Resumo: A apocinina, um métoxi-catecol (MC) extraído das raízes da planta Picrorhiza kurroa, é um eficiente inibidor do complexo NADPH oxidase (NOX) e seu mecanismo de ação está relacionado à inibição da agregação dos componentes enzimáticos e à oxidação catalisada por peroxidases. Estudamos a relação estrutura-atividade da apocinina e de metóxi-catecóis correlatos, na inibição da NOX. Com a função de alterar o potencial de redução das moléculas estudadas, escolhemos MC com grupos adicionais aceptores (MC-A) ou doadores de elétrons (MC-D) na posição para, em relação à hidroxila da molécula de apocinina. Os MC-D inibiram mais fracamente a ativação da NOX em neutrófilos ativados quando comparados aos MC-A. Acreditamos que isso se deva à fraca reatividade destes compostos com grupamentos sulfidrila de proteínas, assim, os MC-D são incapazes de oxidar grupos essenciais aos componentes citosólicos da enzima e desta forma, inibir sua ativação. A diapocinina, metabólito gerado após a oxidação da apocinina por peroxidases, foi sintetizada e avaliamos seus efeitos em neutrófilos e leucócitos mononucleares ativados quanto à inibição da ativação da NOX e em leucócitos mononucleares, em relação à liberação de citocinas e expressão do RNAm do componente de membrana gp91phox. Encontramos que a apocinina e a diapocinina inibiram os três fenômenos estudados, embora a diapocinina o tenha feito de modo mais eficiente. Acreditamos que isto possa estar relacionado ao efeito supressor da apocinina e diapocinina sobre a ativação da NADPH oxidase / Abstract: Apocynin, a methoxy catechol (MC) extracted from the roots of Picrorhiza kurroa has been used as an efficient inhibitor of the NADPH oxidase (NOX) complex and its mechanism of action involves the impairment of the assemble process of the enzyme. Here, we studied the structure-activity relationship for apocynin and analogous ortho-methoxy-substituted catechols as inhibitors of the NADPH oxidase. Aiming to alter the reduction potential, the ortho-methoxy-catechol moiety was kept constant and the substituents at para position related to the hydroxyl group were varied. Two series of compounds were employed: methoxy-catechols bearing electron-withdrawing groups (MC-W) and methoxy-catechol bearing electron-donating groups (MC-D). We found that MC-D were weaker inhibitors of the NOX complex in stimulated neutrophils compared to MD-W. We suggest that there is a close relationship between the weak reactivity of MC-D compounds with sulfhydryl residues of proteins and there incapacity in inhibiting NOX activation. Diapocynin is a product generated by peroxidase oxidation of apocynin. Here we synthesized diapocynin and compared its efficacy as NOX inhibitor in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and neutrophils in relation to apocynin. Both drugs were also studied in cytokine release and its influence on gp91phox mRNA expression. We found that diapocynin was a more efficient inhibitor of NOX activation, gp91phox mRNA expression and cytokine release than apocynin. We suggest that these findings could be related to NOX inhibition process / Orientador: Valdecir Farias Ximenes / Coorientador: Luiz Marcos da Fonseca / Banca: Dulce Helena Siqueira Silva / Banca: Paulo Inácio da Costa / Banca: José Carlos Rebuglio Vellosa / Banca: Cleni Mara Marzocchi Machado / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-19Bitstream added on 2014-06-13T19:40:39Z : No. of bitstreams: 1 kanegae_mpp_dr_arafcf.pdf: 355186 bytes, checksum: d30a57da9f59ce845b56a723cbd4b539 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A apocinina, um métoxi-catecol (MC) extraído das raízes da planta Picrorhiza kurroa, é um eficiente inibidor do complexo NADPH oxidase (NOX) e seu mecanismo de ação está relacionado à inibição da agregação dos componentes enzimáticos e à oxidação catalisada por peroxidases. Estudamos a relação estrutura-atividade da apocinina e de metóxi-catecóis correlatos, na inibição da NOX. Com a função de alterar o potencial de redução das moléculas estudadas, escolhemos MC com grupos adicionais aceptores (MC-A) ou doadores de elétrons (MC-D) na posição para, em relação à hidroxila da molécula de apocinina. Os MC-D inibiram mais fracamente a ativação da NOX em neutrófilos ativados quando comparados aos MC-A. Acreditamos que isso se deva à fraca reatividade destes compostos com grupamentos sulfidrila de proteínas, assim, os MC-D são incapazes de oxidar grupos essenciais aos componentes citosólicos da enzima e desta forma, inibir sua ativação. A diapocinina, metabólito gerado após a oxidação da apocinina por peroxidases, foi sintetizada e avaliamos seus efeitos em neutrófilos e leucócitos mononucleares ativados quanto à inibição da ativação da NOX e em leucócitos mononucleares, em relação à liberação de citocinas e expressão do RNAm do componente de membrana gp91phox. Encontramos que a apocinina e a diapocinina inibiram os três fenômenos estudados, embora a diapocinina o tenha feito de modo mais eficiente. Acreditamos que isto possa estar relacionado ao efeito supressor da apocinina e diapocinina sobre a ativação da NADPH oxidase / Apocynin, a methoxy catechol (MC) extracted from the roots of Picrorhiza kurroa has been used as an efficient inhibitor of the NADPH oxidase (NOX) complex and its mechanism of action involves the impairment of the assemble process of the enzyme. Here, we studied the structure-activity relationship for apocynin and analogous ortho-methoxy-substituted catechols as inhibitors of the NADPH oxidase. Aiming to alter the reduction potential, the ortho-methoxy-catechol moiety was kept constant and the substituents at para position related to the hydroxyl group were varied. Two series of compounds were employed: methoxy-catechols bearing electron-withdrawing groups (MC-W) and methoxy-catechol bearing electron-donating groups (MC-D). We found that MC-D were weaker inhibitors of the NOX complex in stimulated neutrophils compared to MD-W. We suggest that there is a close relationship between the weak reactivity of MC-D compounds with sulfhydryl residues of proteins and there incapacity in inhibiting NOX activation. Diapocynin is a product generated by peroxidase oxidation of apocynin. Here we synthesized diapocynin and compared its efficacy as NOX inhibitor in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and neutrophils in relation to apocynin. Both drugs were also studied in cytokine release and its influence on gp91phox mRNA expression. We found that diapocynin was a more efficient inhibitor of NOX activation, gp91phox mRNA expression and cytokine release than apocynin. We suggest that these findings could be related to NOX inhibition process

O osteossarcoma (OS) é o tumor maligno primário mais comum do tecido ósseo, caracterizado pela formação de osteócitos anormais. Apesar do avanço nas terapias convencionais (quimioterapia e retirada do tumor), essas não conseguem eliminar totalmente as células tumorais e impedir a progressão da doença. Recentemente, agentes derivados de fontes naturais ganharam considerável atenção por causa de sua segurança, eficácia e disponibilidade imediata. Nesse sentido, a apocinina, inibidor do complexo NADPH-oxidase, vem sendo estudada como agente antitumoral em alguns tipos de câncer como: pâncreas, próstata, pulmão e mama. Apocinina é um pró-fármaco e sua ação parece estar relacionada à sua conversão produzindo a diapocinina, a qual se mostrou mais efetiva do que a apocinina. Portanto, o objetivo desse estudo é avaliar, in vitro, o potencial antitumoral da apocinina e diapocinina em células de osteossarcoma humano. Para isso, foram utilizados osteoblastos humanos normais (HOb) e osteossarcoma humano imortalizadas (SaOS-2) tratados ou não com apocinina e diapocinina em diversas concentrações. Foram realizados os ensaios de viabilidade celular, alterações morfológicas, apoptose celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), formação de colônias, migração, invasão e expressão do fator indutor de hipóxia-1alfa (HIF-1). Também foram conduzidos ensaios para verificar a atividade de metaloproteinase de matriz (MMP) 2 e 9. Os resultados em SaOS-2 mostraram que o tratamento com apocinina nas concentrações de 1,5 e 3 mM; e diapocinina nas concentrações de 0,75 e 1,5 mM reduziram a viabilidade; aumentaram o número de células em apoptose e diminuíram a produção de EROs; sem causar danos às células HOb. Além disso, essas mesmas concentrações inibiram a migração e invasão celular; diminuíram a expressão de HIF-1; e reduziram a atividade de MMP-2 em SaOS-2. Considerando os resultados obtidos, concluímos que a apocinina e diapocinina podem atuar como possíveis moduladores de células tumorais, sendo que a diapocinina mostrou ser mais efetiva nos parâmetros testados. / Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant tumor of bone tissue, characterized by the formation of abnormal osteocytes. Despite advances in conventional therapies (chemotherapy and surgery) they cannot completely eliminate tumor cells and prevent the progression of the disease. Recently, agents derived from natural sources have achieved considerable attention because of their safety, efficacy and immediate availability of therapies. In this way, apocynin, an inhibitor of the NADPH-oxidase complex, has been studied as an antitumor agent in some types of cancer, such as pancreas, prostate, lung and breast. Apocynin is a prodrug and its action indicate to be related to its conversion to diapocynin, which has been shown to be more efficient than apocynin itself. Thus, the aim of this study is to evaluate, in vitro, the antitumor potential of apocynin and diapocynin in human osteosarcoma cells. For this, normal human osteoblasts (HOb) and immortalized human osteosarcoma cells (SaOS-2) were treated or no-treated with apocynin and diapocynin in various concentrations. Cell viability assay, morphological alterations, cellular apoptosis, reactive oxygen species (ROS) production, colony formation, migration, invasion and expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1) were performed. We also performed assays to verify the activity of matrix metalloproteinase (MMP) 2 and 9. The results in SaOS-2 showed that treatment with apocynin at concentrations of 1,5 e 3 mM; and diapocynin at concentrations of 0,75 e 1,5 mM reduced cell viability; increased the number of cells in apoptosis and decreased the production of ROS; without damaging HOb cells. Moreover, these same concentrations inhibited cell migration and invasion; decreased HIF-1 expression; and reduced MMP 2 activity in SaOS-2. Considering the results, we suggest that apocynin and diapocynin may act as possible modulators of tumor cells, and diapocynin has been shown to be more effective.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-22T14:22:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Carmem Lucia dos Santos Machado.pdf: 2830040 bytes, checksum: e257722fc7ff4b644add8fc45c9be5cd (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-22T14:22:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Carmem Lucia dos Santos Machado.pdf: 2830040 bytes, checksum: e257722fc7ff4b644add8fc45c9be5cd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-22T14:22:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Carmem Lucia dos Santos Machado.pdf: 2830040 bytes, checksum: e257722fc7ff4b644add8fc45c9be5cd (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / A apocinina é uma acetofenona que apresenta estrutura pequena e possui diversas atividades biológicas. Sua estrutura pode ser oxidada em certas condições químicas ou biológicas e resultar na formação do seu dímero, a diapocinina. As chalconas são compostos que contém em sua estrutura básica a porção 1,3-diarilpro-2-em-1-ona e se caracterizam por apresentar ampla variedade de atividades biológicas, como atividade antioxidante e antibacteriana. Estudos demostram que modificações estruturais nos anéis aromáticos das chalconas resultam na obtenção de compostos com atividade aceptora de radicais e antibacterianas. Neste trabalho foram realizadas a síntese de chalconas derivadas da apocinina e diapocinina, a avaliação da atividade antioxidante e antibacteriana. Adicionalmente foram realizados estudos de modelagem molecular, determinação de propriedades físico-químicas e a avaliação da toxicidade in silico, com a finalidade de se obter compostos que possam ser utilizadas como protótipos a novos fármacos. As chalconas derivadas da apocinina e da diapocinina, com substituintes 4-OCH3, 3,4-OCH3, e 3,4,5-OCH3 ligados ao anel B, e não substituída (H), foram sintetizadas através da condensação de Claisen-Schmidth, dos benzaldeídos com a apocinina e diapocinina, em meio básico, temperatura ambiente, por 24 horas. Ao final de cada reação, os compostos foram analisados e purificados por recristalização ou em cromatografia em coluna. Os compostos foram caracterizados por CCD, ponto de fusão, espectroscopia de infravermelho (IV), e por 1H e 13C RMN. A análise de capacidade aceptora de radicais das moléculas sintetizadas, foram realizadas através do emprego do método colorimétrico de análise do DPPH e ABTS, utilizando como padrão BHT e Trolox, respectivamente, nas concentrações 6,75, 12,5, 25, 50, 100, 200 e 400 μM. A avaliação da atividade antibacteriana dos compostos obtidos foi realizada através do método de difusão ágar-cilindro e leitura de halos de inibição, onde foram testadas as cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (bactéria Gram positiva) e Escherichia coli ATCC 25922 (bactéria Gram negativa), utilizando como padrão o antibiótico cloranfenicol. A análise de toxidade in silico, como a genotoxidade, mutagenicidade, efeitos irritante e sobre sistema reprodutor, foi realizado através do programa computacional Osiris Property Explorer. Os compostos apresentaram atividade aceptora do radical DPPH e ABTS na faixa de concentração de 400 a 12,5μM, sendo superiores ao padrão de BHT e Trolox. No ensaio de avaliação da atividade antibacteriana todos os compostos apresentaram atividade antibacteriana frente à cepa Staphylococcus aureus, sendo, no entanto, inferior ao padrão cloranfenicol. Não foi observada atividade contra a cepa Escherichia coli. A partir da análise da toxicidade in silico observou-se que somente os compostos que tinham grupamentos OCH3 substituídos em posição para, apresentaram risco médio e alto para efeito irritante e tóxico para o sistema reprodutor. Os demais compostos apresentaram risco teórico baixo de desenvolver os efeitos tóxicos citados. Diante dos resultados obtidos, observa-se que as chalconas derivadas da apocinina e diapocinina se apresentam como compostos promissores para o estudo e o desenvolvimento de agentes com atividade antioxidante, com ação antibacteriana e baixa toxicidade teórica, sendo assim demonstrando potenciais agentes para se utilizar na terapêutica. / The apocynin is an acetophenone which has little structure and has several biological activities. Its structure can be oxidized in certain chemical or biological conditions and result in the formation of the dimer, the diapocinina. The chalcones are compounds containing in its basic structure portion 1,3-diaryl-pro-2-en-1-one and are characterized by having variety of biological activities such as antibacterial and antioxidant activity. Studies show that structural modifications on the aromatic rings of chalcones result in obtaining the compounds with acceptor radical and antibacterial activity. In this work were performed chalcones derived synthesis of apocynin and diapocinina, the evaluation of antioxidant and antimicrobial activity. It was also performed molecular modeling studies, determination of physicochemical properties and toxicity evaluation in silico, in order to obtain compounds which can be used as prototypes of new drugs. The derivatives of the chalcones and apocynin diapocinina, substituents 4-OCH3, 3,4-OCH3, and 3,4,5-OCH3 attached to B ring, unsubstituted (H) were synthesized by Claisen-Schmidth condensation, of benzaldehydes with apocynin and diapocinina, in basic medium at room temperature for 24 hours. After each reaction, the compounds were analyzed and purified by recrystallization or column chromatography. The compounds were characterized by TLC, melting point, infrared spectroscopy (IR) and 1H and 13C NMR. The acceptor capacity analysis of radical synthesized molecules were carried out by employing the colorimetric method of analysis of DPPH and ABTS using standard as BHT and Trolox, respectively, at concentrations 6.75, 12.5, 25, 50, 100 200 and 400 uM. The evaluation of the antibacterial activity of the obtained compounds was performed by the method of agar-cylinder diffusion and reading inhibition zones, where Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Gram positive bacterium) and Escherichia coli ATCC 25922 (Gram negative bacteria) were tested using as standard antibiotic chloramphenicol. The analysis of in silico toxicity, such as genotoxicity, mutagenicity, and irritating effects on reproductive system, was performed using the computer program Osiris Property Explorer. The compounds showed acceptor activity of DPPH and ABTS radical in the concentration range of 400 to 12,5μM, being superior to the standard of BHT and Trolox. The evaluation of the antibacterial activity test all compounds showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus strain being, however, lower than the standard chloramphenicol. There was no activity against Escherichia coli strain. From the analysis of in silico toxicity it was observed that only compounds which had OCH3 groups substituted in the para position, exhibited medium and high risk of irritating and toxic effect on the reproductive system. Other compounds showed low theoretical risk of developing toxic effects reported. Considering the results, it is observed that the derivatives of apocynin and diapocinina chalcones present as promising compounds for the study and development of agents having antioxidant activity, antibacterial action and low theoretical toxicity, thus demonstrating potential agents for use in therapy.

O osteossarcoma (OS) é o tumor maligno primário mais comum do tecido ósseo, caracterizado pela formação de osteócitos anormais. Apesar do avanço nas terapias convencionais (quimioterapia e retirada do tumor), essas não conseguem eliminar totalmente as células tumorais e impedir a progressão da doença. Recentemente, agentes derivados de fontes naturais ganharam considerável atenção por causa de sua segurança, eficácia e disponibilidade imediata. Nesse sentido, a apocinina, inibidor do complexo NADPH-oxidase, vem sendo estudada como agente antitumoral em alguns tipos de câncer como: pâncreas, próstata, pulmão e mama. Apocinina é um pró-fármaco e sua ação parece estar relacionada à sua conversão produzindo a diapocinina, a qual se mostrou mais efetiva do que a apocinina. Portanto, o objetivo desse estudo é avaliar, in vitro, o potencial antitumoral da apocinina e diapocinina em células de osteossarcoma humano. Para isso, foram utilizados osteoblastos humanos normais (HOb) e osteossarcoma humano imortalizadas (SaOS-2) tratados ou não com apocinina e diapocinina em diversas concentrações. Foram realizados os ensaios de viabilidade celular, alterações morfológicas, apoptose celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), formação de colônias, migração, invasão e expressão do fator indutor de hipóxia-1alfa (HIF-1). Também foram conduzidos ensaios para verificar a atividade de metaloproteinase de matriz (MMP) 2 e 9. Os resultados em SaOS-2 mostraram que o tratamento com apocinina nas concentrações de 1,5 e 3 mM; e diapocinina nas concentrações de 0,75 e 1,5 mM reduziram a viabilidade; aumentaram o número de células em apoptose e diminuíram a produção de EROs; sem causar danos às células HOb. Além disso, essas mesmas concentrações inibiram a migração e invasão celular; diminuíram a expressão de HIF-1; e reduziram a atividade de MMP-2 em SaOS-2. Considerando os resultados obtidos, concluímos que a apocinina e diapocinina podem atuar como possíveis moduladores de células tumorais, sendo que a diapocinina mostrou ser mais efetiva nos parâmetros testados. / Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant tumor of bone tissue, characterized by the formation of abnormal osteocytes. Despite advances in conventional therapies (chemotherapy and surgery) they cannot completely eliminate tumor cells and prevent the progression of the disease. Recently, agents derived from natural sources have achieved considerable attention because of their safety, efficacy and immediate availability of therapies. In this way, apocynin, an inhibitor of the NADPH-oxidase complex, has been studied as an antitumor agent in some types of cancer, such as pancreas, prostate, lung and breast. Apocynin is a prodrug and its action indicate to be related to its conversion to diapocynin, which has been shown to be more efficient than apocynin itself. Thus, the aim of this study is to evaluate, in vitro, the antitumor potential of apocynin and diapocynin in human osteosarcoma cells. For this, normal human osteoblasts (HOb) and immortalized human osteosarcoma cells (SaOS-2) were treated or no-treated with apocynin and diapocynin in various concentrations. Cell viability assay, morphological alterations, cellular apoptosis, reactive oxygen species (ROS) production, colony formation, migration, invasion and expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1) were performed. We also performed assays to verify the activity of matrix metalloproteinase (MMP) 2 and 9. The results in SaOS-2 showed that treatment with apocynin at concentrations of 1,5 e 3 mM; and diapocynin at concentrations of 0,75 e 1,5 mM reduced cell viability; increased the number of cells in apoptosis and decreased the production of ROS; without damaging HOb cells. Moreover, these same concentrations inhibited cell migration and invasion; decreased HIF-1 expression; and reduced MMP 2 activity in SaOS-2. Considering the results, we suggest that apocynin and diapocynin may act as possible modulators of tumor cells, and diapocynin has been shown to be more effective.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-09T01:55:05Z No. of bitstreams: 1 116110004.pdf: 1404525 bytes, checksum: ca74119d1b54d005e98448f652e62885 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-09T01:55:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 116110004.pdf: 1404525 bytes, checksum: ca74119d1b54d005e98448f652e62885 (MD5) Previous issue date: 2012-09-26 / O mercúrio aumenta o risco de doença cardiovascular, estresse oxidativo, e altera a reatividade vascular. Este metal induz disfunção endotelial, como resultado da diminuição da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) por aumento do estresse oxidativo e produção de prostanóides contráteis. A enzima NADPH oxidase é a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (ROS) na vasculatura. Nosso objetivo foi investigar se o tratamento com apocinina, um inibidor da NADPH oxidase, evita os efeitos vasculares causados pela intoxicação crônica por baixas concentrações de mercúrio. Para isso, ratos machos Wistar de três meses de idade foram tratados durante 30 dias com: a) Não-tratado (injeções intramusculares - im - de solução salina, b) HgCl 2 (im, primeira dose de 4,6 ug/kg, e doses subsequentes de 0,07 ug/kg/dia), c) Apo (1,5 mM de apocinina em água de beber e salina im); d) ApoHg (tratamento com mercúrio e apocinina) Tratamento com mercúrio: 1) aumentou a resposta vasoconstritora à fenilefrina na aorta e reduziu a resposta dependente do endotélio à acetilcolina, 2) aumentou o envolvimento de ROS e prostanoides vasoconstritores em resposta à fenilefrina enquanto reduziu a modulação de NO endotelial de tais respostas, 3) reduziu a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) da aorta e aumentou os níveis de malondialdeído (MDA) plasmático. O tratamento com apocinina preveniu parcialmente o aumento da resposta à fenilefrina e reduziu a disfunção endotelial induzida pelo mercúrio. Além disso, aumentou a modulação de NO das respostas vasoconstritoras, a atividade da SOD aórtica e reduziu os níveis plasmáticos de MDA, sem afetar o aumento da participação de prostanóides vasoconstritores observados na aorta de ratos tratados pelo mercúrio. Conclusões: O mercúrio aumenta a resposta vasoconstritora à fenilefrina pela redução da biodisponibilidade de NO e aumenta a participação de ROS e prostanoides vasoconstritores. A apocinina protege o vaso dos efeitos deletérios causados pela NADPH oxidase, mas não dos causados pelos prostanoides, demonstrando a ação de duas vias independentes nos danos cardiovasculares desenvolvidos pelo metal. / Mercury increases the risk of cardiovascular disease and oxidative stress and alters vascular reactivity. This metal elicits endothelial dysfunction causing decreased NO bioavailability via increased oxidative stress and contractile prostanoid production. NADPH oxidase is the major source of reactive oxygen species (ROS) in the vasculature. Our aim was to investigate whether treatment with apocynin, an NADPH oxidase inhibitor, prevents the vascular effects caused by chronic intoxication with low concentrations of mercury. Three-month-old male Wistar rats were treated for 30 days with a) intramuscular injections (i.m.) of saline; b) HgCl 2 (i.m. 1 st dose: 4.6 μg/kg, subsequent doses: 0.07 μg/kg/day); c) Apocynin (1.5 mM in drinking water plus saline i.m.); and d) Apocynin plus HgCl 2 . The mercury treatment resulted in 1) an increased aortic vasoconstrictor response to phenylephrine and reduced endothelium-dependent responses to acetylcholine; 2) the increased involvement of ROS and vasoconstrictor prostanoids in response to phenylephrine, whereas the endothelial NO modulation of such responses was reduced; and 3) the reduced activity of aortic superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx) and increased plasma malondialdehyde (MDA) levels. Treatment with apocynin partially prevented the increased phenylephrine responses and reduced the endothelial dysfunction elicited by mercury treatment. In addition, apocynin treatment increased the NO modulation of vasoconstrictor responses and aortic SOD activity and reduced plasma MDA levels without affecting the increased participation of vasoconstrictor prostanoids observed in aortic segments from mercury-treated rats. Conclusions: Mercury increases the vasoconstrictor response to phenylephrine by reducing NO bioavailability and increasing the involvement of ROS and constrictor prostanoids. Apocynin protects the vessel from the deleterious effects caused by NADPH oxidase, but not from those caused by prostanoids, thus demonstrating a two-way action.

O consumo crônico de etanol acarreta alterações significativas das funções cardíaca e circulatória, figurando como um importante fator de risco no desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como por exemplo a hipertensão arterial. O passo inicial para a disfunção cardiovascular associada ao etanol envolve a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), sendo esse processo mediado pela enzima nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidase. Baseado nestas observações, a hipótese do estudo é a de que o consumo de etanol aumente a pressão arterial, a geração de ERO e induza a ativação de vias de sinalização redox sensíveis na vasculatura via NADPH oxidase. Portanto, o objetivo desse estudo foi investigar a participação da NADPH no aumento da pressão arterial e estresse oxidativo vascular induzidos pelo consumo crônico de etanol através de sua inibição pela apocinina. O trabalho demonstrou pela primeira vez o envolvimento do estresse oxidativo via ERO geradas pela NADPH oxidase no aumento da pressão arterial induzida pelo consumo crônico de etanol. Houve aumento da contração induzida por fenilefrina em anéis de aorta com e sem endotélio de animais tratados com etanol e foi demonstrada a participação das ERO geradas pela NADPH oxidase nesta resposta, uma vez que o tratamento com apocinina promoveu diminuição da contração observada. O tratamento com etanol aumentou a geração de ERO em tecido aórtico via NADPH oxidase, reduziu a biodisponibilidade de NO plasmático e tecidual e promoveu peroxidação lipídica, visto pela elevação dos níveis de TBARS. Também foi demonstrado que a enzima NADPH oxidase está envolvida no aumento da expressão protéica da PKC ? e SAPK/JNK induzido pelo etanol, e que o tratamento com etanol é capaz de diminuir a atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD) e aumentar a expressão protéica especificamente da SOD2, possível resposta adaptativa ao aumento de geração de O2- via NADPH oxidase pelo etanol. Houve aumento da expressão protéica da nNOS em aorta de animais tratados com etanol, sendo esta, uma possível resposta adaptativa intrínseca às alterações promovidas pelo aumento da pressão arterial nestes animais. O tratamento com etanol não alterou os níveis aórticos de peróxido de hidrogênio (H2O2), glutationa reduzida (GSH) e atividades enzimáticas da xantina oxidase (XO), superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). Além disso, a partir da avaliação da translocação citosol/membrana das subunidades organizadoras p47phox e Nox organizer 1 (Noxo1) e expressão protéica das subunidades catalíticas da NADPH oxidase, Nox1, Nox2 e Nox4, foi possível concluir que o aumento da expressão da Nox1 possui importante papel na modulação da geração de ERO pelo etanol, podendo participar do aumento da pressão arterial e estresse oxidativo sistêmico e vascular gerados. Portanto, a partir dos resultados obtidos, o estudo demonstrou que o consumo crônico de etanol induz o aumento da produção de ERO, resposta implicada no aumento da pressão arterial observado nos animais tratados com etanol. Além disso, o trabalho evidencia a participação da enzima Nox1/NADPH oxidase neste processo, uma vez que houve aumento da expressão protéica dessa subunidade catalítica na aorta dos animais tratados com etanol / Chronic ethanol consumption results in significant alterations in cardiac and circulatory functions, appearing as an important risk factor responsible for cardiovascular diseases such as hypertension. The initial step for cardiovascular dysfunction associated with ethanol consumption involves the generation of reactive oxygen species (ROS) and reduced bioavailability of nitric oxide (NO), processes mediated by the enzyme nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase. Based on the mentioned observations we hypothesized that ethanol consumption increases blood pressure, ROS generation and induces activation of redox-sensitive signaling pathways in the vasculature through NADPH oxidase. Thus, here we investigated the contribution of NADPH oxidase in chronic ethanol consumption-induced hypertension and vascular oxidative stress through its inhibition by apocynin. This study demonstrated for the first time the involvement of oxidative stress via ROS derived from NADPH oxidase in increased blood pressure induced by chronic ethanol intake. The increased contractility of endothelium-intact and endothelium-denuded aortic rings from ethanol-treated rats to phenylephrine was prevented by apocynin. Ethanol consumption increased systemic and vascular oxidative stress and apocynin prevented these responses. The decrease on plasma and vascular nitrate/nitrite (NOx) levels induced by ethanol were not prevented by apocynin. Treatment with ethanol did not affect aortic levels of hydrogen peroxide (H2O2) and reduced glutathione (GSH) as well as the activity of xanthine oxidase (XO), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx). Ethanol-induced increased protein expression of Nox1, PKC?, nNOS, SAPK/JNK and SOD2 in the rat aorta was prevented by apocynin. No difference on the aortic expression of Nox2, Nox4, p47phox, Nox organizer 1 (Noxo1), eNOS and iNOS was detected after treatment with ethanol. Ethanol treatment did not alter the phosphorylation of SAPK/JNK, p38MAPK, ERK1/2, c-Src, Rac1 or PKC?. The major new finding of our study is that the increased vascular generation of reactive oxygen species (ROS) induced by ethanol is related to the increased vascular Nox1/NADPH oxidase expression. This mechanism is involved on the vascular dysfunction and hypertension induced by ethanol. Additionally, we conclude that ethanol consumption induces the expression of different proteins that regulate vascular contraction and growth and that NADPH oxidase-derived ROS play a role in such response

O consumo crônico de etanol acarreta alterações significativas das funções cardíaca e circulatória, figurando como um importante fator de risco no desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como por exemplo a hipertensão arterial. O passo inicial para a disfunção cardiovascular associada ao etanol envolve a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), sendo esse processo mediado pela enzima nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidase. Baseado nestas observações, a hipótese do estudo é a de que o consumo de etanol aumente a pressão arterial, a geração de ERO e induza a ativação de vias de sinalização redox sensíveis na vasculatura via NADPH oxidase. Portanto, o objetivo desse estudo foi investigar a participação da NADPH no aumento da pressão arterial e estresse oxidativo vascular induzidos pelo consumo crônico de etanol através de sua inibição pela apocinina. O trabalho demonstrou pela primeira vez o envolvimento do estresse oxidativo via ERO geradas pela NADPH oxidase no aumento da pressão arterial induzida pelo consumo crônico de etanol. Houve aumento da contração induzida por fenilefrina em anéis de aorta com e sem endotélio de animais tratados com etanol e foi demonstrada a participação das ERO geradas pela NADPH oxidase nesta resposta, uma vez que o tratamento com apocinina promoveu diminuição da contração observada. O tratamento com etanol aumentou a geração de ERO em tecido aórtico via NADPH oxidase, reduziu a biodisponibilidade de NO plasmático e tecidual e promoveu peroxidação lipídica, visto pela elevação dos níveis de TBARS. Também foi demonstrado que a enzima NADPH oxidase está envolvida no aumento da expressão protéica da PKC ? e SAPK/JNK induzido pelo etanol, e que o tratamento com etanol é capaz de diminuir a atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD) e aumentar a expressão protéica especificamente da SOD2, possível resposta adaptativa ao aumento de geração de O2- via NADPH oxidase pelo etanol. Houve aumento da expressão protéica da nNOS em aorta de animais tratados com etanol, sendo esta, uma possível resposta adaptativa intrínseca às alterações promovidas pelo aumento da pressão arterial nestes animais. O tratamento com etanol não alterou os níveis aórticos de peróxido de hidrogênio (H2O2), glutationa reduzida (GSH) e atividades enzimáticas da xantina oxidase (XO), superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). Além disso, a partir da avaliação da translocação citosol/membrana das subunidades organizadoras p47phox e Nox organizer 1 (Noxo1) e expressão protéica das subunidades catalíticas da NADPH oxidase, Nox1, Nox2 e Nox4, foi possível concluir que o aumento da expressão da Nox1 possui importante papel na modulação da geração de ERO pelo etanol, podendo participar do aumento da pressão arterial e estresse oxidativo sistêmico e vascular gerados. Portanto, a partir dos resultados obtidos, o estudo demonstrou que o consumo crônico de etanol induz o aumento da produção de ERO, resposta implicada no aumento da pressão arterial observado nos animais tratados com etanol. Além disso, o trabalho evidencia a participação da enzima Nox1/NADPH oxidase neste processo, uma vez que houve aumento da expressão protéica dessa subunidade catalítica na aorta dos animais tratados com etanol / Chronic ethanol consumption results in significant alterations in cardiac and circulatory functions, appearing as an important risk factor responsible for cardiovascular diseases such as hypertension. The initial step for cardiovascular dysfunction associated with ethanol consumption involves the generation of reactive oxygen species (ROS) and reduced bioavailability of nitric oxide (NO), processes mediated by the enzyme nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase. Based on the mentioned observations we hypothesized that ethanol consumption increases blood pressure, ROS generation and induces activation of redox-sensitive signaling pathways in the vasculature through NADPH oxidase. Thus, here we investigated the contribution of NADPH oxidase in chronic ethanol consumption-induced hypertension and vascular oxidative stress through its inhibition by apocynin. This study demonstrated for the first time the involvement of oxidative stress via ROS derived from NADPH oxidase in increased blood pressure induced by chronic ethanol intake. The increased contractility of endothelium-intact and endothelium-denuded aortic rings from ethanol-treated rats to phenylephrine was prevented by apocynin. Ethanol consumption increased systemic and vascular oxidative stress and apocynin prevented these responses. The decrease on plasma and vascular nitrate/nitrite (NOx) levels induced by ethanol were not prevented by apocynin. Treatment with ethanol did not affect aortic levels of hydrogen peroxide (H2O2) and reduced glutathione (GSH) as well as the activity of xanthine oxidase (XO), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx). Ethanol-induced increased protein expression of Nox1, PKC?, nNOS, SAPK/JNK and SOD2 in the rat aorta was prevented by apocynin. No difference on the aortic expression of Nox2, Nox4, p47phox, Nox organizer 1 (Noxo1), eNOS and iNOS was detected after treatment with ethanol. Ethanol treatment did not alter the phosphorylation of SAPK/JNK, p38MAPK, ERK1/2, c-Src, Rac1 or PKC?. The major new finding of our study is that the increased vascular generation of reactive oxygen species (ROS) induced by ethanol is related to the increased vascular Nox1/NADPH oxidase expression. This mechanism is involved on the vascular dysfunction and hypertension induced by ethanol. Additionally, we conclude that ethanol consumption induces the expression of different proteins that regulate vascular contraction and growth and that NADPH oxidase-derived ROS play a role in such response

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-24T15:01:09Z No. of bitstreams: 1 CAMILA COELHO RODRIGUES.pdf: 1765480 bytes, checksum: b3f50f8973734acade5a9396b1aafebf (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-24T15:03:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CAMILA COELHO RODRIGUES.pdf: 1765480 bytes, checksum: b3f50f8973734acade5a9396b1aafebf (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-24T15:03:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CAMILA COELHO RODRIGUES.pdf: 1765480 bytes, checksum: b3f50f8973734acade5a9396b1aafebf (MD5) Previous issue date: 2018-07-13 / A apocinina apresenta estrutura pequena e possui diversas atividades biológicas, sua estrutura pode ser oxidada em certas condições e resultar na formação do seu dímero, a diapocinina. Como um potencial agente terapêutico, análogos estruturais da diapocinina, contendo grupos substituintes ligados a esta molécula, podem apresentar atividade neuroprotetora e aceptora de radicais. As chalconas apresentam estrutura química 1,3-diaril-2-propen-1-ona simples que permite variadas modificações estruturais com a finalidade de otimizar o perfil farmacológico ou direcioná-las para diferentes atividades biológicas. A resposta de maior destaque é a capacidade aceptora de radicais e atividade neuroprotetora. Neste trabalho foram realizadas a síntese e caracterização da diapocinina e seus derivados, a avaliação das propriedades físico-químicas e da atividade aceptora de radicais, estudos de modelagem e docking molecular, toxicidade in silico e in vivo, com a finalidade de se obter compostos que possam ser empregados como candidatos a novos fármacos aceptores de radicais e antiparkinsonianos. A diapocinina foi sintetizada a partir da apocinina e caracterizada por CLAE, espectroscopia IV, e RMN 1H e 13C. As chalconas derivadas da diapocinina com substituintes 4-Cl, 4-N(CH3)2, 4-OCH3 e 4-NO2, foram sintetizadas através da condensação de Claisen-Schmidt. A análise de capacidade aceptora de radicais foi realizada através do ensaio de DPPH utilizando como padrão BHT. A análise de toxidade in silico, especificamente o risco de causar genotoxidade, mutagenicidade, efeitos irritante e sobre sistema reprodutor, foi realizado através dos programas computacionais Osiris Property Explorer e admetSAR. Os estudos de docking molecular foram realizados utilizando o software iGemdock 2.1 e envolveu a avaliação de ligação individual da apocinina e diapocinina. Os protocolos experimentais pré-clínicos in vivo de avaliação de atividade frente a sintomas de doença de Parkinson foi realizado com Drosophila melanogaster. A apocinina demonstrou capacidade de captura de DPPH maior que seu dímero, sugerindo-se que este composto se apresenta como melhor candidato para o desenvolvimento de compostos com atividade antioxidante potencial. A partir da análise da toxicidade in silico observou-se que somente os compostos 4-N(CH3)2 e 4-NO2 apresentaram riscos de causar os efeitos mutagênicos e genotóxicos, sendo que os demais compostos apresentaram risco teórico baixo. Os resultados obtidos no estudo de docking molecular permitiram a obtenção de modelos teóricos onde a apocinina e a diapocinina não possuem ligação no mesmo sitio de interação. Assim sugere-se que estruturas químicas possam, de maneira simultânea, atuar no mesmo alvo, mas em sítios adjacentes de interação. A avaliação da atividade frente a sintomas da doença de Parkinson realizada através de ensaio de sobrevivência, toxicidade e comportamento com Drosophila melanogaster constata que tanto a apocinina e diapocinina são compostos promissores para o estudo e o desenvolvimento de agentes para se utilizar na terapêutica, com atividade neuroprotetora. / Apocynin is phenolic compound with a small structure which exhibit diverse pharmacological activities. Aromatic ring structure can be oxidized under enzymatic or in oxidizing medium generating its dimer, diapocinin. Structural analogues of diapocinin are considering a potential therapeutic agent, and depending on substituent moieties attached to this molecule. Chalcones have a simple chemical 1,3-diaryl-2-propen-1-one structure which allows structural modifications aiming the optimization of the broad recognized pharmacological profile or to reach some different biological activities. Oxygen radical acceptor (antioxidant) and neuroprotective are highlighted biological activities observed to these class of compounds and they were studied in this research. In this work, the synthesis and characterization of diapocinin and its chalcone derivatives, the evaluation of physicochemical properties and radical acceptor activity, molecular modeling and docking studies, in silico and in vivo toxicity, and evaluation of Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster protocols were performed in order to support the new antioxidant and antiparkinsonian drugs. Diapocinin was synthesized from apocynin and characterized by HPLC, IR spectroscopy, and 1H and 13C NMR. Chalcones derived from diapocinin, with 4-Cl, 4-N(CH3)2, 4-OCH3 and 4-NO2, were synthesized by the condensation of Claisen-Schmidt. Radical acceptor evaluation was performed usign DPPH assay using BHT as standard. In silico toxicity analysis, specifically the risk of causing genotoxicity, mutagenicity, irritant effects and activity on the reproductive system, were performed using Osiris Property Explorer and admetSAR. Molecular docking studies were performed using iGemdock 2.1 software, and this study involved the evaluation of individual binding of apocynin and diapocinin and alfa-synuclein and NADPH oxidase. In vivo preclinical experimental protocols of activity against Parkinson's disease symptoms were performed with Drosophila melanogaster. Apocynin demonstrated higher DPPH radical capture than diapocynin, suggesting that this compound is the best candidate for the development of compounds with potential antioxidant activity. From the analysis of in silico toxicity, it was observed the 4-N(CH3)2 and 4-NO2 compounds presented risks of causing the mutagenic and genotoxic effects, and the other compounds presented low theoretical risk. The results obtained in the molecular docking study allowed the generation of theoretical models which the apocynin and diapocinin not show binding or interactions in the same molecular protein site. Thus, it is suggested that chemical structures may, simultaneously, act on the same target, but in adjacent sites of interaction. The evaluation of activity against Parkinson's disease symptoms performed by survival, toxicity and behavior assays with Drosophila melanogaster suggest the both apocynin and diapocinin are promising compounds for the study and development of agents to be used in therapy, with neuroprotective activity.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-04-18T19:02:52Z No. of bitstreams: 1 PRISCILA MARQUES SOSA.pdf: 4777732 bytes, checksum: 5e904d610fde40315a7aeacae32f9d55 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T19:02:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PRISCILA MARQUES SOSA.pdf: 4777732 bytes, checksum: 5e904d610fde40315a7aeacae32f9d55 (MD5) Previous issue date: 2016-03-15 / O AVE é uma das principais causas de morte e incapacidade funcional em todo mundo, sendo dividido em dois subtipos: isquêmico, causado pela diminuição do fluxo sanguíneo; e hemorrágico, caracterizado pelo extravasamento de sangue nos tecidos encefálicos. Considerando a alta taxa de mortalidade e a gravidade das sequelas pós AVE, torna-se de extrema importância a busca por alvos terapêuticos que visem diminuir as sequelas causadas pelos quadros isquêmico e hemorrágico. Sendo assim, este estudo investigou os efeitos neuroprotetores do exercício físico (8 semanas previamente à lesão) em um quadro de AVE isquêmico (através da oclusão bilateral das artérias carótidas comuns) e os efeitos neuroprotetores da apocinina (posteriormente à lesão – 2, 6 e 24h – na dose 0,5mg/kg) em um quadro de AVE hemorrágico (através da infusão de colagenase no corpo estriado) em ratos Wistar. Para avaliar a função motora dos animais, foram utilizados os testes de Campo Aberto (CA), Rotarod (RR) e Escala de Déficit Neurológico (NDS), e, para avaliar o balanço redox estriatal, avaliamos a presença de EROs, TBARS (espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico) e capacidade antioxidante total (FRAP). Nossos resultados mostraram que o exercício físico é uma estratégia parcialmente eficaz de proteção em um modelo de AVE isquêmico. No entanto, a apocinina não se mostrou uma estratégia de neuroproteção eficaz em um modelo de AVE hemorrágico. Estes resultados revelam a possibilidade da utilização do exercício físico como estratégia de neuroproteção. A apocinina, por sua vez, precisa ser melhor estudada em casos de AVE hemorrágico, considerando a investigação do seu mecanismo, doses e tempos de administração. / The stroke is one of the leading causes of death and disability worldwide, and is divided into two subtypes: ischemic, caused by a decreased on blood flow; and hemorrhagic, characterized by leakage of blood in brain tissue. Considering the high mortality rate and severity of post stroke sequelae, it is extremely important to search for therapeutic targets aimed at reducing the consequences caused by ischemic and hemorrhagic frames. Thus, this study investigated the neuroprotective effects of physical exercise (8 weeks prior to injury) in an ischemic stroke modle (by bilateral occlusion of the common carotid arteries) and the neuroprotective effects of apocynin (after the injury - 2, 6 and 24 hours - at a dose 0.5 mg/kg) in a hemorrhagic stroke model (by collagenase infusion into the striatum) in Wistar rats. Open Field (OF), Rotarod (RR) and Neurologic Disabilities Scale (NDS) were used to evaluate the motor function of the animals. To the striatal redox balance evaluation we assessed the presence of ROS, TBARS (reactive species to thiobarbituric acid) and total antioxidant capacity (FRAP). Our results showed that physical exercise is a partially effective strategy to protect against ischemic stroke. However, apocynin was not an effective neuroprotective strategy in a experimental model of hemorrhagic stroke. These results show the possibility of using exercise as a neuroprotective strategy. The apocynin need to be better studied in cases of hemorrhagic stroke, whereas the investigation of its mechanism, dosages and times of administration.