear markers in the OST-3 canine osteosarcoma cell line were differentially expressed as mesenchimal origin markers, the DNA repair marker, P53, it was not expressed, it is also found in other osteossarcoma lines.

O osteossarcoma (OS) é o tumor maligno primário mais comum do tecido ósseo, caracterizado pela formação de osteócitos anormais. Apesar do avanço nas terapias convencionais (quimioterapia e retirada do tumor), essas não conseguem eliminar totalmente as células tumorais e impedir a progressão da doença. Recentemente, agentes derivados de fontes naturais ganharam considerável atenção por causa de sua segurança, eficácia e disponibilidade imediata. Nesse sentido, a apocinina, inibidor do complexo NADPH-oxidase, vem sendo estudada como agente antitumoral em alguns tipos de câncer como: pâncreas, próstata, pulmão e mama. Apocinina é um pró-fármaco e sua ação parece estar relacionada à sua conversão produzindo a diapocinina, a qual se mostrou mais efetiva do que a apocinina. Portanto, o objetivo desse estudo é avaliar, in vitro, o potencial antitumoral da apocinina e diapocinina em células de osteossarcoma humano. Para isso, foram utilizados osteoblastos humanos normais (HOb) e osteossarcoma humano imortalizadas (SaOS-2) tratados ou não com apocinina e diapocinina em diversas concentrações. Foram realizados os ensaios de viabilidade celular, alterações morfológicas, apoptose celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), formação de colônias, migração, invasão e expressão do fator indutor de hipóxia-1alfa (HIF-1). Também foram conduzidos ensaios para verificar a atividade de metaloproteinase de matriz (MMP) 2 e 9. Os resultados em SaOS-2 mostraram que o tratamento com apocinina nas concentrações de 1,5 e 3 mM; e diapocinina nas concentrações de 0,75 e 1,5 mM reduziram a viabilidade; aumentaram o número de células em apoptose e diminuíram a produção de EROs; sem causar danos às células HOb. Além disso, essas mesmas concentrações inibiram a migração e invasão celular; diminuíram a expressão de HIF-1; e reduziram a atividade de MMP-2 em SaOS-2. Considerando os resultados obtidos, concluímos que a apocinina e diapocinina podem atuar como possíveis moduladores de células tumorais, sendo que a diapocinina mostrou ser mais efetiva nos parâmetros testados. / Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant tumor of bone tissue, characterized by the formation of abnormal osteocytes. Despite advances in conventional therapies (chemotherapy and surgery) they cannot completely eliminate tumor cells and prevent the progression of the disease. Recently, agents derived from natural sources have achieved considerable attention because of their safety, efficacy and immediate availability of therapies. In this way, apocynin, an inhibitor of the NADPH-oxidase complex, has been studied as an antitumor agent in some types of cancer, such as pancreas, prostate, lung and breast. Apocynin is a prodrug and its action indicate to be related to its conversion to diapocynin, which has been shown to be more efficient than apocynin itself. Thus, the aim of this study is to evaluate, in vitro, the antitumor potential of apocynin and diapocynin in human osteosarcoma cells. For this, normal human osteoblasts (HOb) and immortalized human osteosarcoma cells (SaOS-2) were treated or no-treated with apocynin and diapocynin in various concentrations. Cell viability assay, morphological alterations, cellular apoptosis, reactive oxygen species (ROS) production, colony formation, migration, invasion and expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1) were performed. We also performed assays to verify the activity of matrix metalloproteinase (MMP) 2 and 9. The results in SaOS-2 showed that treatment with apocynin at concentrations of 1,5 e 3 mM; and diapocynin at concentrations of 0,75 e 1,5 mM reduced cell viability; increased the number of cells in apoptosis and decreased the production of ROS; without damaging HOb cells. Moreover, these same concentrations inhibited cell migration and invasion; decreased HIF-1 expression; and reduced MMP 2 activity in SaOS-2. Considering the results, we suggest that apocynin and diapocynin may act as possible modulators of tumor cells, and diapocynin has been shown to be more effective.

Metástase é o fator prognóstico mais importante em pacientes com osteossarcoma. A identificação de genes que são cruciais para disseminação metastática é de grande interesse não só para o entendimento básico dos processos moleculares e celulares envolvidos, mas também por prover um potencial de novos alvos terapêuticos. No osteossarcoma tem sido relatado que o gene Ezrin, membro da família ERM (Ezrin- Radixin-Moesin) é importante para que ocorra metástase. Consiste em um componente do citoesqueleto que tem sido responsavel por muitas funções, como, por exemplo, como condutor de sinais entre superfície celular associada à metástase e tradução do sinal. Isto sugere que o gene Ezrin têm a chave da coordenação de sinais e do complexo celular que são necessários para o sucesso da ocorrência de metástases. CD44 é conhecida como a primeira proteína de superfície que demonstrou interação com as proteínas do complexo ERM. Formam um complexo que exerce diversos papéis em células normais e particularmente nas células do câncer. Aumento na expressão de CD44 potencialmente leva a um aumento funcional da ativação do Ezrin e tem sido correlacionada com aumento da invasão do osteossarcoma. Objetivo: A proposta deste estudo é correlacionar a expressão da proteína Ezrin e CD44 com fatores clínicos, identificar fatores prognósticos, sugerindo uma estratificação dos pacientes de risco, para que possa ser proposta no futuro uma terapêutica mais efetiva e com menor toxicidade. Casuística e Métodos: Foram revistos 52 pacientes com osteossarcoma tratados no Hospital de Câncer de Barretos entre 2000 e 2005. O tumor ósseo é uma das neoplasias sólidas mais freqüentes em nossa Instituição, representando aproximadamente 15% dos casos novos/ano. Devido a algumas particularidades, como atendimentos de pacientes em âmbito nacional, tivemos 46,2 % de pacientes metastáticos ao diagnóstico, 37,3 % de tumores maiores que 15 cm, 30,2 % de amputações e 11,5 % de recaídas locais em cirurgias conservadoras. Não demonstramos associação da duração dos sintomas com o tamanho do tumor, presença de metástases. O nível de expressão da proteína Ezrin e CD44H foi avaliado por imunoistoquimica na biópsia inicial em 34 amostras. O nível de expressão pela coloração imunoistoquímica foi classificada em 1+ (1 - 25%), 2+ (26 - 50%), 3+ (51 - 75%), 4+ (76 - 100%) para a proteína Ezrin e o CD44 foi classificada como negativa (até 10%), 1+ (até 50%) e 2+ (até 100%). Foi realizado um escore para classificar a expressão do Ezrin em baixa e alta expressão (levando em consideração a intensidade e a proporção de células coradas) e interação da expressão de ezrin com grau de responsividade à quimioterapia. A associação entre as variáveis foi realizada usando o teste de quiquadrado. O cálculo dos estimadores da probabilidade de sobrevida foi realizado pelo técnica de Kaplan-Meier e as comparações entre as curvas foi realizado pelo teste de log rank. Resultados: A imunorreatividade da proteína Ezrin foi detectada na maioria dos pacientes com osteossarcoma (76%), com igual distribuição em citoplasma e membrana (38,2%). Quanto à intensidade de coloração, tivemos 58,9% forte. Na escala semiquantitativa metade dos casos apresentou mais de 50% das células coradas. No escore que associa intensidade de coloração e proporção de células coradas tivemos 50,0% com alta expressão. Cinqüenta por cento dos pacientes apresentaram CD44H positivo, sendo predominante no citoplasma (38,2%). Na escala semiquantitativa 20,6 % apresentava coloração em mais de 50% das células. Ambos os marcadores não mostraram associação a nenhuma variável clínico-patológicas estudada. Entre os pacientes que apresentaram imunoreatividade de ezrin positivos a taxa de sobrevida apresentada em 5 anos foi de 12,8% versus com 41,7% dos pacientes com ezrin negativo.(p = 0,121). O escore realizado com a imunoreatividade de ezrin também não mostrou papel na sobrevida (p: 0,558). Já a interação da positividade de Ezrin com má resposta histológica para pacientes não metastáticos mostrou associação com sobrevida livre de recaída em 5 anos (100% x 12,7%; p: 0,042). Quanto à taxa de sobrevida global foi semelhante para pacientes com CD44 positivo (21,5%) ou negativo (25,3%) (p: 0,676). Conclusão: Em nossa experiência, a imunoexpressao de CD44H nem Ezrin mostraram ser preditor do prognóstico em pacientes com osteossarcoma. Os resultados sugerem que são necessárias outras investigações para melhor definir a relação entre padrão de expressão de Ezrin e CD44, status funcional e sobrevida em portadores de osteossarcoma. / Metastasis is the most important prognostic factor in patients with osteosarcoma. Identification of genes that are crucial for metastatic dissemination is of great interest, not only to gain a basic understanding of the molecular and cellular processes involved, but also to provide the potential for new therapeutic targets. In relation to osteosarcoma, it has been reported that the Ezrin gene, a member of the ERM family (ezrin-radixin-moesin), is important for enabling metastasis. Ezrin is a component of the cytoskeleton that has been implicated in many functions, for example as a conductor of signals between cell surfaces associated with metastasis and signal translation. This suggests that Ezrin holds the key to coordination of the signals and cell complexes needed for successful metastasis to occur. CD44 is known as the first surface protein that was shown to interact with proteins of the ERM complex. It forms a complex that plays various roles in normal cells and particularly in cancer cells. Increased CD44 expression potentially leads to functional increases in Ezrin activation and has been correlated with greater osteosarcoma invasion. Objective: The aim of this study was to correlate the expression of the Ezrin and CD44 proteins with clinical factors and identify prognostic factors, thereby enabling stratification of patients at risk, so that therapy of greater effectiveness and lower toxicity can be proposed in the future. Sample and Methods: Data on 52 patients with osteosarcoma who were treated at Barretos Cancer Hospital between 2000 and 2005 were reviewed. Bone tumors are among the types of solid neoplasia most frequently seen in our institution, accounting for around 15% of the new cases every year. Because of certain special features such as our institution\'s national-level attendance, 46.2% of the patients were metastatic at diagnosis, 37.3% of the tumors were larger than 15 cm, 30.2% of the cases led to amputation and 11.5% of the conservatively operated cases presented local relapse. We did not find any association between symptoms and either tumor size or presence of metastases. The expression levels of the Ezrin and CD44H proteins were evaluated using immunohistochemistry on the initial biopsy, for 34 samples. From the immunohistochemical staining, the Ezrin protein expression level was classified as 1+ (1 - 25%), 2+ (26 - 50%), 3+ (51 - 75%) or 4+ (76 - 100%). CD44 was classified as negative (up to 10%), 1+ (up to 50%) or 2+ (up to 100%). The Ezrin expression was scored to classify it as low or high (considering the intensity and proportion of stained cells) and the interaction of Ezrin expression with the degree of responsiveness to chemotherapy. The chi-square test was used to correlate the variables. Estimators for survival likelihood were calculated using the Kaplan-Meier technique and the curves were compared using the log-rank test. Results: Most patients with osteosarcoma (76%) were immunoreactive for Ezrin protein, equally distributed between cytoplasm and membrane (38.2%). High-intensity staining was found in 58.9%. On the semiquantitative scale, half of the cases presented more than 50% of the cells stained. From the score correlating staining intensity and proportion of cells stained, 50.0% showed high expression. Half of the patients were positive for CD44H, predominantly in cytoplasm (38.2%). On the semiquantitative scale, 20.6% presented staining in more than 50% of the cells. Neither of the markers showed associations with any of the clinicopathological variables studied. Among the patients who were immunoreactive for Ezrin, the five-year survival rate was 12.8%, while it was 41.7% among Ezrinnegative patients (p = 0.121). The score relating to Ezrin immunoreactivity was not shown to have a role in survival (p = 0.558). However, the interaction between Ezrinpositive findings and poor histological response among non-metastatic patients showed an association with five-year relapse-free survival (100% x 12.7%; p = 0.042). The overall survival rates for CD44-positive and negative patients were similar (21.5% and 25.3%, respectively) (p = 0.676). Conclusion: In our experience, neither CD44H nor Ezrin immunoexpression predicted the prognosis for patients with osteosarcoma. The results suggest that further investigations are needed in order to better define the relationships between Ezrin and CD44 expression patterns, functional status and survival among patients with osteosarcoma.

O osteossarcoma (OS) é o tumor ósseo maligno mais freqüente da infância e adolescência com uma taxa de sobrevida livre de eventos de 50 70% após 3 anos.. O pico de incidência ocorre na segunda década da vida, característica que sugere uma relação entre o rápido crescimento ósseo da adolescência e o desenvolvimento da neoplasia. Ainda, o conhecimento das bases genéticas é insuficiente. Estudos de citogenética clássica têm demonstrado que o OS caracteriza-se por exibir alta heterogeneidade cariotípica, incluindo altos graus de aneuploidia e rearranjos estruturais complexos. A técnica de CGH constitui uma ferramenta valiosa na analise do perfil genômico de tumores sólidos, e tem confirmado a complexidade das alterações cariotípicas em OS, descrita pela citogenética convencional. Não obstante, os estudos existentes são divergentes, e poucos têm estudado as informações obtidas por CGH em relação com a progressão tumoral. O objetivo do presente estudo foi identificar a presença de desequilíbrios cromossômicos em amostras de OS por meio da técnica de CGH. Os experimentos de CGH foram realizados de acordo com o descrito por Kallioniemi et al (1994). Foram analisadas nove amostras (3 biópsias, 5 ixressecções após quimioterapia e 1 metástase). O CGH detectou desequilíbrios cromossômicos em todas as amostras. Os ganhos foram mais freqüentes que as perdas. Muitas alterações cromossômicas foram observadas, especialmente ganhos nos cromossomos 1q, 2, 3p, 4, 5p, 6, 7, 8, 11p, 14q, 16, 21q e X; e perdas nos cromossomos 1p, 2q, 3q, 5q, 9q, 11q e 17q. As regiões mínimas de sobreposição mais freqüentes foram ganhos de 2p13-p14, 2q36-q37, 4q21 e 8p22, e perdas de 1p34.2, 3q22-q23 e 3q24. Três pacientes apresentaram amostras pareadas, e as alterações cromossômicas detectadas foram muito variadas, refletindo a heterogeneidade cromossômica intratumoral em cada caso. A mais alta divergência clonal entre as amostras pareadas foi observada entre a amostra de ressecção e a amostra metastática correspondente, mostrando a complexidade cromossômica adquirida durante a progressão e metastatização no caso descrito. Ainda são necessárias investigações adicionais, que contribuíam para a caracterização completa dos genes localizados nessas regiões. / Osteosarcoma (OS) is the most frequent aggressive bone malignancy affecting children and young adults with an event-free survival of 50-70% after 3 years. The incidence peak occurs during the second decade of life, suggesting a relationship between rapid bone growth and the development of this tumor. The knowledge of the genetic basis behind tumor progression is still limited. Conventional cytogenetic studies have demonstrated that OS exhibits high cariotipic heterogeneity, with different degrees of aneuploidy and complex structural rearrangements. The CGH is an important tool for studying the genomic profiles of solid tumors, and has confirmed the complexity of cariotipic alterations in OS. However, previous studies have shown divergent results and few have correlated them with tumor progression. The objective of present study was to identify chromosome unbalances in nine samples of OS by CGH. 3 biopsies, 5 resections before quimioterapy and 1 metastasis were analyzed. The experiments were performed accordingly with Kallioniemi et al (1994). CGH detected chromosomal imbalances in all samples. Gains were more frequent than losses. Many chromosomal alterations were observed, especially gains at 1q, xi2, 3p, 4, 5p, 6, 7, 8, 11p, 14q, 16, 21q and X; and losses at 1p, 2q, 3q, 5q, 9q, 11q and 17q. The minimal regions of superposition were gains of 2p13-p14, 2q36-q37, 4q21 and 8p22, and losses of 1p43.2, 3q22-q23 and 3q24. Three patients had consecutive samples, and the chromosomal alterations varied, reflecting the chromosomal heterogeneity for each case. The highest clonal divergence among the consecutive samples was observed between resection and the corresponding metastatic sample, showing the chromosomal complexity acquired during the progression and dissemination in this case. Additional investigations for the characterization of genes at these regions are necessary.

O Osteossarcoma é o tipo mais comum de câncer ósseo em cães e em seres humanos. Os osteossarcomas caninos representam um modelo único para o estudo desse tipo de câncer em humanos, devido a incidência relativamente alta, semelhanças no comportamento biológico, na apresentação clínica e características moleculares. Estudos envolvendo o desenvolvimento do fenótipo de osteoblastos em osteócitos terminalmente diferenciados, oferecem as bases para o entendimento do curso da transformação neoplásica. Neste sentido, a rápida expansão do conhecimento a respeito do processo de diferenciação óssea, em última análise pode conduzir ao desenvolvimento de marcadores diagnóstico e prognóstico, bem como terapias dirigidas para pacientes caninos e humanos portadores deste tipo de câncer. Este estudo teve por objetivos avaliar alguns dos aspectos relacionados ao processo de diferenciação induzida de osteoblastos caninos após o tratamento com três diferentes agentes descritos como tendo possível potencial antineoplásico. Para tanto, avaliou-se, em cultura celular em três dimensões, duas linhagens de osteossarcoma após tratamento com a Arctigenina, a Genisteína e a Tricostatina-A. inicialmente, foi realizado o estabelecimento e caracterização de uma nova linhagem celular de osteossarcoma canino. Em seguida deu-se inicio aos trabalhos de avaliação dos marcadores de diferenciação por diferentes técnicas. Foram também utilizados estudos de viabilidade celular, ensaios de proliferação e morte celular induzida, assim como de invasão. Os resultados mostraram que todos os três tratamentos foram capazes de induzir diferenciação parcial nas linhagens de osteossarcoma, visto a heterogeneidade dos dados coletados, assim como, pela expressão parcial de marcadores tardios da transição osteoblasto/osteócito. Associado a isso se verificou que existe um decréscimo da viabilidade celular, porem sem ação diretamente ligada a caspase3. Notou-se ainda que mesmo com diferenças entre as linhagens, os princípios ativos foram capazes de inibir a capacidade de invasão nos ensaios de Transwell. Conclui-se, desta maneira, que os compostos utilizados induzem diferenciação parcial, porém, com efeito, antineoplásico importante. Em conjunto, estes resultados destacam a importância do processo de diferenciação, tumorigênese e terapia através da diferenciação. / Osteosarcoma is the most common type of bone cancer in dogs and humans. Due to the fact that canine osteosarcoma is similar to human osteosarcoma in its high occurrence rate, biological behavior, clinical signs and molecular characteristics, this naturally occurring canine disease represents an important model for the study of osteosarcoma in humans. Studies regarding the development of the osteoblast phenotype into terminally differentiated osteocytes provide an understanding of the neoplastic transformation in bone cancer. For this reason, further studies of bone differentiation may lead to the discovery of bone-tumorspecific markers used for disease detection and prognosis, and the development of drugtargeted therapies. The focus of this study is the process of induced bone differentiation after treatment with three different drugs that have a potential anti-neoplastic activity against osteosarcoma. Two osteosarcoma cell lines in three-dimensional culture were evaluated after being treated with Arctigenin, Genistein, and Trichostatin-A. Initially, we performed the establishment and characterization of a novel canine osteosarcoma cell line. Then the work on the evaluation of differentiation markers by different techniques has been initiated. Studies were also used for cell viability, proliferation assays and induced cell death, as well as invasion. The results showed that all three treatments were able to induce partial differentiation in osteosarcoma cell lines, since the heterogeneity of the data collected, as well as the partial expression of markers of late transition osteoblast / osteocyte. Associated with this it was found that there is reduced cell viability, but without acting directly connected to caspase3. It is further noticed that even with differences between strains, the active principles were able to inhibit the invasiveness in Transwell assay. The conclusion is thus that the partial differentiation inducing compounds used, but with important antineoplastic effect. Together, these results highlight the importance of the process of differentiation, tumorigenesis and differentiation therapy.