Les isoformes de Tau font parties d’une famille de protéines associées aux microtubules, principalement exprimées dans les neurones du système nerveux central. Ils favorisent l'assemblage de monomères tubuline en microtubules et leurs stabilités, jouant un rôle structurel clé dans les axones neuronaux. Dans la maladie d’Alzheimer et autres tauopathies, la protéine Tau agrège sous forme d’enchevêtrements fibrillaires impliqués dans les lésions intraneuronales et gliales. A l’heure actuelle, le processus d’agrégation présent au sein des tauopathies n’est pas complètement élucidé malgré un grand nombre d’études effectués in vitro. L’essentiel du travail présenté dans ma thèse est basé sur un modèle d’étude in vitro utilisant une protéine Tau recombinante présentant la mutation P301L. Ce mutant ainsi que d’autres fragments de Tau ont été utilisés pour mieux comprendre le mécanisme d’agrégation, comme par exemple le rôle des cystéines, ou de la région riche en proline. Nous avons montré par des mesures de diffusion de la lumière et fluorescence de la Thioflavine S qu’il existe un système d’agrégation indépendant des ponts disulfures intermoléculaires. Nous avons également étudié la capacité anti agrégative de plusieurs polyphénols naturels et endogènes. Notre attention s’est en particulier portée sur trois dérivés phénoliques obtenus à partir d'huile d'olive : l'hydroxytyrosol, l'oleuropéine, l'oleuropéine aglycone. Ce dernier a été trouvé plus actif que l’inhibiteur de référence de Tau, le bleu de méthylène. Des résultats similaires ont été obtenu avec des molécules issues de la dimérisation du DOPAL. L’activité inhibitrice de la fibrillisation de ces molécules peut même atteindre des valeurs submicromolaires. / Tau isoforms are part of the microtubule-associated proteins family, mainly expressed in neurons of the central nervous system. They promote the assembly of tubulin monomers into microtubules and their stabilities, playing a key structural role in neuronal axons. In Alzheimer's disease and other tauopathies, the tau protein aggregates as fibrillar tangles involved in intraneuronal and glial lesions. At present, the process of aggregation present in the tauopathies is not fully understood despite a large number of studies performed in vitro. Most of the work presented in my thesis is based on an in vitro model study using recombinant tau protein with the P301L mutation. This mutant and other fragments of Tau were used to better understand the mechanism of aggregation, such as the role of the cysteines or the proline-rich region. We have shown by measurements of light scattering and fluorescence of Thioflavin S there is a system of aggregation independent of intermolecular disulfide bonds. We also studied the ability of several anti-aggregative natural polyphenols and endogenous. Our attention was particularly focused on three phenolic derivatives obtained from olive oil: hydroxytyrosol, oleuropein, oleuropein aglycone. The latter was found more active than the reference inhibitor of Tau, methylene blue. Similar results were obtained with molecules from DOPAL dimerization. The inhibitory activity of fibrillization of these molecules can reach submicromolar values.

Immunotherapy for Alzheimer\'s disease has emerged as a promising approach for clearing pathological tau protein conformers. To explore this kind of treatment we tested an active immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments in P301L tangle model mice that develop neuronal tau aggregates as observed in frontotemporal dementia and Alzheimer’s disease. We found that an immunization reduces neurodegeneration in α-motor neurons in the spinal cord and slows progression of the tangle-related behavioral phenotype. Performance on behavioral assays correlated with tau pathology at the corresponding spinal cord level. Interestingly, a slowed progression of these tauopathy related characteristics were only seen in mice that received a specific immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments, not in animals that received a non-specific activation of the immune system. An immunization witch pseudo-phosphorylated tau fragments may be a valuable therapeutic option in targeting one of the major hallmarks of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia.

Perineuronale Netze (PN) sind eine spezialisierte Form der neuronalen extrazellulären Matrix. Es wird vermutet, dass sie neuroprotektive Eigenschaften besitzen und die von ihnen umschlossenen Neurone gegenüber Degeneration schützen. Mehrere Studien untersuchten bereits die PN in Zusammenhang mit der Pathologie der Alzheimer-Erkrankung. Für die Frontotemporalen Demenzen, die nach der Alzheimer-Erkrankung und der vaskulären Demenz zu den häufigsten dementiellen Erkrankungen gehören, ist die Beziehung von PN und Tau-Protein (TP)-Pathologie noch nicht untersucht worden. Die Dissertation beschäftigt sich mit der Korrelation von netztragenden Neuronen mit TP-Pathologie in einem Mausmodel der Frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus des Chromosoms 17 (FTDP-17). Sie geht der Frage nach, ob netztragende Neuronen vor Degeneration und intrazellulären Ablagerungen von verändertem TP, in Form von Hyperphosphorylierungen (HP) und Neurofibrillären Tangles (NFT), geschützt sind. Mit Hilfe immunhistochemischer Fluoreszenzmarkierung und Western Blot wurden die Gehirne transgener Mäuse mit der P301L-Mutation des TP im Alter von drei und achteinhalb Monaten untersucht. Dabei wurden sechs Hirnregionen ausgewählt: Primärer Somatosensorischer Kortex (PSC), Entorhinaler Kortex (EC), Hippokampus (Hipp), Pars magnocellularis des Nucleus ruber (NR-m), Pars reticulata der Substantia nigra (SN-r) und Motorischer Trigeminuskern (Mo5). Die Untersuchungen zeigen, dass die PN bei der FTDP-17 die Neurone nicht explizit vor TP-Pathologie schützen. Jedoch kommt es zu keiner signifikanten Reduktion der netztragenden Zellen im Altersgang, sodass eine neuroprotektive Funktion der PN weiterhin vermutet werden kann.

Immunotherapy for Alzheimer\''s disease has emerged as a promising approach for clearing pathological tau protein conformers. To explore this kind of treatment we tested an active immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments in P301L tangle model mice that develop neuronal tau aggregates as observed in frontotemporal dementia and Alzheimer’s disease. We found that an immunization reduces neurodegeneration in α-motor neurons in the spinal cord and slows progression of the tangle-related behavioral phenotype. Performance on behavioral assays correlated with tau pathology at the corresponding spinal cord level. Interestingly, a slowed progression of these tauopathy related characteristics were only seen in mice that received a specific immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments, not in animals that received a non-specific activation of the immune system. An immunization witch pseudo-phosphorylated tau fragments may be a valuable therapeutic option in targeting one of the major hallmarks of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia.

Perineuronale Netze (PN) sind eine spezialisierte Form der neuronalen extrazellulären Matrix. Es wird vermutet, dass sie neuroprotektive Eigenschaften besitzen und die von ihnen umschlossenen Neurone gegenüber Degeneration schützen. Mehrere Studien untersuchten bereits die PN in Zusammenhang mit der Pathologie der Alzheimer-Erkrankung. Für die Frontotemporalen Demenzen, die nach der Alzheimer-Erkrankung und der vaskulären Demenz zu den häufigsten dementiellen Erkrankungen gehören, ist die Beziehung von PN und Tau-Protein (TP)-Pathologie noch nicht untersucht worden. Die Dissertation beschäftigt sich mit der Korrelation von netztragenden Neuronen mit TP-Pathologie in einem Mausmodel der Frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus des Chromosoms 17 (FTDP-17). Sie geht der Frage nach, ob netztragende Neuronen vor Degeneration und intrazellulären Ablagerungen von verändertem TP, in Form von Hyperphosphorylierungen (HP) und Neurofibrillären Tangles (NFT), geschützt sind. Mit Hilfe immunhistochemischer Fluoreszenzmarkierung und Western Blot wurden die Gehirne transgener Mäuse mit der P301L-Mutation des TP im Alter von drei und achteinhalb Monaten untersucht. Dabei wurden sechs Hirnregionen ausgewählt: Primärer Somatosensorischer Kortex (PSC), Entorhinaler Kortex (EC), Hippokampus (Hipp), Pars magnocellularis des Nucleus ruber (NR-m), Pars reticulata der Substantia nigra (SN-r) und Motorischer Trigeminuskern (Mo5). Die Untersuchungen zeigen, dass die PN bei der FTDP-17 die Neurone nicht explizit vor TP-Pathologie schützen. Jedoch kommt es zu keiner signifikanten Reduktion der netztragenden Zellen im Altersgang, sodass eine neuroprotektive Funktion der PN weiterhin vermutet werden kann.

Tau mutations promote the formation of tau oligomers and filaments, which are neuropathological signs of several tau-associated dementias. Types of neurons in the CNS are spared of tau pathology and are surrounded by a specialized form of extracellular matrix; called perineuronal nets (PNs). Aggrecan, the major PN proteoglycans, is suggested to mediate PNs neuroprotective function by forming an external shield preventing the internalization of misfolded tau. We recently demonstrated a correlation between aggrecan amount and the expression and phosphorylation of tau in a TauP310L-acan mouse model, generated by crossbreeding heterozygous aggrecan mice with a significant reduction of aggrecan and homozygous TauP301L mice. Neurodegenerative processes have been associated with changes of PN structure and protein signature. In this study, we hypothesized that the structure and protein expression of PNs in this TauP310L-acan mouse is regulated by tau. Immunohistochemical and biochemical analyses demonstrate that protein levels of PN components differ between TauP301LHET-acanWT and TauP301LHET-acanHET mice, accompanied by changes in the expression of protein phosphatase 2 A. In addition, tau can modulate PN components such as brevican. Co-immunoprecipitation experiments revealed a physical connection between PN components and tau. These data demonstrate a complex, mutual interrelation of tau and the proteoglycans of the PN.

Das Tau-Protein ist ein Mikrotubuli-assoziiertes-Protein, welches an der Stabilisierung der Mikrotubuli beteiligt ist (Weingarten et al. 1975; Drubin 1986). Bei bestimmten neurodegenerativen Erkrankungen, den Tauopathien, kommt es zur pathologischen Phosphorylierung und Aggregation des Tau-Proteins im Gehirn der Betroffenen (Spillantini et al. 1997). Zu den Tauopathien zählen zahlreiche Erkrankungen, unter anderem die Alzheimersche Demenz, die chronisch-traumatische Enzephalopathie sowie einige Untergruppen der Frontotemporalen Demenz. Dabei kommt es zur Ablagerung von hyperphosphoryliertem und amyloidogen aggregiertem Tau-Potein, welches sich in Form von Tau-Protein Filmanten zu den Neurofibrillären Tangles (NFTs) zusammenlagert (Gendron und Petrucelli 2009). In dieser Arbeit wurde die Frontotemporale Demenz, genauer gesagt die Frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus assoziiert mit Chromosom 17 (FTDP17) untersucht (Foster et al. 1997). Ursache der FTDP17 können unter anderem Mutationen im MAPT-Gen sein, welches das Tau-Protein kodiert (Boeve und Hutton 2008). Die hier untersuchte P301L-Mutation bewirkt den Austausch von Prolin gegen Leucin an der Aminosäureposition 301 [Ausgehend von der längsten Tau-Protein Isoform: 4R2N] in der Mikrotubuli-bindenden-Domäne des Tau-Proteins (Hutton et al. 1998; Spillantini et al. 1998). Hierdurch kommt es zu einer eingeschränkten Bindung des Tau-Proteins an die Mikrotubuli, was die Bildung und Ablagerung von NFTs im Gehirn der betroffenen Personen bedingt (Spillantini et al. 1998)(Spillantini et al. 1998). Ziel dieser Arbeit war es die Progression der Tau-Protein-Pathologie systematisch an einem P301L-Mausmodell zu untersuchen. Dafür wurden weibliche und männliche Mäuse zu 2 verschiedenen Alterszeitpunkten in 14 neuroanatomischen Gebieten untersucht. Folgende Hypothese wurde dazu aufgestellt: Hypothese 1: Bei weiblichen sowie bei älteren Mäusen (6-11 Monate) des P301L-Mausmodells kommt es zu einer stärkeren Ausprägung von pathologisch phosphoryliertem Tau-Protein und von Tau-Protein-Aggregaten. Zusätzlich wurden 3 mögliche Einflussfaktoren auf die Ausbreitung der Tau-Protein-Pathologie untersucht. Es wurde zunächst Aggrecan, ein Chondroitin-Sulfat-Proteoglykan und Bestandteil der Perineuronalen Netze, betrachtet (Yamaguchi 2000; Morawski et al. 2012a). Perineuronalen Netzen wird eine protektive Wirkung bei neurodegenerativen Erkrankungen zuteil (Morawski et al. 2010; Morawski et al. 2012b; Suttkus et al. 2016). Als weiterer Einflussfaktor wurde die AMP-related-Kinase 5 (ARK5) untersucht, welche zu den AMP aktivierten Protein-Kinasen zählt (Suzuki et al. 2003). Es handelt sich um eine Serin-Threonin-Kinase, welche an der pathologischen Phosphorylierung des Tau-Proteins beteiligt ist (Lasagna-Reeves et al. 2016). Als drittes wurde Gigaxonin, ein E3-Ubiquitin-Ligase-Adapter-Protein, betrachtet (Bomont et al. 2000). Gigaxonin ist am proteasomalen Abbau zahlreicher Intermediär- und Neurofilamente beteiligt und ist Bindungspartner anderer Mikrotubuli-assoziierten-Proteine (Bomont 2016; Ding et al. 2006; Ding et al. 2002). Hypothese 2: Perineuronale Netze wirken protektiv gegenüber der übermäßigen und der pathologischen Phosphorylierung des Tau-Proteins. Aggrecan dient als Marker der Perineuronalen Netze. Dementsprechend gibt es in Gebieten mit hoher Aggrecan Expression eine verminderte pathologische Phosphorylierung und Tau-Protein-Aggregation. Hypothese 3: Die AMP-related-Kinase 5 (ARK5) ist an der pathologischen Phosphorylierung des Tau-Proteins beteiligt. In Gebieten mit starker Expression der ARK5 kann auch eine übermäßige sowie pathologische Phosphorylierung des Tau-Proteins festgestellt werden. Hypothese 4: Gigaxonin ist als E3-Ubiquitin-Ligase-Adapter-Protein am proteasomalen Abbau des Tau-Proteins beteiligt und mit ihm ko-lokalisiert. Es wurden 2 Alterszeitpunkte (2 Monate und 6-11 Monate) in weiblichen und männlichen transgenen (hTauP301L +/+/ mTau-/-, tg) Mäusen betrachtet. Als Vergleichsgruppen wurden Wildtyp- (mTau+/+, wt) und Knockout- (mTau-/-, ko) Mäuse untersucht. Die Ausbreitung der Tau-Protein-Pathologie wurde systematisch in 14 neuroanatomischen Gebieten mittels Immunhistochemie erforscht. Es wurde die Menge an Gesamttau-Protein, phosphoryliertem und pathologisch phosphoryliertem Tau-Protein bestimmt. Zur Quantifizierung wurden Westernblots und ELISAs durchgeführt, wobei im ELISA zusätzlich die Menge an Tau-Protein-Aggregaten gemessen werden konnte. Die wichtigsten Ergebnisse der durchgeführten Versuche werden im Folgenden vorgestellt: Gesamttau-Protein: Für das Gesamttau-Protein ergab sich eine einheitliche Verteilung zwischen den verschiedenen transgenen Maustypen. Es gab keinen Unterschied im Gesamttau-Protein-Gehalt zwischen weiblichen und männlichen bzw. zwischen alten und jungen transgenen Mäusen. Im Westernblot wurde signifikant mehr Tau-Protein bei transgenen Mäusen im Gegensatz zu Wildtyp-Tieren detektiert (p<0,05). Im ELISA zeigte sich hingegen kein signifikanter Unterschied in der Expression des Gesamttau-Proteins bei transgenen (53,3 ng/ml) bzw. Wildtyp-Mäusen (47,4 ng/ml). Phosphoryliertes Tau-Protein: Es wurde in 6 der 14 untersuchten Gebiete signifikant mehr phosphoryliertes Tau-Protein bei transgenen weiblichen Mäusen im Vergleich zur gleichaltrigen männlichen Vergleichsgruppe gemessen. In ebenfalls 6 Gebieten wurde signifikant mehr phosphoryliertes Tau-Protein bei alten weiblichen Mäusen im Vergleich mit jungen weiblichen Mäusen gemessen. Generell wurden im Hippocampus fast keine Zellen dieses Phosphorylierungstyps detektiert (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 0,0 positive Zellen/ 0,1mm²), während der Hypothalamus (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 14,93 positive Zellen/ 0,1mm²) sowie der Nucleus Edinger Westphal (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 19,05 positive Zellen/ 0,1mm²) am stärksten betroffen waren. Pathologisch phosphoryliertes Tau-Protein: In 5 von 14 untersuchten Gebieten konnten bei transgenen weiblichen Mäusen signifikant mehr pathologisch phosphoryliertes Tau-Protein als bei ihrer gleichaltrigen männlichen Vergleichsgruppe gemessen werden. In 7 Gebieten hatten alte weibliche Mäuse signifikant mehr pathologisch phosphoryliertes Tau-Protein als ihre jüngere Vergleichsgruppe. Auch hier waren im Hippocampus fast keine Zellen welche diesen Phosphorylierungsstatus aufwiesen (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 0,0 positive Zellen/ 0,1mm²), während im Hypothalamus (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 11,2 positive Zellen/ 0,1mm²) und im Nucleus Edinger-Westphal (bei alten transgenen weiblichen Mäusen: 18,57 positive Zellen/ 0,1mm²) eine sehr starke Expression stattfand. Tau-Protein-Aggregate: Bei der Bestimmung der Tau-Protein-Aggregate hatten transgene Mäuse im Durchschnitt 13,2 ng/ml, Wildtyp Mäuse 2,4 ng/ml und Knockout Mäuse 0 ng/ml. Es konnte ein signifikanter Unterschied zwischen allen 3 Mausgruppen gemessen werden. Innerhalb der transgenen Mausgruppen hatten weibliche Mäuse signifikant mehr Tau-Protein-Aggregate (26,9 ng/ml) als ihre gleichaltrige männliche Vergleichsgruppe (1,7 ng/ml) (p<0,05). Tau-Protein modifizierende Enzyme und Proteine: Für keines der untersuchten Proteine bzw. Enzyme ließ sich eine Ko-Lokalisation mit pathologisch phosphoryliertem Tau-Protein nachweisen. Für Gigaxonin konnte jedoch im Westernblot ein signifikant höherer Wert bei transgenen Mäusen im Gegensatz zu Tau-Protein-Knockout-Mäusen gemessen werden. Mithilfe dieser Studie konnte gezeigt werden, dass ältere Mäuse des P301L-Mausmodells mehr phosphoryliertes und aggregiertes Tau-Protein exprimieren als junge Mäuse. Es wurde ebenso belegt, dass auch bei diesem P301L-Mausmodell weibliche Mäuse stärker betroffen sind als männliche Mäuse. In dieser Arbeit konnten eine Vielzahl von neuroanatomischen Gebieten mit signifikanten pathologischen Tau-Protein Phosphorylierungen und Aggregationen identifiziert werden, welche nun in weiterführenden Studien genauer untersucht werden können.  :1 Einleitung 1 1.1 Tau-Protein 1 1.1.1 Aufbau 1 1.1.2 Funktion 3 1.1.3 Tau-Protein modifizierende Enzyme und Proteine 4 1.1.4 Tauopathien 6 1.2 Frontotemporale Demenz 9 1.2.1 Epidemiologie, Symptome, Diagnostik und Therapie 9 1.2.2 Frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus assoziiert mit Chromosom 17 11 1.2.3 P301L-Mutation 11 1.3 Untersuchte neuroanatomische Gebiete 12 2 Aufgabenstellung 15 3 Materialien und Methoden 16 3.1 P301L-Mausmodell 17 3.2 Immunhistochemie 18 3.2.1 Gewebefixierung 20 3.2.2 Mikrotomschnitte 20 3.2.3 Avidin-Biotin-Komplexmethode 20 3.2.4 Auswertung am AxioScan.Z1 23 3.3 Westernblot 24 3.3.1 Gewebepräparation 26 3.3.2 Gelelektrophorese 26 3.3.3 Proteintransfer 27 3.3.4 Proteindetektion 27 3.3.5 Bestimmung der Proteingesamtmenge 29 3.3.6 Auswertung 29 3.4 ELISA 30 3.4.1 Gewebepräparation 30 3.4.2 ELISA 30 3.4.3 Auswertung 33 3.5 Statistische Methoden 33 4 Ergebnisse 34 4.1 Immunhistochemie 34 4.1.1 Tau-Protein 34 IV 4.1.2 Tau-Protein modifizierende Enzyme und Proteine 43 4.2 Westernblot 44 4.2.1 Tau-Protein 44 4.2.2 Gigaxonin 45 4.3 ELISA 46 4.3.1 Gesamttau-Protein 47 4.3.2 Aggregiertes Tau-Protein 47 5 Diskussion 50 5.1 Diskussion der Methoden 50 5.1.1 Diskussion des P301L-Mausmodells 50 5.1.2 Diskussion der Immunhistochemie 51 5.1.3 Diskussion des Westernblots 52 5.1.4 Diskussion des ELISAs 53 5.2 Diskussion der Tau-Protein-Expression 54 5.2.1 Diskussion der Tau-Protein-Antikörper 54 5.2.2 Regionale und Altersabhängige Expression des Tau-Proteins 56 5.2.3 Geschlechtsabhängige Expression des Tau-Proteins 59 5.3 Diskussion der Tau-Protein modifizierenden Enzyme und Proteine 61 5.3.1 Aggrecan 61 5.3.2 ARK5 62 5.3.3 Gigaxonin 63 5.4 Limitationen und Ausblick 63 6 Zusammenfassung 65 7 Literaturverzeichnis 69 8 Anlagen 78 8.1 Auswertung der Immunhistochemie 78 8.2 Auswertung der Westernblots 88 8.2.1 Tau-Protein Westernblots 88 8.2.2 Gigaxonin-Westernblot 91 8.3 Auswertung der ELISAs 92 8.3.1 Gesamttau-Protein 92 8.3.2 Tau-Protein-Aggregate 93 9 Selbstständigkeitserklärung 96 10 Danksagung 97